化學(xué)修飾提高核酸適體結(jié)合親和力的研究進(jìn)展

劉 珂，靳 宇，梁建功，吳 園

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院,武漢430070）

核酸適體是指通過指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（SELEX）篩選得到的一段單鏈DNA（ssDNA）或RNA（ssRNA）寡核苷酸，長度通常為10~100個(gè)堿基，通過形成特定的二級或三級結(jié)構(gòu)可以高親和性、高特異性地與靶標(biāo)結(jié)合［1，2］.這種特定結(jié)構(gòu)是由核酸適體與其靶標(biāo)之間的分子形狀互補(bǔ)性以及核酸適體-靶標(biāo)分子間相互作用折疊而成的，如形成環(huán)、凸起、發(fā)夾和假結(jié)等［3］.核酸適體-靶標(biāo)分子間的相互作用力包括氫鍵、靜電、堿基對堆積作用、偶極-偶極相互作用、疏水相互作用和π-π堆積等協(xié)同作用［4，5］.

SELEX技術(shù)由2個(gè)獨(dú)立的研究小組于1990年首次報(bào)道，至今經(jīng)歷了很多變化和改進(jìn)［1，2］.傳統(tǒng)SELEX技術(shù)的操作步驟如圖1所示：（1）人工設(shè)計(jì)并化學(xué)合成庫容量為1015~1018的隨機(jī)寡核苷酸文庫；（2）在特定的緩沖溶液和適宜的溫度下，將文庫與靶標(biāo)一起孵育，形成靶標(biāo)-核酸適體復(fù)合物；（3）通過特定的方法分離已結(jié)合及未結(jié)合靶標(biāo)的核酸序列；（4）分離出來的與靶標(biāo)特異性結(jié)合的核酸序列通過聚合酶鏈擴(kuò)增反應(yīng)（PCR）富集，生成次級文庫；（5）引入負(fù)篩，以除去與靶標(biāo)非特異性結(jié)合的核酸序列.重復(fù)（2）~（4）操作.通過反復(fù)篩選，得到潛在的核酸適體進(jìn)行測序，并進(jìn)行分子結(jié)構(gòu)、識別位點(diǎn)和靶標(biāo)結(jié)合動力學(xué)分析，選取與靶標(biāo)特異性強(qiáng)、親和力高的核酸適體用于后續(xù)研究工作.

核酸適體與靶標(biāo)之間優(yōu)異的親和識別作用使核酸適體在構(gòu)建生物傳感器、鑒定生物醫(yī)學(xué)腫瘤標(biāo)志物、藥物開發(fā)及疾病診斷和治療等領(lǐng)域中展現(xiàn)出重要的應(yīng)用價(jià)值.因此，研究者開發(fā)出基于核酸適體連接的固定化吸附測定（ALISA）和基于核酸適體的側(cè)向流式免疫檢測方法［6，7］；也有大量基于核酸適體的電化學(xué)、比色或熒光等檢測方法的研究報(bào)道，如檢測氧氟沙星抗生素［8］和腺苷二磷酸［9］；此外，修飾有合適藥物分子（熒光染料、放射性標(biāo)記和藥物小分子等）的核酸適體已用于腫瘤組織的造影、生物學(xué)過程的監(jiān)測及疾病的早期精準(zhǔn)診斷和靶向治療［10，11］.近年來，研究者以不同的角度和重點(diǎn)發(fā)表了大量的核酸適體綜述評論，如Banerjee等［12，13］介紹了核酸適體在治療、藥物遞送和成像方面的進(jìn)展；Li等［14］對分子診斷和治療的核酸適體的研究進(jìn)展和展望進(jìn)行了評述；Madder等［15］和Yuan等［16］綜述了化學(xué)修飾核酸適體在提高診斷和檢測應(yīng)用中的現(xiàn)狀和展望.

核酸適體又被稱為“化學(xué)家的抗體”［17］，相對抗體而言具備較多優(yōu)勢：（1）產(chǎn)生抗體的有效方法必須依賴于用免疫原性分析物對動物的免疫.而分子量小的分析物通常不具有免疫原性，因此，很難產(chǎn)生合適的抗體［18，19］.而核酸適體不受分子量大小的限制，可以針對各種分析物篩選出合適的核酸適體，例如離子、小分子、蛋白質(zhì)、病毒、細(xì)菌、細(xì)胞甚至神經(jīng)組織［20~25］.（2）核酸適體具有更高的物理和溫度穩(wěn)定性，可作為更強(qiáng)大的分析工具［26~28］.即使在變性后，基于堿基配對的可逆性和可預(yù)測性，核酸適體也能夠重新折疊，恢復(fù)特性，從而延長其保存期限.相反，抗體在偏離生理?xiàng)l件下是不穩(wěn)定的，并且變性后難以重新折疊［29］.（3）多克隆抗體存在較明顯的批次間差異.這與核酸適體的生產(chǎn)反差明顯，核酸適體可通過固相化學(xué)合成得到，因此能提供恒定的質(zhì)量，更具生產(chǎn)成本效益.（4）核酸適體相對于抗體的主要優(yōu)點(diǎn)是易進(jìn)行選擇性化學(xué)修飾.抗體在實(shí)際應(yīng)用中經(jīng)常需要修飾，如抗體-藥物偶聯(lián)物、免疫傳感器標(biāo)記抗體等.但是，抗體的位點(diǎn)選擇性標(biāo)記特別困難，并且僅限于少數(shù)可能的化學(xué)反應(yīng).此外，抗體的修飾控制不當(dāng)會使構(gòu)象發(fā)生變化，導(dǎo)致喪失結(jié)合親和力［30］.而核酸適體是化學(xué)合成的，選擇性地對其進(jìn)行化學(xué)修飾相對容易.因此，在實(shí)際應(yīng)用中，尤其是鑒于抗體的許多缺點(diǎn)，核酸適體被視為最有希望的抗體替代品.

