晶狀體蛋白識別互作與白內(nèi)障的研究進展

林寧欽，姚 克，陳祥軍，

（1.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院,杭州310020；2.浙江大學(xué)附屬第二醫(yī)院眼科中心,杭州310009）

白內(nèi)障是晶狀體渾濁導(dǎo)致視力障礙的眼科疾病，是全球致盲的高危因素.2019年，世界衛(wèi)生組織發(fā)布《世界視覺報告（2020）》顯示，全球約6520萬患者由白內(nèi)障導(dǎo)致中度、重度遠視力損傷或致盲癥，且隨著全球人口老齡化加速，白內(nèi)障患病率急劇增加［1］.白內(nèi)障根據(jù)晶狀體發(fā)生渾濁的病理因素，可分為先天性、年齡相關(guān)性、代謝性、中毒性和輻射性白內(nèi)障等.目前，針對不同的病因使用相應(yīng)的藥物治療未能延緩或者逆轉(zhuǎn)晶狀體渾濁，唯一有效的治療方案仍然是手術(shù)治療.盡管隨著顯微手術(shù)和人工晶狀體植入術(shù)的日趨成熟，白內(nèi)障手術(shù)已取得顯著的療效［2］.但是對于有手術(shù)指征的白內(nèi)障患者，需盡早選擇合適的手術(shù)時機，特別是小兒白內(nèi)障，一旦錯過最佳治療時機，可能導(dǎo)致終生視力受損［3］.同時，白內(nèi)障手術(shù)也可能會引起各種并發(fā)癥，如前房出血、后囊膜渾濁及眼內(nèi)炎等，導(dǎo)致術(shù)后視力沒有恢復(fù)［4］.單純依靠手術(shù)治療將難以應(yīng)對老齡化造成的白內(nèi)障盲人日益增多的挑戰(zhàn).因此，研究白內(nèi)障的發(fā)病機理對于發(fā)現(xiàn)新的藥物靶點、研制新的防治策略具有重要的臨床意義.

白內(nèi)障的發(fā)病組織是晶狀體.晶狀體為透明組織，是眼內(nèi)唯一具有調(diào)節(jié)功能的屈光介質(zhì).晶狀體纖維細胞是晶狀體的主要組成部分，其內(nèi)含有大量的晶狀體蛋白.晶狀體蛋白可分為α-，β-和γ?晶狀體蛋白3大亞家族.α?晶狀體蛋白包括αA和αB晶狀體蛋白，屬于小熱休克蛋白家族，具有分子伴侶功能，可識別晶狀體內(nèi)錯誤折疊蛋白質(zhì)，保護β?、γ?或其它晶狀體內(nèi)蛋白質(zhì)的正確折疊，抑制蛋白質(zhì)異常聚集［5］.β?和γ?晶狀體蛋白在結(jié)構(gòu)上具有同源性，均由2個結(jié)構(gòu)域組成，每個結(jié)構(gòu)域含有4個“Greek key”基序；在晶狀體內(nèi)作為主要結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，β?/γ?晶狀體蛋白高度有序的空間排布在維持晶狀體結(jié)構(gòu)功能上發(fā)揮關(guān)鍵作用［6］.其中，β?晶狀體蛋白包括3種堿性蛋白質(zhì)（βB1，βB2和βB3）和4種酸性蛋白質(zhì)（βA1，βA2，βA3和βA4），以同源或異源寡聚體形式存在；γ?晶狀體蛋白包括γA，γF和γS，通常以單體形式存在，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性高于α?和β-晶狀體蛋白，與晶狀體核的硬度相關(guān).晶狀體蛋白在晶狀體內(nèi)呈短程有序的空間分布，通過精準識別、分子內(nèi)或分子間相互作用動態(tài)調(diào)控晶狀體內(nèi)蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)，維持晶狀體透明性.

