PROX1通過上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌進(jìn)展

高 健， 敖永強(qiáng)， 張領(lǐng)先， 王 帥， 丁建勇*， 蔣家好*

1. 復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院胸外科，上海 230032 2. 南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院胸心外科，南昌 330006

肺癌是全球發(fā)病率最高的惡性腫瘤，同時(shí)也是腫瘤相關(guān)死亡的首要原因，每年約造成200萬例患者死亡[1]。臨床上通常把肺癌分為小細(xì)胞肺癌(small cell lung cancer, SCLC)和非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)，其中NSCLC約占85%[2]。盡管近幾年肺癌的診斷和治療方法取得很大進(jìn)步，但由于其早期轉(zhuǎn)移和高復(fù)發(fā)率，患者的5年生存率只有約20%[3-4]。因此，尋找準(zhǔn)確可靠的標(biāo)志物對(duì)于肺癌的早期診斷和治療，以及改善患者預(yù)后具有重要意義。

轉(zhuǎn)錄因子Prospero同源框1(Prospero-related homeobox 1，PROX1)是果蠅Prospero的同源物，可調(diào)節(jié)多種器官的發(fā)育[5]。最近的研究[6-10]表明，PROX1在多種腫瘤中發(fā)揮作用，但在不同類型的腫瘤中，其對(duì)腫瘤生物學(xué)行為的影響具有較大差異。PROX1在甲狀腺癌、乳腺癌、胃癌等腫瘤中發(fā)揮抑制作用，而在結(jié)直腸癌、腦膠質(zhì)瘤等惡性腫瘤中發(fā)揮促癌作用。然而，PROX1在NSCLC發(fā)生發(fā)展中的作用以及對(duì)預(yù)后的影響仍不清楚。本研究將進(jìn)一步探究PROX1對(duì)NSCLC生物學(xué)行為的影響及相關(guān)分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 研究樣本 收集2014年6月至2015年7月在復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院接受標(biāo)準(zhǔn)的108例肺葉切除術(shù)和縱隔淋巴結(jié)清掃術(shù)患者的108對(duì)NSCLC腫瘤和相應(yīng)的癌旁組織，用于制作組織芯片。患者相關(guān)臨床病理資料均從復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院數(shù)據(jù)庫中獲得，最后一次隨訪時(shí)間為2020年5月。本研究已通過復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院倫理委員會(huì)審查(Y2019-187)，所有患者均知情并簽署知情同意書。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞購買于中國科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所，培養(yǎng)條件：DMEM培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1%雙抗，于37℃含5%CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。病毒轉(zhuǎn)染：PROX1敲減的慢病毒由上海吉滿生物公司合成。敲減的序列：shPROX1-1為5′-TTT CCA GGA GCA ACC ATA ATT- 3′; shPROX1-2為5′-GGC TCT CCT TGT CGC TCA TAA- 3′。轉(zhuǎn)染時(shí)將細(xì)胞重懸計(jì)數(shù)后以2×105個(gè)/孔的密度鋪在6孔板內(nèi)，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，然后加入含有1×106TU/mL病毒的培養(yǎng)基3 mL，再加入5 μg/mL的polybrene，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后倒掉培養(yǎng)基，加入新的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后檢測(cè)PROX1蛋白表達(dá)情況。

1.3 免疫組化染色 組織芯片由上海芯超公司制作完成，組織芯片于60℃烘烤3 h，用二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ脫蠟后，用梯度乙醇(100%、95%、85%、75%)水化。后用過氧化氫孵育30 min，檸檬酸鈉修復(fù)高火15 min，山羊血清封閉1 h后加入PROX1一抗(1∶500，Abcam公司，英國)，4℃過夜后用辣根過氧化物酶孵育1 h后DAB染色，顯微鏡觀察染色深度至合適時(shí)終止顯色。蘇木精復(fù)染40 s，水洗20 min，然后逆乙醇梯度脫水，二甲苯Ⅱ和二甲苯Ⅰ各浸泡5 min后晾干，中性樹脂封片。免疫組化評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：染色強(qiáng)度(0，未染色；1，輕度染色；2，中度染色，3，強(qiáng)染色)以及染色密度(1，≤25%；2，26%～50%；3，51%～75%；4，>75%)。最終評(píng)分為染色強(qiáng)度+染色密度，得分≥4被定義為PROX1高表達(dá)組，得分≤3被定義為PROX1低表達(dá)組。