核酸適體也有缺點(diǎn)，比如它與靶標(biāo)的結(jié)合親和力多不如抗體.原因之一是，天然抗體可由20種不同氨基酸組合而成，而核酸適體的寡核苷酸鏈?zhǔn)怯上汆堰剩ˋdenine，A）、鳥嘌呤（Guanine，G）、胞嘧啶（Cytosine，C）、胸腺嘧啶（Thymine，T）或尿嘧啶（Uracil，U）4個(gè)不同核苷酸連接而成［31，32］，限制了其化學(xué)多樣性，這可能會影響核酸適體的全部應(yīng)用潛力.由于此限制，圍繞核酸適體的研究大多是用少數(shù)的高親和力適體（“明星適體”）進(jìn)行檢測、診斷或靶向治療應(yīng)用.很多耗時(shí)耗力篩選出來的核酸適體得不到廣泛應(yīng)用研究，不利于核酸適體的推廣發(fā)展.因此，許多研究者通過化學(xué)修飾核酸適體，擴(kuò)展核酸適體的結(jié)構(gòu)多樣性，以提高核酸適體與靶標(biāo)的結(jié)合親和力［33~35］.原因之二是，核酸適體是單鏈核酸結(jié)構(gòu)，富含負(fù)電荷，其柔性結(jié)構(gòu)會受到環(huán)境pH值、金屬離子、鹽離子濃度、其它生物分子和溫度的影響［36~38］，導(dǎo)致核酸適體的ssDNA/ssRNA柔性分子骨架結(jié)構(gòu)會發(fā)生微調(diào).結(jié)構(gòu)決定功能，核酸適體柔性結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性導(dǎo)致核酸適體在復(fù)雜環(huán)境中的實(shí)驗(yàn)可重復(fù)性差，甚至失去結(jié)合親和力.這是因?yàn)槔碚撋虾怂徇m體在展開狀態(tài)（Ⅰ）和折疊狀態(tài)（Ⅱ）之間存在平衡，具有相應(yīng)的平衡常數(shù)（圖2）.引入靶標(biāo)后，折疊狀態(tài)（Ⅱ）會形成核酸適體-靶標(biāo)結(jié)合狀態(tài)（Ⅲ），兩者之間存在平衡解離常數(shù)（Dissociation constant，Kd）.核酸適體由展開狀態(tài)到折疊狀態(tài)的形成實(shí)際上是核酸適體從無序的多變構(gòu)型向有序的固定構(gòu)型轉(zhuǎn)變的過程，而如前所述，核酸適體的構(gòu)型以及結(jié)合能力會受到多種因素的影響，并非所有的核酸適體構(gòu)型都能高特異性、高親和性結(jié)合靶標(biāo)，因此，提高核酸適體與靶標(biāo)親和力的另一條思路是引入合適的化學(xué)修飾改造，將核酸適體穩(wěn)定在其折疊狀態(tài)（Ⅱ），從而提高核酸適體與靶標(biāo)的親和力.

Fig.1 Schematic illustration of conventional SELEX process for the selection of aptamers

Fig.2 Equilibrium among the unfounded aptamer(Ⅰ),folded state(Ⅱ)and target bound state(Ⅲ)

本文概述了化學(xué)修飾提高核酸適體與靶標(biāo)親和力的方法（圖3）.首先，簡要介紹了用于核酸適體篩選的常規(guī)SELEX技術(shù)；其次，詳細(xì)討論了SELEX篩選前（Pre-SELEX）和篩選后（Post-SELEX）對核酸適體進(jìn)行化學(xué)修飾以提高親和力的各種策略；最后，探討了核酸適體臨床應(yīng)用所面臨的一些挑戰(zhàn)，并對核酸適體的未來進(jìn)行了展望.

Fig.3 Flow diagram illustrating the aptamer modifications discussed in this review

1 Pre-SELEX化學(xué)修飾

傳統(tǒng)的篩選核酸適體文庫會受到A-T/U和G-C配對的限制，使得篩選得到的核酸適體形成的空間折疊結(jié)構(gòu)多樣性有限.為了提高核酸適體篩選的成功概率和實(shí)用性，科研工作者已針對不同目的設(shè)計(jì)了多種不同的非天然堿基對［39］，并且對PCR擴(kuò)增和測序技術(shù)中使用的聚合酶的高保真進(jìn)行了優(yōu)化［40］.通過非天然堿基定制具有功能性和可塑性的擴(kuò)展人工堿基文庫，可有效提高文庫的化學(xué)多樣性，從而提高核酸適體與靶標(biāo)之間的親和力.另一方面，近年來許多科學(xué)家致力于通過化學(xué)合成方法，對天然核苷酸的核苷酸構(gòu)件部分（堿基、五碳糖或磷酸）進(jìn)行化學(xué)修飾，豐富篩選文庫中的堿基種類，擴(kuò)展核酸適體與靶標(biāo)之間的結(jié)合作用，也可提高核酸適體與靶標(biāo)的結(jié)合親和力［41，42］.

1.1 利用擴(kuò)展的人工堿基以豐富篩選文庫

基于4個(gè)天然遺傳字母的沃森-克里克（Watson-Crick）堿基配對是世界上所有活生物體中心法則的關(guān)鍵原則，A-T（U）和G-C的獨(dú)特互補(bǔ)性使得活生物體可以通過聚合酶反應(yīng)進(jìn)行DNA復(fù)制和RNA轉(zhuǎn)錄，并通過核糖體反應(yīng)中的密碼子-反密碼子相互作用翻譯為蛋白質(zhì).傳統(tǒng)的SELEX技術(shù)始終依賴于基于4個(gè)遺傳字母的堿基配對原則，從文庫的構(gòu)建到對每一輪篩選得到的次級文庫進(jìn)行PCR擴(kuò)增，4個(gè)遺傳字母數(shù)目限制了該技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展.因此，增加遺傳字母的數(shù)量可以增加核酸的信息密度和容量，通過創(chuàng)建第三堿基對來遺傳擴(kuò)展字母的數(shù)量是科學(xué)研究的趨勢.早在1962年，Alexander Rich［43］首先提出了擴(kuò)展遺傳字母的最初概念，然而并沒有合成出能成功應(yīng)用于各種生物技術(shù)的遺傳擴(kuò)展字母.直到1989年，Benner等［44，45］合成出一種新的Watson-Crick堿基對，其氫鍵鍵合配對模式在一定程度上類似于A-T和G-C堿基對，可以通過DNA和RNA聚合酶摻入到DNA或RNA序列中，成功將遺傳字母從4個(gè)擴(kuò)展到6個(gè).