晶狀體纖維細胞高度分化，細胞核、細胞器退化，細胞內(nèi)大分子生物代謝低，因此，物理化學(xué)調(diào)控的分子識別、蛋白互作在維持晶狀體正常生理功能中發(fā)揮重要作用.晶狀體蛋白半衰期長，且翻譯合成后不再更新，廣泛受晶狀體細胞內(nèi)外環(huán)境因素干擾，影響分子識別、相互作用介導(dǎo)的細胞穩(wěn)態(tài)［7］.任何影響晶狀體內(nèi)蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)的物理化學(xué)因素均會引起晶狀體蛋白分子識別、相互作用及生物活性的改變，導(dǎo)致晶狀體內(nèi)蛋白質(zhì)異常聚集.如酸堿平衡紊亂（pH異常）會導(dǎo)致晶狀體蛋白帶電性質(zhì)和空間構(gòu)象的顯著改變［8］；氧化還原紊亂或紫外輻射等會誘導(dǎo)超氧化產(chǎn)物和自由基使晶狀體蛋白發(fā)生氧化變性［9］；蛋白質(zhì)翻譯后修飾調(diào)控晶狀體蛋白的親疏水性和空間結(jié)構(gòu)等能介導(dǎo)分子識別、相互作用［10］.此外，蛋白質(zhì)液-液相分離是細胞在擁擠環(huán)境下調(diào)控生物大分子相互作用、生物活性的有效方式［11］.晶狀體蛋白可通過分子內(nèi)或分子間相互作用有序調(diào)控生物大分子凝聚體動態(tài)組裝.晶狀體細胞內(nèi)外環(huán)境干擾將導(dǎo)致正常液-液相分離進展到液-固相轉(zhuǎn)化，形成不可逆的晶狀體蛋白沉積物，與白內(nèi)障發(fā)病機制密切相關(guān)［12］.因此，針對化學(xué)調(diào)控晶狀體蛋白識別互作的研究將有助于解析晶狀體蛋白分子變性、聚集的動態(tài)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，理清白內(nèi)障的致病機制，基于調(diào)控晶狀體蛋白識別互作的化學(xué)因素探索將挖掘有效防治白內(nèi)障的創(chuàng)新策略.

目前，白內(nèi)障發(fā)病機制的研究大多圍繞晶狀體蛋白的結(jié)構(gòu)功能和聚集機制等方面［10，13，14］，關(guān)于晶狀體蛋白分子識別互作與白內(nèi)障發(fā)病機制尚未有綜合評述.基于此，本文將重點闡明白內(nèi)障發(fā)生發(fā)展過程中，晶狀體蛋白相互作用介導(dǎo)蛋白質(zhì)聚集的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，及受pH值、金屬離子、輻射損傷、蛋白質(zhì)翻譯后修飾等化學(xué)因素影響的動態(tài)調(diào)控.同時，本文將從晶狀體蛋白的分子識別、相互作用的方式、調(diào)控因素及研究技術(shù)創(chuàng)新等方面進行系統(tǒng)闡述，全面理清晶狀體蛋白分子相互作用與白內(nèi)障發(fā)病機制的相關(guān)研究.最后，展望了晶狀體蛋白識別互作調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在白內(nèi)障藥物研發(fā)領(lǐng)域的應(yīng)用價值與挑戰(zhàn).

1 晶狀體蛋白識別互作機理

根據(jù)晶狀體蛋白識別互作對象分類，可以分為晶狀體蛋白分子內(nèi)識別互作、晶狀體蛋白分子間識別互作、晶狀體蛋白與非晶狀體蛋白識別互作.

1.1 晶狀體蛋白分子內(nèi)識別互作

β?/γ?晶狀體蛋白分子內(nèi)相互作用賦予其極高的溶解度.β?/γ?晶狀體蛋白結(jié)構(gòu)相似，均由2個結(jié)構(gòu)域組成，每個結(jié)構(gòu)域含有4個“Greek key”基序，氫鍵網(wǎng)絡(luò)維持β-sheet片層規(guī)則排布，穩(wěn)定“Greek key”基序；分子內(nèi)部由非極性氨基酸構(gòu)成緊密的疏水核心，而外部由極性帶電氨基酸圍繞蛋白質(zhì)表面形成親水層，顯著提高了蛋白質(zhì)的溶解度［10］.β?/γ?晶狀體蛋白2個結(jié)構(gòu)域間的Loop結(jié)構(gòu)能調(diào)控“Greek key”基序間相互作用，在維持自身結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性方面具有重要功能.βB1晶狀體蛋白的N端延伸結(jié)構(gòu)域具有分子內(nèi)伴侶蛋白活性，可保護自身結(jié)構(gòu)穩(wěn)定及其它蛋白間相互作用［15］.βA3晶狀體蛋白具有水解酶活性，通過分子內(nèi)識別互作調(diào)控自身水解及蛋白酶活性［16］.另外，晶狀體蛋白均含有一定數(shù)目的半胱氨酸，巰基基團在維持晶狀體內(nèi)氧化還原平衡方面發(fā)揮重要作用.同時，半胱氨酸易被氧化生成分子內(nèi)二硫鍵，錯誤二硫鍵的形成也會導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集和沉淀，引發(fā)晶狀體渾濁［17］.