1.4 qRT-PCR 采用碧云天RNA提取柱提取RNA后，采用NanoDrop 2000測(cè)定RNA濃度并用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(翌圣生物科技股份有限公司，中國)將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。溫度條件：5 min，25℃；30 min，42℃；5 min；85℃。而后使用PCR儀(Applied Biosystems)進(jìn)行RT-qPCR。反應(yīng)條件：95℃，10 s；55～60℃，20 s；72℃，20 s，共40個(gè)循環(huán)。PROX1引物序列：F為CCC GTT ATG CCA GCT CCA ATA；R為CGT GCG TAC TTC TCC ATC TGA A。GAPDH引物序列：F為TCA GCA ATG CCT CCT GCA C; R為TGG CAT GGA CTG TGG TCA ATG。E-cadherin的引物序列：F為GAA CGC ATT GCC ACA TAC AC；R為GAA TTC GGG CTT GTT GTC AT。Vimentin的引物序列：F為TTG CCG TTG AAG CTG CTA ACT ACC；R為AAT CCT GCT CTC CTC GCC TTC C。

1.5 Western印跡法檢測(cè) 采用RIPA蛋白裂解液提取細(xì)胞總蛋白后，BCA法測(cè)定蛋白濃度，統(tǒng)一調(diào)整為4 μg/μL。蛋白上樣后進(jìn)行電泳(150 V，60 min)，而后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜(0.28 mA，1.5 h)，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，快速封閉液封閉20 min后一抗孵育(1∶1000)，4℃搖晃過夜，第2天用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育1 h，ECL發(fā)光顯影。

1.6 Transwell實(shí)驗(yàn)

1.6.1 遷移實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基重懸，向小室上層加入5×104個(gè)細(xì)胞，總體積為200 μL，下層加入正常培養(yǎng)基500 μL，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，后用4%多聚甲醛固定，1%結(jié)晶紫溶液染色，顯微鏡下拍照計(jì)數(shù)。

1.6.2 侵襲實(shí)驗(yàn) 小室上層鋪入60 μL(按1∶8稀釋)基質(zhì)膠后，放入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min。細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基重懸后，向小室上層加入1×105個(gè)細(xì)胞，約200 μL，下層加入正常培養(yǎng)基500 μL，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，后用4%多聚甲醛固定，1%結(jié)晶紫溶液染色，顯微鏡下拍照計(jì)數(shù)。

1.6.3 CCK-8實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞重懸計(jì)數(shù)后，96孔板內(nèi)每孔加入1 000個(gè)細(xì)胞，總體積為100 μL，孵育7 h后每孔加入10 μL的CCK-8溶液，繼續(xù)37℃培養(yǎng)2 h后用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處的吸光度，后每24 h測(cè)1次，連測(cè)4 d。

2 結(jié) 果

2.1 PROX1在NSCLC中的表達(dá) 結(jié)果(圖1)顯示：在108例NSCLC患者中，有55例(50.9%)腫瘤組織中PROX1高表達(dá)，并且在腫瘤中的表達(dá)高于對(duì)應(yīng)的癌旁組織。

圖1 PROX1在NSCLC及癌旁中的表達(dá)

2.2 PROX1高、低表達(dá)組的一般資料分析 結(jié)果(表1)顯示：腫瘤直徑和淋巴轉(zhuǎn)移在PROX1高低表達(dá)組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.003、0.042)，其他指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 PROX1高、低表達(dá)組的一般資料分析 n(%)