然而，直到21世紀(jì)，科學(xué)界才廣泛認(rèn)識到擴(kuò)展的遺傳字母在核酸適體篩選領(lǐng)域具有擴(kuò)展核酸適體功能的潛力.最關(guān)鍵的貢獻(xiàn)是Hirao課題組［46］于2013年首次開發(fā)了一種新的SELEX方法（ExSELEX，genetic alphabet Expansion for SELEX），將高度疏水的7-（2-噻吩基）咪唑并-［4，5-b］-吡啶人工堿基［7-（2-thienyl）imidazo［4，5-b］pyridine，Ds］作為第5個(gè)堿基引入ssDNA核酸適體篩選的文庫中.如圖4所示，作者在隨機(jī)序列文庫中插入3個(gè)Ds疏水人工堿基，以加強(qiáng)適體與靶蛋白疏水腔的相互作用.此外，Ds堿基在DNA復(fù)制過程中僅與二醇修飾的2-硝基-4-丙炔基吡咯（2-nitro-4-propynylpyrrole，Px）配對，有望增加ssDNA核酸適體分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)多樣性.Ds與Px堿基對之間的配對是通過形狀互補(bǔ)性介導(dǎo)的［圖4（A）］，Ds的噻吩基團(tuán)可阻止其本身與天然堿基的相互作用，Px的硝基與腺嘌呤的氮原子之間存在靜電排斥作用而避免了與天然腺嘌呤發(fā)生潛在的相互作用.同時(shí)，Px引入的丙炔基增加了該人工堿基的疏水性，提高了在PCR過程中人工堿基對聚合酶的親和力.在篩選過程中作者沒有在文庫中加入與Ds配對的Px人工堿基，使得Ds堿基在最終篩選得到的核酸適體序列中保持未配對狀態(tài)，不會處于核酸適體的莖部區(qū)域，增大了核酸適體與目標(biāo)蛋白的疏水腔發(fā)生相互作用的概率，從而提高核酸適體與靶蛋白的結(jié)合親和力.作者針對人類血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子-165（VEGF-165）和干擾素-g（IFN-g）2種靶蛋白篩選得到的ssDNA適體的Kd值分別為0.65 pmol/L和38 pmol/L，經(jīng)測序得知這些ssDNA核酸適體均含有2個(gè)或3個(gè)Ds堿基，與僅包含天然堿基的原核酸適體相比，它們與靶標(biāo)的結(jié)合親和力均提高100倍以上，經(jīng)驗(yàn)證序列中含有2個(gè)Ds堿基對它們親和力的提高是必不可少的.

上述工作是在篩選文庫中添加1個(gè)人工擴(kuò)展堿基，理論上，在文庫中添加2個(gè)人工擴(kuò)展堿基會更大程度地?cái)U(kuò)展篩選系統(tǒng)的“序列空間多樣性”.但是，如果添加的人工擴(kuò)展堿基對與天然規(guī)范的Watson-Crick配對幾何結(jié)構(gòu)相差太大，標(biāo)準(zhǔn)聚合酶將很難識別并進(jìn)行擴(kuò)增，在PCR擴(kuò)增和深度測序過程中存在丟失真實(shí)信息的可能性.如上述Hirao小組［46］提出的ExSELEX技術(shù)最大的問題是經(jīng)過數(shù)輪篩選后測序過程中如何確定富集文庫每個(gè)ssDNA中Ds堿基的位置，因?yàn)槌Ｒ?guī)深度測序方法不能直接用于含有Ds堿基的ssDNA測序，作者配套開發(fā)出了2種測序方法，導(dǎo)致工作難度和強(qiáng)度都非常大.同時(shí)，Ds與Px的配對缺乏堿基間的氫鍵作用力，僅通過空間互補(bǔ)性配對，偏離了Watson-Crick配對概念，這不利于篩選的ssDNA核酸適體中相鄰或附近的人工擴(kuò)展堿基形成空間折疊結(jié)構(gòu).

與高度疏水的Ds人工堿基相反，Benner課題組［47，48］合成了新的基于氫鍵配對的堿基對P（6‐amino‐5‐nitropyridin‐2‐one）和Z（2‐amino‐8H‐imidazo［1，2‐a］［1，3，5］triazin‐4‐one），它們的理化性質(zhì)與天然堿基對部分相似.不同之處如圖5所示，Z堿基中有額外的硝基基團(tuán)以及P堿基中具有芳香結(jié)構(gòu)的電子密度結(jié)構(gòu)，使得含有多個(gè)P-Z堿基對的DNA雙鏈具有A型和B型2種雙螺旋結(jié)構(gòu)，并且P-Z堿基對表現(xiàn)出比G-C堿基對更高的穩(wěn)定性［49］.基于此，Benner等［50~53］針對類似Watson-Crick配對的P-Z堿基對在擴(kuò)展DNA功能方面做了大量研究.

Fig.5 Molecular and crystal structures of A,T,G,C,Z[47]

Fig.6 Schematic of the AEGIS Cell?SELEX[55]

為篩選出識別細(xì)胞膜蛋白的核酸適體，Tan等［54］率先提出了基于完整活細(xì)胞的Cell-SELEX技術(shù).Benner和Tan等［47，55~57］通過使用完全隨機(jī)的的六字母GACTZP-ssDNA文庫啟動了ssDNA核酸適體的篩選工作，于2014年首次開發(fā)出另一種新的基于人工擴(kuò)展遺傳信息系統(tǒng)（Artificially expanded genetic information systems，AEGISs）的Cell-SELEX技術(shù)（AEGIS Cell-SELEX）（圖6），篩選出靶向人三陰性乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231的ssDNA核酸適體，命名為ZAP-2012.該核酸適體序列中包含Z和P堿基各1個(gè)，且Z和P堿基對結(jié)合親和力很重要，核酸適體序列中的Z或P堿基被隨機(jī)替換，得到的ssDNA核酸適體對MDA-MB-231細(xì)胞系的親和性能下降.通過流式細(xì)胞儀測得ZAP-2012核酸適體對MDA-MB-231細(xì)胞的親和力Kd值為30 nmol/L，比傳統(tǒng)ssDNA文庫篩選得到的靶向MDA-MB-231細(xì)胞核酸適體的親和力提高了10倍，且該工作中篩選輪數(shù)為12輪，比傳統(tǒng)ssDNA文庫針對活細(xì)胞篩選獲得納摩爾級別的ssDNA核酸適體輪數(shù)（通常為15~20輪）減少，提高了篩選效率.該工作值得進(jìn)一步探索的是篩選得到的ZAP-2012核酸適體的特異性，因?yàn)樵诤Y選過程中作者沒有引入尚未永生化的人正常乳腺細(xì)胞作為對照.