1.2 晶狀體蛋白分子間識別互作

在晶狀體內(nèi)擁擠的環(huán)境下，晶狀體蛋白致密、有序排列，蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)精準識別互作在維持蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)方面扮演著重要角色.α?晶狀體蛋白由αA和αB亞單位以約3∶1的方式組成異源寡聚體.同時，α?晶狀體蛋白通常以大寡聚態(tài)形式存在發(fā)揮分子伴侶活性，識別錯誤折疊晶狀體蛋白，維持晶狀體蛋白正確結(jié)構(gòu)［5］.對于β?晶狀體蛋白，晶狀體蛋白常形成復(fù)雜的寡聚結(jié)構(gòu)，可以是同源寡聚體，也可以是酸性和堿性亞單位之間組成的異源寡聚體.β?家族晶狀體蛋白形成寡聚體的過程是可逆的，通過分子間亞基交換來實現(xiàn)動態(tài)平衡，這種結(jié)構(gòu)的靈活性有助于維持晶狀體的穩(wěn)定性［18］.γ-晶狀體蛋白通常以單體形式存在.這3種晶狀體蛋白家族彼此之間平衡的相互作用是維持晶狀體透明性的分子基礎(chǔ)（圖1）.

Fig.1 The eye lens structure and examples of the intracellular crystallins recognition and protein?protein interaction(PPI)

1.3 晶狀體蛋白與非晶狀體蛋白識別互作

晶狀體內(nèi)非晶狀體蛋白主要包括細胞骨架蛋白和細胞膜蛋白等，這些非晶狀體蛋白與晶狀體蛋白存在識別、互作，形成復(fù)雜而精確的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，共同維持晶狀體細胞結(jié)構(gòu)穩(wěn)定（圖1）.其中，細胞骨架蛋白［如肌動蛋白（Actin）、肌球蛋白（Myosin）和中間纖維（IF）等］參與保持細胞正常形態(tài).α?晶狀體蛋白與細胞骨架蛋白識別互作可調(diào)控晶狀體細胞骨架的裝配和解裝配過程［19］.αB晶狀體蛋白與肌動蛋白結(jié)合可有效防止細胞應(yīng)激誘導(dǎo)的蛋白聚集，其結(jié)合能力強弱取決于其磷酸化狀態(tài)［20］.在高溫等應(yīng)激條件下，αB晶狀體蛋白可與中間纖維直接互作來維持細胞骨架的穩(wěn)定性［21］.主要內(nèi)在蛋白（MIP）在晶狀體纖維細胞中表達豐富，是細胞膜上的一類具有選擇性運輸水分的特異孔道蛋白，是調(diào)控水分進出晶狀體的最主要的途徑，維持其透明性［22］.MIP與γE晶狀體蛋白具有特異性相互作用，可將γE晶狀體蛋白募集至細胞膜上，為MIP與γ?晶狀體蛋白之間的功能聯(lián)系提供了證據(jù)[23]；同時，γ?晶狀體蛋白不僅存在于晶狀體的核區(qū)，還存在視網(wǎng)膜上，表明γ?晶狀體蛋白可能還具有除了結(jié)構(gòu)蛋白以外的功能[24].

1.4 晶狀體內(nèi)蛋白質(zhì)液-液相分離

蛋白質(zhì)液-液相分離（LLPS）指的是在溶液中，蛋白質(zhì)分子之間不斷聚集，當達到溶解極限時，分子就會以液滴的形態(tài)從溶液中析出，這是一種細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的高效聚集方式，也是無膜細胞器和生物分子凝集體形成的重要機制［11］.晶狀體中蛋白質(zhì)占濕重的35%，是機體內(nèi)蛋白質(zhì)濃度最高的組織，纖維細胞內(nèi)微環(huán)境極其擁擠，并且細胞內(nèi)的核和其它細胞器都已退化，相分離驅(qū)動的無膜細胞器有助于維持晶狀體纖維細胞正常代謝.研究表明，在一定溫度和壓力等外界條件下，晶狀體蛋白分子通過多價相互作用，可特異性聚合成非共價結(jié)合物，生成無膜的蛋白液滴體系，以適應(yīng)外界環(huán)境變化.在低溫條件下，牛γB晶狀體蛋白會發(fā)生相分離，可以觀察到晶狀體蛋白相互聚集形成高濃度的球形蛋白液滴［25］.此外，在磷酸鹽緩沖液中加入聚乙二醇，以模擬細胞內(nèi)擁擠環(huán)境，會促進牛γS晶狀體蛋白產(chǎn)生相分離現(xiàn)象［26］.在含有γD和βB1晶狀體蛋白的水溶液中會出現(xiàn)這2種蛋白的相分離現(xiàn)象，并且隨著βB1晶狀體蛋白的濃度增加，相分離臨界溫度降低，表明可以通過調(diào)控γD和βB1晶狀體蛋白分子間相互作用來影響相分離的形成［27］.最近，Cinar等［28］發(fā)現(xiàn)在低溫和高壓條件下，γD晶狀體蛋白的相分離液滴會發(fā)生解聚，恢復(fù)均一的溶液狀態(tài)（圖2）.這可能是深海魚類預(yù)防冷致白內(nèi)障的機制，并且在這些魚類體內(nèi)中發(fā)現(xiàn)的氧化三甲胺（TMAO）能夠調(diào)控相分離的形成，維持相分離液滴的穩(wěn)定性.