2015年，Benner課題組［48］發(fā)現(xiàn)Z和P堿基對是通過標(biāo)準(zhǔn)的Watson-Crick幾何結(jié)構(gòu)進(jìn)行配對的，且配對形成的結(jié)構(gòu)很“自然”，與天然核苷酸形成的雙螺旋結(jié)構(gòu)兼容.在此發(fā)現(xiàn)基礎(chǔ)上，Benner和Tan等［47］繼續(xù)在AEGIS Cell-SELEX技術(shù)［55］基礎(chǔ)上提出了新的通過聚合酶進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室體外進(jìn)化技術(shù)（LaboratoryIn VitroEvolution，LIVE），稱為AEGIS cell-LIVE（圖7），進(jìn)一步探索由GACTZP-ssDNA文庫通過實(shí)驗(yàn)室體外進(jìn)化技術(shù)產(chǎn)生更大序列空間的核酸適體.在該工作中，作者針對人肝癌細(xì)胞株HepG2進(jìn)行了ssDNA核酸適體的篩選，同時(shí)在篩選過程中引入了負(fù)細(xì)胞Hu1545V以提高核酸適體的特異性.Hu1545V細(xì)胞是通過慢病毒轉(zhuǎn)染人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶hTERT基因的永生化正常人原代肝細(xì)胞，不但延長了其壽命，而且該細(xì)胞與肝癌HepG2細(xì)胞相比仍保持了正常肝細(xì)胞的膜蛋白組.經(jīng)過13輪篩選，成功篩選出靶向肝癌HepG2細(xì)胞的含有Z/P人工堿基的核酸適體，其Kd值低至14 nmol/L.作者進(jìn)一步證實(shí)當(dāng)核酸適體中的Z或P堿基被C或G堿基取代后，核酸適體的親和性能下降.這些數(shù)據(jù)為人工擴(kuò)展的遺傳信息系統(tǒng)可在更大空間內(nèi)擴(kuò)展核酸序列的功能提供了直接證據(jù).更重要的是，該工作中介紹的LIVE技術(shù)不同于經(jīng)典的SELEX技術(shù)，后者通常只能篩選得到初始文庫中預(yù)先存在的序列.在基于GACTZP系統(tǒng)的AEGIS cell-LIVE中，Z和P堿基存在緩慢增減的可能性，而且損失率略大于增益率［58］.與2014年Sefah等［55］報(bào)道的篩選步驟相比，該工作中使用的GACTZP文庫中含有更多的Z和P堿基，增加了人工堿基的信息密度，而且Z堿基含有的硝基是一種通用的弱黏合劑，增加Z堿基的個(gè)數(shù)在一定程度上可提高聚合酶對Z和P堿基的保真度.這也表明，雖然Z和P堿基在PCR過程中可能不受歡迎，但Z和P在被選擇過程中由于本身的結(jié)構(gòu)優(yōu)勢依然可以保留下來，GACTZP構(gòu)建的文庫是更豐富的結(jié)合分子庫.

Fig.7 Schematic of the AEGIS cell?LIVE with both positive and counter selections[47]

上述Sefah等［55］和Zhang等［47］利用AEGISs系統(tǒng)對ssDNA核酸適體的篩選工作均是針對活的癌細(xì)胞進(jìn)行的，Zhang等［56］應(yīng)用該系統(tǒng)進(jìn)一步擴(kuò)展對細(xì)胞表面特定高表達(dá)蛋白進(jìn)行了篩選工作.據(jù)報(bào)道，磷脂酰肌醇蛋白聚糖（Glypican 3，GPC3）可能是診斷一種高死亡率的原發(fā)性肝癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）的生物標(biāo)志物［59］，在大多數(shù)HCC中表達(dá)上調(diào)，在原代正常肝細(xì)胞、肝硬化細(xì)胞和肝良性病變細(xì)胞中均不表達(dá)［60］.因此，AEGIS系統(tǒng)篩選得到的ssDNA核酸適體具有臨床診斷功能.作者選擇GPC3作為靶標(biāo)蛋白，通過重組細(xì)胞技術(shù)，在細(xì)胞表面大量表達(dá)GPC3蛋白.但是，如果選擇天然表達(dá)GPC3的細(xì)胞可能會產(chǎn)生與該細(xì)胞表面其它蛋白（也可能包括GPC3蛋白）結(jié)合的核酸適體，同時(shí)很難選擇反篩細(xì)胞.因此，作者選用不表達(dá)GPC3的小鼠肝上皮細(xì)胞系（BNL 1ME A.7R.1，1MEA）作為反篩細(xì)胞，用攜帶人GPC3（human GPC3，hGPC3）基因的質(zhì)粒對1MEA細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，獲得了高表達(dá)hGPC3蛋白的1MEA細(xì)胞（1MEAhGPC3）作為靶細(xì)胞進(jìn)行AEGIS cell-LIVE篩選.作者構(gòu)建的AEGIS-ssDNA文庫中T∶G∶A∶C∶Z∶P的摩爾比為1∶1∶1∶1∶2∶2，最后篩選得到的包含Z和P堿基的ssDNA核酸適體的Kd值低達(dá)6 nmol/L.同樣，當(dāng)將Z或P（或兩者）替換為天然核苷酸時(shí)，該核酸適體的親和力會降低或直接丟失.

人工擴(kuò)展的核酸文庫還可以同時(shí)引入幾種不同的人工堿基.Yuan等［61］開發(fā)了同時(shí)具有二茂鐵堿基、三氟甲基堿基（F堿基）和Z/P堿基對的人工擴(kuò)展核苷酸文庫.如圖8所示，其中二茂鐵堿基中的三價(jià)鐵離子可以與蛋白質(zhì)的金屬結(jié)合位點(diǎn)協(xié)調(diào)作用［62，63］；F堿基中的氟可以通過形成鹵素鍵或陰離子抑制蛋白質(zhì)活性［64］；引入Z-P人工堿基對，以在互補(bǔ)作用中提供更豐富的空間構(gòu)象［57］；此外，Z堿基中的硝基部分可以充當(dāng)“通用弱結(jié)合劑”，以增強(qiáng)核酸適體和蛋白質(zhì)之間的相互作用.作者整合3種類型的人工擴(kuò)展核苷酸文庫篩選得到的可靶向識別三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231細(xì)胞的核酸適體的Kd值為48.5 nmol/L，識別靶標(biāo)為細(xì)胞膜表面的整合蛋白α3（ITGA3），且該核酸適體可減少ITGA3與配體的結(jié)合，從而抑制腫瘤細(xì)胞的黏附和遷移.這種化學(xué)修飾輔助的體外篩選方法利用“以生物學(xué)功能為導(dǎo)向的篩選”為指導(dǎo)原則，能夠在尋求具有生物活性核酸適體的過程中，利用進(jìn)化的力量促進(jìn)化學(xué)生物學(xué)研究和藥物發(fā)現(xiàn).