Fig.2 Pressure?dependent droplet formation and dissolution in the LLPS process[28]

2 晶狀體蛋白識別互作的化學(xué)調(diào)控

2.1 酸堿平衡

酸堿平衡是幾乎影響到所有蛋白質(zhì)分子表面電荷分布和構(gòu)象變化的關(guān)鍵因素，許多蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用都會受到pH值的調(diào)控.正常情況下，晶狀體細胞內(nèi)的pH值維持在7.4左右，越靠近晶狀體核，pH值越低.這是因為晶狀體核內(nèi)無氧糖酵解產(chǎn)生H+，晶狀體內(nèi)存在離子交換系統(tǒng)，如Na+-H+和Cl?-HCO3?等有助于調(diào)節(jié)晶狀體內(nèi)的pH值［29］.Wang等［30］發(fā)現(xiàn)，在pH=3條件下，γC晶狀體蛋白的聚集過程是通過誘導(dǎo)形成部分未折疊中間體，再聚集形成蛋白沉淀.Mohr等［31］探究了pH值變化對γD和γS晶狀體蛋白的影響.當pH值高于其等電點時，晶狀體蛋白表面帶有負電荷，使蛋白分子間產(chǎn)生靜電排斥作用力，不易形成聚集體.在酸性條件下，與晶狀體細胞膜結(jié)合的αA和αB晶狀體蛋白量會增加，導(dǎo)致晶狀體內(nèi)可溶性α晶狀體蛋白含量逐漸減少［32］.

2.2 金屬離子

晶狀體內(nèi)的Na+，Ca2+和Cu2+等必需金屬元素的含量均隨著晶狀體的老化而增加，這些金屬離子平衡濃度的破壞對晶狀體蛋白分子相互作用具有一定的影響，并且Zn2+和Hg2+等重金屬離子對晶狀體有毒性作用，可以使晶狀體蛋白解折疊，暴露其內(nèi)部的疏水性基團，從而增大分子間疏水相互作用，長期接觸這類金屬容易發(fā)生白內(nèi)障［33］.研究表明，β?/γ?家族晶狀體蛋白屬于鈣結(jié)合蛋白，對維持細胞內(nèi)鈣離子平衡具有重要作用［34］.Quintanar等［35］探究了Cu2+和Zn2+對γD晶狀體蛋白穩(wěn)定性的影響，結(jié)果顯示，Cu2+和Zn2+能夠誘導(dǎo)γD晶狀體蛋白聚集形成蛋白沉淀.Ramkumar等［36］也報道了類似的結(jié)果，認為Cu2+主要通過氧化半胱氨酸殘基誘導(dǎo)γD晶狀體蛋白發(fā)生交聯(lián)聚集.Calva等［37］發(fā)現(xiàn)Hg2+可以誘導(dǎo)γC和γS晶狀體蛋白變性，破壞蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)，通過分子間二硫鍵交聯(lián)形成不溶性蛋白聚集體.

2.3 輻射損傷

輻射損傷主要包括來自γ射線、X射線和紫外線等的電離輻射，晶狀體對紫外線的透過率較低，可降低視網(wǎng)膜的光損傷，但晶狀體對紫外線的吸收隨年齡的增長而增加，紫外線輻射對晶狀體蛋白產(chǎn)生損傷的機制主要是通過光化學(xué)反應(yīng)生成自由基引起的氧化損傷［38］.Kim等［39］報道低劑量γ射線輻射可以使γE和γF晶狀體蛋白上的色氨基酸和甲硫氨酸殘基發(fā)生氧化，導(dǎo)致晶狀體蛋白的相互作用改變，誘發(fā)輻射性白內(nèi)障.紫外線輻射也會使α晶狀體蛋白上色氨酸殘基大量被氧化，降低α晶狀體蛋白的分子伴侶活性［40］.Honisch等［41］研究了紫外線輻射對豬水溶性晶狀體蛋白穩(wěn)定性的影響，紫外線輻射可誘導(dǎo)產(chǎn)生活性氧，致使水溶性蛋白分子間形成二硫鍵，并聚集形成高分子量不溶性蛋白沉淀（圖3）.