Fig.8 Schematic of the molecular design of aptamers as modulators of protein activity[61]

綜上所述，構(gòu)建人工擴(kuò)展的堿基文庫可顯著提高核酸適體與靶標(biāo)的結(jié)合親和力.但是，基于人工堿基的SELEX技術(shù)的成功依賴于各種成熟的技術(shù)更新.首先是固相化學(xué)合成人工堿基文庫的能力；其次，具備用于PCR擴(kuò)增GACTX（X為人工堿基）構(gòu)成的DNA序列高效聚合酶，要求在擴(kuò)增過程中人工堿基丟失的可能性極低；最后，深度測序技術(shù)，要求能客觀準(zhǔn)確地測出GACTX堿基構(gòu)成的核酸適體小文庫中的人工堿基.這三者缺一不可，才能使擴(kuò)展AEGIS-SELEX的功能和實(shí)用性邁出下一步.也正是因?yàn)檫@些條件的限制，即使目前研究出來的人工堿基種類豐富，但是真正能應(yīng)用到篩選核酸適體的屈指可數(shù).

1.2 化學(xué)修飾天然堿基以豐富文庫的多樣性

基于上述討論的在文庫中引入人工堿基的限制條件，研究人員開發(fā)的另外一種豐富文庫化學(xué)多樣性的策略是通過固相合成方法對現(xiàn)有的核苷酸構(gòu)件進(jìn)行化學(xué)修飾.根據(jù)靶標(biāo)的結(jié)構(gòu)特征來定制核酸適體的化學(xué)修飾，運(yùn)用成熟的化學(xué)方法在天然核苷酸構(gòu)件中引入各種性能的官能團(tuán)［65］，如疏水性、親水性或帶電性，其中許多結(jié)構(gòu)單元已經(jīng)商業(yè)化.最具代表性的示例為Mayer等［66］建立的一種簡單通用的方法——click-SELEX.該方法首次通過炔-疊氮化物點(diǎn)擊反應(yīng)（Click chemistry）在PCR擴(kuò)增次級文庫后原位重新引入化學(xué)修飾的天然堿基，構(gòu)建修飾后的核酸文庫用于下一輪篩選.如圖9所示，首先用炔基修飾的T堿基單體替代天然T堿基單體構(gòu)建文庫，通過點(diǎn)擊反應(yīng)進(jìn)一步修飾疊氮化的吲哚化合物，由此獲得吲哚修飾的ssDNA文庫.經(jīng)過一輪體外篩選后，對炔基修飾的核酸文庫進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將產(chǎn)物再次修飾疊氮化的吲哚，為下一輪篩選重建起始文庫.經(jīng)過數(shù)輪篩選和擴(kuò)增后，通過click-SELEX策略篩選出針對綠色熒光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）具有高親和力的吲哚修飾的核酸適體，Kd值低至18.4 nmol/L，而且其結(jié)合依賴于吲哚的存在，表明該化學(xué)修飾方法不僅可提高核酸適體與靶標(biāo)的結(jié)合親和力，還可以提高篩選針對困難靶標(biāo)的核酸適體成功性.這種click-SELEX方法在每一輪PCR擴(kuò)增后通過簡便易操作的點(diǎn)擊反應(yīng)，重新在文庫中引入新的功能基團(tuán)，實(shí)用性廣泛，且不限于單一品種基團(tuán)的修飾.

另外，直接對天然堿基單體進(jìn)行化學(xué)修飾也可以提高所篩選核酸適體與靶標(biāo)的結(jié)合親和力［67］.Janjic等［68］構(gòu)建了雙修飾堿基單體構(gòu)成的較短隨機(jī)序列文庫用于核酸適體的篩選.作者通過對文庫中的胞嘧啶和胸腺嘧啶雙堿基修飾類氨基酸側(cè)鏈，選用蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草桿菌蛋白酶作為目標(biāo)蛋白質(zhì)成功篩選出核酸適體.與單一堿基化學(xué)修飾的文庫或者傳統(tǒng)文庫相比，雙堿基化學(xué)修飾構(gòu)建的文庫所篩選出來的核酸適體的親和力、篩選效率、穩(wěn)定性和功能性得到顯著提高，在診斷和治療研究中具有廣泛的用途［69］.

需要注意的是，并不是任意化學(xué)修飾后的核苷酸都可以用于SELEX文庫的構(gòu)建，重要的先決條件是修飾后的核苷酸必須與SELEX過程中使用的聚合酶兼容.通過對聚合酶結(jié)構(gòu)的深入研究發(fā)現(xiàn)，文庫中采用的化學(xué)修飾核苷酸必須保留聚合酶活性位點(diǎn)，以便被聚合酶識別和摻入［70］.近年來，研究人員已經(jīng)開發(fā)出了不同聚合酶變異體［71，72］，這些變異體可以識別并摻入到非天然核苷酸結(jié)構(gòu)中，與天然聚合酶相比，它們能夠以更高的效率摻入到修飾后的核苷酸中，但是效率和保真率依然需要進(jìn)一步探索［73］.

Fig.9 CuAAC functionalization of EdU?containing DNA molecules with azides(A),schematic representation of the library design(B)and schematic representation of the Click?SELEX process(C)[66]

1.3 機(jī)器學(xué)習(xí)輔助構(gòu)建文庫

近年來，數(shù)據(jù)挖掘和機(jī)器學(xué)習(xí)等手段越來越多地被引入到化學(xué)領(lǐng)域中，輔助解釋“隱藏”在數(shù)據(jù)背面的內(nèi)在聯(lián)系或機(jī)制［74~76］.單鏈核酸適體通常是從大型序列文庫中篩選得到，但文庫中核酸適體候選物的容量及合成它們的化學(xué)方法限制了所有篩選方法的實(shí)際潛能.因?yàn)閷?shí)際DNA固相合成技術(shù)、PCR擴(kuò)增技術(shù)和高通量測序技術(shù)的局限性使得文庫的庫容量通常限制在1015~1018條［77］，導(dǎo)致這些核酸文庫實(shí)際上只限于理論序列空間的小部分，甚至高質(zhì)量的核酸適體序列在文庫中可能很少見［78］.因此，研究者開始關(guān)注機(jī)器學(xué)習(xí)輔助構(gòu)建文庫，使用計(jì)算機(jī)強(qiáng)大的搜索功能可以更有效地搜索文庫空間，對序列進(jìn)行前期評估，可以顯著提高文庫的智能性，減少低質(zhì)量的序列數(shù)量，擴(kuò)展文庫的有效空間，以篩選更高性能的核酸適體［79］.如Chushak和Stone等［80］使用計(jì)算機(jī)對接預(yù)測文庫中的核酸序列的二級結(jié)構(gòu)，以達(dá)到過濾起始文庫的目的.