Fig.3 Aggregation of UV?irradiated water?soluble lens proteins[41]

2.4 晶狀體蛋白翻譯后修飾

由于晶狀體蛋白的半衰期長，合成后的晶狀體蛋白會終身存在于細胞內(nèi)，容易發(fā)生脫酰胺化、氧化損傷、糖基化和磷酸化等化學(xué)修飾，這些不同類型的蛋白質(zhì)翻譯后修飾會改變蛋白質(zhì)的電性、疏水性和空間結(jié)構(gòu)等屬性，導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶解性降低，蛋白發(fā)生交聯(lián)，最終形成蛋白沉淀、晶狀體混濁.

2.4.1 脫酰胺化 脫酰胺化是指天冬酰胺或谷氨酰胺殘基側(cè)鏈上的酰胺基被帶負電荷的羧基取代的過程.脫酰胺化修飾會引入負電荷，改變晶狀體蛋白表面的電荷分布，破壞蛋白-蛋白間的相互作用，導(dǎo)致晶狀體蛋白溶解度下降.研究表明，脫酰胺化會降低αA和αB晶狀體蛋白的分子伴侶活性，同時抑制兩者互作形成異源寡聚體［42］.在βB2晶狀體蛋白中，脫酰胺化修飾會降低蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，并使αA晶狀體蛋白無法與其識別結(jié)合形成可溶性高分子聚合物［43］.脫酰胺化修飾也會影響βA3和βB1等晶狀體蛋白的穩(wěn)定性，破壞正常的蛋白-蛋白相互作用［44，45］.脫酰胺化修飾還會破壞γS和γD晶狀體蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，導(dǎo)致分子間相互作用的失衡，出現(xiàn)核性白內(nèi)障［46，47］.

2.4.2 氧化損傷 目前公認的白內(nèi)障主要病理因素之一是氧化應(yīng)激.在正常人的晶狀體和房水中均存在一定含量的氧化物質(zhì)，如過氧化氫、氧的某些代謝產(chǎn)物超氧陰離子自由基和羥自由基等.同時，晶狀體內(nèi)也含有相應(yīng)的抗氧化物質(zhì)保護其免受氧化損傷，如還原型谷胱甘肽（GSH）中的巰基能保護晶狀體蛋白的巰基不被氧化成二硫鍵，超氧化物歧化酶和過氧化氫酶等參與將自由基和過氧化氫還原成水，生理狀態(tài)下二者處于動態(tài)平衡［48］.此外，α晶狀體蛋白在氧化應(yīng)激條件下可發(fā)揮分子伴侶功能，保護其它晶狀體蛋白免受氧化損傷.當晶狀體內(nèi)氧化物質(zhì)產(chǎn)生過多或清除這些物質(zhì)的能力下降時，會破壞晶狀體的抗氧化屏障，并產(chǎn)生各種自由基，氧化晶狀體蛋白氨基酸殘基中的巰基，在蛋白分子內(nèi)部或者分子間形成二硫鍵，導(dǎo)致蛋白質(zhì)發(fā)生共價交聯(lián)、聚集成不溶性蛋白沉淀［13］.αA晶狀體蛋白含有2個半胱氨酸，可被氧化形成分子內(nèi)二硫鍵，交聯(lián)形成更大的寡聚體，氧化后的寡聚體仍具有分子伴侶活性［49］.Fan等［50］在谷胱甘肽基因敲除小鼠模型中探究了氧化應(yīng)激在白內(nèi)障發(fā)生中的機制，發(fā)現(xiàn)在βB2晶狀體蛋白中的Cys38和Cys67以及γD晶狀體蛋白中的Cys19被氧化形成分子間二硫鍵，證實了二硫化物交聯(lián)形成與晶狀體蛋白聚集機制有關(guān).Zhao等［51］報道了γD和γC晶狀體蛋白在紫外線或過氧化氫等處理后，半胱氨酸殘基易被氧化，使晶狀體蛋白發(fā)生交聯(lián)聚集.γS晶狀體蛋白發(fā)生氧化損傷后，通過分子間或者分子內(nèi)二硫鍵共價結(jié)合成二聚體，進而使γS晶狀體蛋白聚集［52］.