本文重點(diǎn)關(guān)注近期Google研究團(tuán)隊(duì)［81］報(bào)道的機(jī)器學(xué)習(xí)指導(dǎo)核酸適體的發(fā)現(xiàn)和改造工作，該團(tuán)隊(duì)開發(fā)并驗(yàn)證了機(jī)器學(xué)習(xí)（Machine Learning，ML）指導(dǎo)的粒子展示方法（ML-guided Particle Display methodology，MLPD）.該方法結(jié)合了先進(jìn)的實(shí)驗(yàn)和計(jì)算方法來獲得高親和性ssDNA核酸適體，采用傳統(tǒng)的合成文庫來產(chǎn)生機(jī)器學(xué)習(xí)模型的數(shù)據(jù)［圖10（A）］，使用粒子展示基于靶標(biāo)濃度和庫中序列的熒光強(qiáng)度來定量庫中每一個(gè)序列的相對親和力［圖10（B）］.通過改變靶標(biāo)濃度以控制篩選嚴(yán)格程度，粒子展示技術(shù)可以在不同親和力閾值下，將庫中序列劃分成核酸適體陽性池和陰性池.每一種序列池通過Illumina公司開發(fā)的下一代測序技術(shù)（Next Generation Sequencing，NGS）進(jìn)行測序后作為粒子展示方法的輸入信號，全連接和卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（Neural Network，NN）模型可以預(yù)測親和力測量結(jié)果［圖10（C）］.隨后，作者采用3個(gè)高性能模型來創(chuàng)建序列，首先確定機(jī)器學(xué)習(xí)指導(dǎo)突變的起點(diǎn)種子序列，然后對這些種子序列進(jìn)行5輪迭代突變，選擇在模型中每輪表現(xiàn)優(yōu)異的突變序列［圖10（D）］，最后通過例子展示輸出這些優(yōu)異序列進(jìn)行合成和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證［圖10（E）］.理論上，可以重復(fù)圖10（B）~（D）的過程，直到獲得足夠的高質(zhì)量核酸適體候選序列為止.

Fig.10 MLPD overview[81]

2 Post-SELEX化學(xué)修飾

在經(jīng)SELEX技術(shù)篩選的核酸適體全長序列中，兩端包含有PCR擴(kuò)增的引物序列.因此，僅有部分序列與靶標(biāo)存在親和性，亟需發(fā)展有效的方法從中提煉出親和性更高、特異性更強(qiáng)和序列更短的核酸適體.這就吸引了許多研究者致力于post-SELEX優(yōu)化，對SELEX獲得的核酸適體序列進(jìn)行改造或化學(xué)修飾［82，83］.典型的post-SELEX修飾包括核苷酸構(gòu)件的化學(xué)修飾、結(jié)構(gòu)優(yōu)化和多價(jià)組合等方法，可以顯著增強(qiáng)核酸適體與靶標(biāo)的親和性［84，85］.近年來，修飾后的核酸適體在生命科學(xué)、生物醫(yī)學(xué)及藥學(xué)應(yīng)用中發(fā)展迅速，展現(xiàn)了巨大優(yōu)勢［86］.

2.1 化學(xué)修飾核苷酸構(gòu)件提高核酸適體親和力

迄今，研究人員已經(jīng)對SELEX篩選后得到的核酸適體中的核苷酸構(gòu)件進(jìn)行了大量的化學(xué)修飾以提高核酸適體的親和力［87~90］（圖11）.目前已報(bào)道的化學(xué)修飾策略主要包括磷酸鹽取代、堿基修飾、核糖修飾、標(biāo)簽修飾和功能基團(tuán)修飾等.這些修飾方法其實(shí)與其它核酸類藥物的修飾類似.如Tam等［91］將篩選得到的富含G的18-mer核酸適體進(jìn)行全硫代核酸修飾后，顯著提高了其與靶標(biāo)的親和力，且發(fā)現(xiàn)修飾后的核酸適體可抑制白細(xì)胞表面分化抗原28（CD28）的表達(dá).Lee等［92］將AS1411核酸適體中的堿基修飾上5-（N-芐基羧酰胺）脫氧尿苷，修飾后的核酸適體的親和力比原適體提高了2.5倍.Mallikaratchy等［93］將淋巴瘤B細(xì)胞篩選得到的核酸適體的頸部修飾上鎖核酸，能有效提高核酸適體的二級結(jié)構(gòu)的整體穩(wěn)定性，提升其靶標(biāo)親和力.Lin等［94］通過SELEX技術(shù)篩選出人中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶（hNE）的DNA核酸適體，不能有效抑制彈性蛋白酶的活性.當(dāng)將該核酸適體修飾上四肽后，抑制活性增加了5個(gè)數(shù)量級，且親和力提高了近2倍.下文重點(diǎn)對化學(xué)修飾構(gòu)建含有類氨基酸側(cè)鏈的核苷酸進(jìn)行介紹.