2.4.3 非酶促糖基化 蛋白質(zhì)糖基化修飾是一種非酶促的翻譯后修飾過程，由低聚糖以糖苷的形式與晶狀體蛋白的賴氨酸殘基發(fā)生共價結(jié)合，晶狀體蛋白被糖基化的程度同時取決于其內(nèi)所含賴氨酸的數(shù)量和位于蛋白分子表面位置的可接觸性，在年齡相關(guān)性白內(nèi)障和糖尿病性白內(nèi)障的發(fā)病進程中起著重要作用［10］.糖基化反應(yīng)最終形成的糖基化終末產(chǎn)物會導(dǎo)致非色氨酸熒光的生成和非二硫鍵共價交聯(lián)形成，可引起晶狀體蛋白發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，形成二聚體、三聚體、四聚體乃至高分子量聚合物［53］.糖基化修飾會導(dǎo)致α?晶狀體蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，降低其分子伴侶活性，使其抑制變性蛋白聚集的功能減弱［54］，并且糖基化后的αA晶狀體蛋白與γD晶狀體蛋白結(jié)合后會促進糖基化終末產(chǎn)物的交聯(lián)聚集［55］.高糖條件可誘導(dǎo)γB晶狀體蛋白發(fā)生糖基化修飾，并促進其非二硫鍵共價結(jié)合成二聚體，但晶狀體蛋白的結(jié)構(gòu)沒有明顯改變［56］.同樣地，γD晶狀體蛋白也容易發(fā)生糖基化修飾，引發(fā)蛋白質(zhì)聚集［57］.

2.4.4 磷酸化 蛋白質(zhì)磷酸化是指由蛋白質(zhì)磷酸化酶將ATP或GTP的γ位磷酸基轉(zhuǎn)移到底物蛋白質(zhì)的氨基酸殘基上，這是一個可逆的修飾過程，可調(diào)控信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及細胞周期等生命活動.由于在磷酸化過程中，蛋白質(zhì)氨基酸側(cè)鏈引入了一個帶負電的磷酸基團，會誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象發(fā)生改變，進而改變與其它蛋白分子的相互作用.研究表明，晶狀體蛋白的磷酸化與去磷酸化過程的失調(diào)與白內(nèi)障的形成相關(guān)［58］.當αB晶狀體蛋白的Ser45基團發(fā)生磷酸化，會影響二聚體的形成，導(dǎo)致其分子伴侶活性降低，且與底物蛋白的結(jié)合增強，形成高分子量的聚集體［59］.在白內(nèi)障患者的晶狀體中，β家族晶狀體蛋白發(fā)生磷酸化修飾的比例最高，以βB1和βB2晶狀體蛋白為主，提示人晶狀體蛋白磷酸化修飾會導(dǎo)致晶狀體蛋白聚集沉淀［60］.

表1匯總了白內(nèi)障中常見的晶狀體蛋白質(zhì)翻譯后修飾類型［36，43~46，49~52，54，56~71］.

Table 1 Examples of post-translational modifications and their target protein in cataract

3 晶狀體蛋白識別互作的研究技術(shù)

晶狀體蛋白識別互作過程較為復(fù)雜，需要通過多種技術(shù)進行聯(lián)合解析.目前常用的技術(shù)包括熒光光譜法、圓二色光譜法、核磁共振光譜法及分子對接等.

3.1 熒光光譜法

熒光光譜法是研究晶狀體蛋白識別互作的重要手段，可以分為2種：（1）通過測定蛋白質(zhì)分子本身的內(nèi)源性熒光，如色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸殘基等具有固有發(fā)射熒光；（2）通過非共價或者共價作用向蛋白質(zhì)分子內(nèi)引入熒光探針，通過檢測外源熒光的變化來推斷蛋白質(zhì)構(gòu)象的改變.Wang等［72］利用內(nèi)源性色氨酸熒光光譜分析了γS-F30S晶狀體蛋白突變體的結(jié)構(gòu)變化.突變導(dǎo)致γS晶狀體蛋白上色氨酸殘基周圍的微環(huán)境發(fā)生變化，降低了晶狀體蛋白的穩(wěn)定性，并更容易發(fā)生蛋白聚集.Liang等［73］使用熒光共振能量轉(zhuǎn)移的方法研究了αA晶狀體蛋白與γC-T5P晶狀體蛋白突變體之間的相互作用，發(fā)現(xiàn)αA晶狀體蛋白能夠識別結(jié)合由熱應(yīng)激誘導(dǎo)的γC蛋白聚集體，形成可溶性晶狀體蛋白聚合物.Khago等［74］使用ANS熒光探針法比較了γS-WT晶狀體蛋白和γS-G18V晶狀體蛋白突變體疏水面暴露的狀態(tài).研究發(fā)現(xiàn)，與γS-WT晶狀體蛋白相比，γS-G18V突變體的N端結(jié)構(gòu)域的疏水面暴露增加，分子間疏水相互作用力增強，導(dǎo)致蛋白分子異常聚集.

3.2 圓二色光譜法

遠紫外圓二色光譜主要反映蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的信息，包括α-螺旋、β-折疊及β-轉(zhuǎn)角的含量等；而近紫外圓二色光譜則提供蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的信息.圓二色光譜法也常被用于表征晶狀體蛋白的相互作用.Liang等［75］使用圓二色光譜法研究了熱變性對αA晶狀體蛋白聚集的影響，發(fā)現(xiàn)αA晶狀體蛋白分子表面的β-折疊數(shù)量增加，導(dǎo)致蛋白分子之間疏水相互作用增大而聚集形成蛋白沉淀.Fu等［76］通過圓二色光譜法分析了Hsp27蛋白對αB晶狀體蛋白的保護作用，發(fā)現(xiàn)Hsp27蛋白能夠結(jié)合熱應(yīng)激誘導(dǎo)條件下的αB晶狀體蛋白，維持αB晶狀體蛋白的穩(wěn)定性.

3.3 核磁共振波譜法

核磁共振波譜法通過檢測分子結(jié)構(gòu)中標記的碳元素的化學(xué)移位，可直接分析晶狀體蛋白分子是否發(fā)生相互作用或構(gòu)象改變.Barnwal等［77］使用核磁共振波譜研究了不同溫度下晶狀體蛋白的聚集過程.當溫度降低至15℃時，β?/γ?晶狀體蛋白之間相互作用發(fā)生改變，誘發(fā)冷致白內(nèi)障.Kingsley等［78］應(yīng)用核磁共振波譜分析了αB晶狀體蛋白與γS-WT和γS-G18V晶狀體蛋白之間的相互作用，研究發(fā)現(xiàn)，與γS-WT晶狀體蛋白相比，αB晶狀體蛋白與γS-G18V突變體的結(jié)合力更強，有利于防止突變體蛋白聚集形成蛋白沉淀.最近，He等［79］借助核磁共振波譜法表征了γS晶狀體蛋白的構(gòu)象變化，發(fā)現(xiàn)ATP能夠增加γS晶狀體蛋白構(gòu)象的穩(wěn)定性，抑制晶狀體蛋白在高濃度條件下發(fā)生異常聚集.

3.4 分子對接和分子動力學(xué)模擬

分子對接是一種模擬分子間相互作用的方法，通過幾何匹配和能量匹配來確定配體與受體結(jié)合的最佳構(gòu)象，補充了晶狀體蛋白分子間作用的實驗數(shù)據(jù).分子動力學(xué)模擬是在原子水平上研究蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)隨時間動態(tài)變化的過程，可以得到構(gòu)象變化和蛋白質(zhì)折疊的信息［80］.Das等［81］應(yīng)用分子動力學(xué)模擬來研究γD晶狀體蛋白二聚體的聚集過程，發(fā)現(xiàn)γD晶狀體蛋白分子通過連續(xù)域交換C端β鏈，導(dǎo)致蛋白異常聚集.Chang等［82］使用分子對接和分子動力學(xué)模擬等技術(shù)進一步探討了酸性條件對γD晶狀體蛋白聚集過程的影響.結(jié)果顯示，在酸性條件下，γD晶狀體蛋白表面的電荷分布發(fā)生變化，并在C端柔性環(huán)區(qū)域產(chǎn)生反向平行的β鏈，改變蛋白質(zhì)分子之間的相互作用，導(dǎo)致晶狀體蛋白出現(xiàn)不可逆聚集.

3.5 蛋白質(zhì)液-液相分離跟蹤技術(shù)

用于跟蹤蛋白質(zhì)液-液相分離現(xiàn)象的主要是熒光漂白恢復(fù)技術(shù)（Fluorescence recovery after photo?bleaching，F(xiàn)RAP）.該技術(shù)的原理是利用熒光物質(zhì)標記蛋白后，使用高能量激光束將細胞內(nèi)某一特定區(qū)域的熒光猝滅；由于細胞質(zhì)中蛋白質(zhì)呈自由運動狀態(tài)，鄰近的熒光標記物會不斷向光漂白區(qū)遷移，使熒光漂白區(qū)的熒光強度逐漸恢復(fù)，因而FRAP技術(shù)能夠用于定量研究液滴組分重建的動力學(xué)過程［83］.此外，還需要其它方法來表征液滴的基本性質(zhì)：（1）液滴的形貌.通過顯微鏡來直接觀察液滴的形態(tài)是否為光滑球形，大小是否為微米級別，以及測量溶液中液滴產(chǎn)生的濁度變化；（2）液滴融合.同樣通過顯微鏡在活細胞中觀察到小液滴融合成大液滴的現(xiàn)象，或者液滴分離的現(xiàn)象.隨著越來越多的參與相分離的蛋白質(zhì)被發(fā)現(xiàn)，基于這些蛋白質(zhì)都含有固有無序區(qū)域（Intrinsically disordered region，IDR）等結(jié)構(gòu)特征，研究人員開發(fā)了多種用于預(yù)測相分離蛋白質(zhì)的分析工具，如PSPer［84，85］，有助于在較短周期內(nèi)篩選獲得能夠在細胞內(nèi)發(fā)生相分離的蛋白質(zhì).