Fig.11 Functional group aptamer modifications discussed in this review

Fig.12 Overview of nucleobase modifications introduced at the C5 position of dUTP(deoxyuridines triphosphate)or dCTP(deoxycytidine triphosphate)for the synthesis of so?called SOMAmers[15]

結(jié)合核酸和氨基酸的最佳特性，采用類氨基酸的側(cè)鏈可有效對核酸適體引入新的官能團(tuán).這些類氨基酸側(cè)鏈可以直接與靶標(biāo)特異性結(jié)合，或者穩(wěn)定核酸適體結(jié)構(gòu)，都可以提高核酸適體與靶標(biāo)的親和力.Gold等［95］通過用芐基（Bn-）、萘基（Nap-）、色胺基（Trp-）或異丁基衍生物（iBu）修飾脫氧尿苷三磷酸（dUTP）的5號碳（C5）位（圖12），成功地將核酸的構(gòu)象靈活性與蛋白質(zhì)的功能多樣性結(jié)合起來.這些類氨基酸修飾后的核酸適體被命名為“慢速解離速率修飾的核酸適體”（SOMAmers），它們可以與蛋白質(zhì)的疏水口袋之間形成額外的疏水相互作用［96］，大大增強(qiáng)了核酸適體與蛋白質(zhì)的結(jié)合親和力［67，95］.Gawande等［68］和Veedu等［97］在dUTP和脫氧胞苷三磷酸（dCTP）這2個(gè)嘧啶堿基的C5位置進(jìn)行萘基、絡(luò)氨酸和蘇氨酸等幾種官能團(tuán)的組合修飾，進(jìn)一步開發(fā)了下一代“SOMAmers”.結(jié)果表明，對核酸序列進(jìn)行單修飾或雙修飾疏水官能團(tuán)均能提高核酸適體與靶蛋白的結(jié)合性能，Kd值可達(dá)到pmol/L級別，使得修飾后的SOMAmers成為生物醫(yī)學(xué)檢測診斷應(yīng)用中的理想分子識別工具，適用性和市場潛力巨大.SOMAmers具有2個(gè)關(guān)鍵優(yōu)點(diǎn)：（1）高效識別蛋白質(zhì)靶標(biāo)和與互補(bǔ)核酸鏈雜交的雙重能力；（2）變性后可重新折疊，再次識別靶標(biāo).2000年，Gold創(chuàng)立的SomaLogic公司致力于開發(fā)突破性蛋白質(zhì)組學(xué)分析技術(shù)，并應(yīng)用于生物標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)、診斷試劑和藥物的開發(fā).該公司在創(chuàng)立初期就開始開發(fā)SOMAmer技術(shù)，基于此技術(shù)開發(fā)的SOMAscan Assay平臺首次實(shí)現(xiàn)了蛋白質(zhì)的大規(guī)模檢測，檢測廣度可達(dá)5000種蛋白質(zhì)，檢測深度低至微摩爾至飛摩爾的動態(tài)范圍，涵蓋高豐度和低豐度蛋白.該平臺也用越來越多的研究案例證明修飾后的核酸適體可替代抗體檢測蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物，是抗體檢測的強(qiáng)大替代方案.因此，SOMAscan Assay平臺可與基于抗體檢測的酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）相媲美，非常適合研究與疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)組［98］.

Fig.13 Terminal fixation restricting the flexibility of the original aptamer(A),schematic presentation of terminal fixation(B),scheme of the ITC(C),scheme of the tetrahedron?assisted triple helix?aptamer nanostructure(D)and schematic illustration of the developed electrochemical aptasensor(E)[99]

2.2 結(jié)構(gòu)優(yōu)化提高核酸適體親和力

核酸適體的親和性依賴于其正確的折疊，但核酸適體骨架的過度靈活通常會導(dǎo)致其在復(fù)雜環(huán)境中的結(jié)合能力減弱，因此需要設(shè)計(jì)更穩(wěn)定、結(jié)構(gòu)更明確的核酸適體.Wang等［99］提出了“通過鎖定核酸適配體末端提高親和力”的設(shè)想（圖13），通過巧妙的分子設(shè)計(jì)，使用DNA三螺旋結(jié)構(gòu)鎖定核酸適體的兩端，使其固定在圖2所示的折疊狀態(tài)（Ⅱ），從而提高核酸適體與靶標(biāo)的親和力.作者在原核酸適體的2個(gè)末端均通過化學(xué)合成引入2個(gè)含CT的嘧啶延長序列A，加入1個(gè)含GA的嘌呤序列B后，根據(jù)Watson-Crick堿基互補(bǔ)配對，序列A和B雜交形成具有高穩(wěn)定性和特異性的三螺旋結(jié)構(gòu)，可固定核酸適體的末端和限制其靈活性，而不干擾核酸適體與目標(biāo)結(jié)合時(shí)的構(gòu)象折疊.經(jīng)計(jì)算，三螺旋核酸適體的Kd值為174 nmol/L，比原適體（Kd=1.15μmol/L）的親和性提高了10倍.作者在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)了一種核酸四面體輔助三螺旋末端鎖定的核酸適體-電化學(xué)傳感器，該方法靈敏度高、選擇性好.該研究構(gòu)建了一種簡便且適用性廣的方法來提高核酸適體的親和力，為核酸適體的實(shí)際應(yīng)用打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，未來有望在食品、醫(yī)藥、材料、分子診斷等領(lǐng)域中發(fā)揮作用.

另外，通過SELEX技術(shù)篩選的核酸適體包含引物序列和隨機(jī)序列，長達(dá)70~130個(gè)堿基（Nucleo‐tide，nt），其中隨機(jī)序列多在40~80 nt.許多SELEX篩選后的全長核酸適體序列存在冗余堿基序列，引物區(qū)未與隨機(jī)區(qū)產(chǎn)生堿基配對，甚至影響全長核酸適體序列與靶標(biāo)的親和力［100，101］.這些初級核酸適體不適合直接應(yīng)用到臨床或?qū)嶒?yàn)室研究，需對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)剪裁，以得到既保持結(jié)合活性，又長度合適的核酸適體［102~107］.如Hani等［108］將熒光素和猝滅劑標(biāo)記的核酸適體互補(bǔ)的寡核苷酸序列與截短的核酸適體雜交以形成雙鏈體結(jié)構(gòu)，構(gòu)建了截短的孕激素核酸適體用于熒光法檢測孕酮.與原核酸適體相比，截短的序列顯示出較高的結(jié)合親和力，Kd值（2.1 nmol/L）降低了16倍.Zhang等［109］通過合理截短63-nt的雙酚A核酸適體［110］，獲得了與雙酚A特異結(jié)合的38-nt和12-nt核酸適體，Kd值分別為13.17 nmol/L和27.05 nmol/L.比原核酸適體38-nt和12-nt核酸適體對雙酚A具有更高的結(jié)合親和力.