4 總結(jié)與展望

晶狀體蛋白是晶狀體纖維內(nèi)唯一穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)蛋白，且其半衰期長，存在于整個生命過程中.晶狀體內(nèi)部的分子結(jié)構(gòu)主要是由晶狀體蛋白之間的瞬時短程相互作用參與構(gòu)筑及維持，通過在時空上精確調(diào)控蛋白相互作用的動態(tài)變化，形成一個蛋白濃度由中心向兩邊逐漸降低的空間分布，從而維持晶狀體的屈光功能.因此，晶狀體蛋白之間復(fù)雜的識別互作網(wǎng)絡(luò)一旦受到細胞內(nèi)外因素的干擾，極易導(dǎo)致晶狀體蛋白的有序排列發(fā)生紊亂.晶狀體蛋白受到諸多物理化學(xué)因素的干擾（圖4），pH值是影響蛋白質(zhì)分子表面電荷分布和構(gòu)象變化的重要因素，參與調(diào)控蛋白相互作用的過程.晶狀體蛋白與金屬離子結(jié)合或者受到輻射損傷后會使晶狀體蛋白暴露其疏水面，降低晶狀體蛋白的穩(wěn)定性.常見的蛋白質(zhì)翻譯后修飾包括脫酰胺化、氧化損傷、糖基化和磷酸化等化學(xué)修飾，其中氧化損傷會導(dǎo)致蛋白質(zhì)發(fā)生共價交聯(lián)，聚集成白色沉淀，使晶狀體出現(xiàn)渾濁.此外，蛋白質(zhì)液-液相分離是近年來在生命科學(xué)領(lǐng)域迅速發(fā)展起來的新概念，是一種細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的高效聚集方式.在低溫和高壓的條件下，γ?晶狀體蛋白會自發(fā)驅(qū)動產(chǎn)生相分離現(xiàn)象，可能參與晶狀體內(nèi)代謝調(diào)控，一旦環(huán)境因素干擾蛋白分子之間相互作用的精準性、動態(tài)性，將導(dǎo)致晶狀體蛋白沉積形成固體狀.

Fig.4 Chemical factors disturb the well?balanced crystallins recognition and interaction and lead to the aggregation of the crystallins

晶狀體內(nèi)的晶狀體蛋白通過相互作用形成一個精確調(diào)控的多維、動態(tài)的網(wǎng)絡(luò)，以維持細胞內(nèi)蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)及晶狀體的高度透明性.利用化學(xué)調(diào)控晶狀體蛋白相互作用能夠模擬白內(nèi)障發(fā)生時晶狀體蛋白的生化改變，用以揭示介導(dǎo)這些蛋白相互作用的關(guān)鍵結(jié)合區(qū)域.全面了解晶狀體蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，不僅能夠在晶狀體內(nèi)復(fù)雜環(huán)境中識別晶狀體蛋白相互作用的對象，還可以精確定位蛋白質(zhì)的結(jié)合區(qū)域，促進發(fā)現(xiàn)調(diào)控蛋白相互作用的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，為尋找藥物治療白內(nèi)障的靶點提供新的途徑.目前，已報道一些針對調(diào)控蛋白相互作用的藥物，如羊毛甾醇通過范德華力結(jié)合γD晶狀體蛋白的疏水界面，使蛋白聚集體發(fā)生解聚［86］及提高α晶狀體蛋白的分子伴侶活性.然而，蛋白質(zhì)相互作用的方式和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)極其復(fù)雜，依靠現(xiàn)有的分析技術(shù)得到的信息仍有限，需要有更先進的方法來捕捉晶狀體蛋白之間的瞬時相互作用.隨著識別蛋白相互作用結(jié)合區(qū)域新技術(shù)的不斷出現(xiàn)［87，88］，整合運用生物信息學(xué)方法，深入研究晶狀體蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的精確調(diào)控機制，將有助于開發(fā)有效的潛在抗白內(nèi)障藥物，從而開拓防治晶狀體渾濁的創(chuàng)新策略.

感謝浙江大學(xué)附屬二院眼科中心吳煒、徐靖杰和浙江大學(xué)附屬兒童醫(yī)院胡麗丹對本論文的寶貴建議.