2.3 多價(jià)結(jié)合提高核酸適體親和力

上述的大多數(shù)方法本質(zhì)是通過優(yōu)化核酸適體與靶標(biāo)的分子間相互作用來增加核酸適體的親和力.也可以著眼于親和力概念本身，通常用解離常數(shù)Kd值來表示親和力強(qiáng)弱，Kd值越小表示核酸適體與靶標(biāo)解離的可能性越小，即親和力越強(qiáng).當(dāng)1個(gè)分子包含2個(gè)或多個(gè)相同的結(jié)合位點(diǎn)時(shí)，即使所有位點(diǎn)的親和力保持不變，但與僅包含1個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的分子相比，結(jié)合力也可以得到提高，這就是多價(jià)效應(yīng)［111］.據(jù)報(bào)道，核酸適體的多價(jià)效應(yīng)是提高單一核酸適體與靶標(biāo)親和力的有效途徑之一［112~116］.如Tan等受到酶的環(huán)狀結(jié)構(gòu)啟發(fā)（圖14），將3個(gè)靶向癌細(xì)胞的核酸適體（Sgc8［54］，TD05［117］和XQ-2d［118］）構(gòu)建成環(huán)狀閉合二價(jià)核酸適體（cb-sgc8，cb-TDO5和cb-XQ-2d）［119］.作者系統(tǒng)研究了此環(huán)狀二價(jià)核酸適體的熱穩(wěn)定性、核酸酶抗性、結(jié)合親和力和體內(nèi)活性，并與它們的原核酸適體進(jìn)行了比較.結(jié)果表明，cb-sgc8與靶細(xì)胞結(jié)合的平衡解離常數(shù)Kd值為（0.30±0.06）nmol/L，比sgc8原核酸適體的解離常數(shù)［Kd=（0.86±0.21）nmol/L］降低2倍.cb-TD05和cb-XQ-2d的穩(wěn)定性測試結(jié)果表明，環(huán)狀閉合二價(jià)核酸適體可明顯改善其在核酸酶和血清中的穩(wěn)定性，具有更好的親和力以及活體內(nèi)長循環(huán)時(shí)間.Tan等［120］進(jìn)一步將核酸適體組裝到DNA樹枝狀納米載體的分支上，再共價(jià)交聯(lián)上腺相關(guān)病毒（Adeno-Associated Virus type 2，AAV2），實(shí)現(xiàn)了增強(qiáng)型靶向AAV2介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)導(dǎo).由于DNA樹枝狀的多價(jià)效應(yīng)，可以有效提高核酸適體與靶細(xì)胞的結(jié)合能力.這種多價(jià)核酸適體修飾策略拓寬了AAV2載體在靶向基因轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因治療領(lǐng)域的應(yīng)用范圍.

Fig.14 Schematic presentation of circular bivalent aptamers for in vivo imaging[119]

近年來，基于血液等體液中循環(huán)腫瘤細(xì)胞（Circulating tumor cell，CTC）的液體活檢技術(shù)是當(dāng)前惡性腫瘤診斷領(lǐng)域的前沿研究.基于癌細(xì)胞篩選的核酸適體構(gòu)建多價(jià)核酸適體結(jié)合納米技術(shù)已被廣泛用于細(xì)胞捕獲，可顯著增強(qiáng)核酸適體捕獲靶細(xì)胞的能力［121~123］.Yang等［124］提出了基于流體力學(xué)分離與仿生多價(jià)識別的微流控芯片技術(shù)，獲得了多尺度協(xié)同捕獲富集CTC的新策略.作者構(gòu)建的仿生微流控芯片由上萬個(gè)修飾有特異性捕獲CTC的核酸適體探針的微柱構(gòu)成.每個(gè)微柱表面布滿納米金顆粒，每個(gè)納米金顆粒表面修飾上百條核酸適體序列.這些多價(jià)核酸適體可以像章魚的觸手一樣協(xié)同作用，捕獲效率比單價(jià)核酸適體提高了3倍，實(shí)現(xiàn)了CTC的高效富集.該工作在腫瘤分期診斷、動態(tài)監(jiān)測、療效評估、藥物開發(fā)和預(yù)后監(jiān)測等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景.

多價(jià)核酸適體能增強(qiáng)與靶標(biāo)的親和力可從以下3方面進(jìn)行解釋：首先，多價(jià)核酸適體很容易獲得核酸適體與靶標(biāo)結(jié)合的有效局部濃度，該濃度高于含有等量單價(jià)核酸適體的等效溶液濃度；其次，從統(tǒng)計(jì)學(xué)的角度來看，較高的局部核酸適體濃度增加了核酸適體與靶標(biāo)解離后重新結(jié)合靶標(biāo)的機(jī)會；第三，螯合效應(yīng)使多價(jià)核酸適體與靶標(biāo)之間能夠進(jìn)行多種結(jié)合作用，如果要解離，所有結(jié)合作用必須同時(shí)被破壞.與獨(dú)立作用的總和相比，多價(jià)核酸適體可實(shí)現(xiàn)更強(qiáng)的穩(wěn)定性和更高的親和力.

3 總結(jié)與展望

本文詳細(xì)總結(jié)了pre-SELEX和post-SELEX化學(xué)修飾提高核酸適體與靶標(biāo)結(jié)合親和力的方法以及部分應(yīng)用.盡管基礎(chǔ)研究已證明核酸適體可媲美抗體，在疾病診療中同樣具有巨大價(jià)值和潛力，但仍不能滿足臨床應(yīng)用的要求.目前對核酸適體的臨床研究仍處于起步階段，具體體現(xiàn)在以下方面：（1）用于豐富篩選文庫的人工擴(kuò)展堿基種類有限，固相合成技術(shù)有待提高，復(fù)制過程中的聚合酶的保真度和深度測序技術(shù)亟需進(jìn)化；（2）SELEX技術(shù)有待進(jìn)步，應(yīng)使其更簡單、更強(qiáng)大和更可預(yù)測；（3）所研究的SELEX后化學(xué)修飾的核酸適體的數(shù)量非常少，且缺乏大量的臨床試驗(yàn).目前，核酸適體的分析應(yīng)用大部分停留在方法學(xué)研究階段，實(shí)際應(yīng)用還遠(yuǎn)不及抗體普及；（4）缺乏商業(yè)投資，大多數(shù)核酸適體研究僅在基礎(chǔ)研究實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，不利于核酸適體產(chǎn)品轉(zhuǎn)化.相信在不久的將來，隨著SELEX技術(shù)以及核酸適體修飾方法的進(jìn)一步發(fā)展，借助合適的工程技術(shù)和人類的創(chuàng)造力，核酸適體很可能像抗體一樣在各個(gè)領(lǐng)域發(fā)揮重要作用，成為生物科學(xué)中最強(qiáng)大的分子識別工具，解決生命醫(yī)學(xué)中棘手的問題，為保障人類健康做出巨大的貢獻(xiàn).