2.3 PROX1高、低表達(dá)組的預(yù)后分析 結(jié)果(圖2)顯示，高表達(dá)PROX1的NSCLC患者其5年復(fù)發(fā)率高于PROX1低表達(dá)組(70.9%vs50.9%，P=0.005)，而5年生存率低于PROX1低表達(dá)組(49.1%vs66%，P=0.016)。

圖2 PROX1高表達(dá)組和低表達(dá)組的復(fù)發(fā)和生存比較的生存曲線

2.4 NSCLC患者的預(yù)后Cox單因素和多因素分析 結(jié)果(表2、表3)顯示，淋巴轉(zhuǎn)移和PROX1的表達(dá)是影響NSCLC患者術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)和死亡風(fēng)險(xiǎn)的獨(dú)立影響因素(P<0.05)。

表2 NSCLC術(shù)后復(fù)發(fā)相關(guān)Cox單因素和多因素分析

表3 NSCLC患者術(shù)后生存相關(guān)Cox單因素和多因素分析

2.5 PROX1對(duì)NSCLC細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移作用 在A549細(xì)胞系中構(gòu)建了PROX1敲減模型，并且Western印跡法證實(shí)了PROX1在A549細(xì)胞系中被成功敲減(圖3A)。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖3B)表明，敲減PROX1后NSCLC細(xì)胞的增殖能力明顯減弱(P<0.01)。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖3C)表明，敲減PROX1后NSCLC細(xì)胞的侵襲和遷移能力明顯減弱(P<0.05)。因此，通過以上功能實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PROX1能夠促進(jìn)NSCLC細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。

圖3 體外驗(yàn)證敲減PROX1對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力的影響

2.6 PROX1對(duì)NSCLC的EMT變化的影響 Western印跡法和qRT-PCR結(jié)果(圖4A、4B)表明，當(dāng)敲減A549中的PROX1后，A549中的E-鈣黏著蛋白(E-cadhein)表達(dá)明顯升高而波形蛋白(vimentin)明顯降低(P<0.001)。證實(shí)PROX1可誘導(dǎo)NSCLC的EMT變化，從而導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展。

圖4 敲減PROX1后NSCLC中EMT標(biāo)志物表達(dá)的變化

3 討 論

目前有關(guān)PROX1在腫瘤發(fā)生發(fā)展中作用的研究很多[6-7, 9-10]。既往研究[11-12]顯示，PROX1在肝癌、前列腺癌等多個(gè)類型的腫瘤中促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，但是其在NSCLC中的臨床意義仍不明確，并且PROX1在NSCLC中相應(yīng)的功能和機(jī)制也有待進(jìn)一步探究。因此，本研究首次明確了PROX1在NSCLC中的功能和相關(guān)分子機(jī)制。通過對(duì)NSCLC患者的組織芯片進(jìn)行PROX1免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，在部分NSCLC患者中PROX1高表達(dá)，并且高表達(dá)PROX1的NSCLC患者其生存預(yù)后較低表達(dá)組差。進(jìn)一步通過功能實(shí)驗(yàn)證實(shí)了PROX1可以促進(jìn)NSCLC的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。在機(jī)制方面發(fā)現(xiàn)，EMT在PROX1參與NSCLC進(jìn)展中發(fā)揮著重要作用。

EMT是指從上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)變[13]。既往文獻(xiàn)[14]報(bào)道，EMT在胚胎發(fā)育、組織修復(fù)與纖維化以及腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，腫瘤細(xì)胞通過EMT變化顯著增強(qiáng)了其增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力。當(dāng)上皮細(xì)胞通過EMT獲得向周圍侵襲轉(zhuǎn)移能力的同時(shí)，細(xì)胞會(huì)部分喪失上皮標(biāo)志物，如E-鈣黏著蛋白，并獲間質(zhì)標(biāo)志物，如波形蛋白，因此這2個(gè)蛋白也是檢測(cè)腫瘤EMT變化的重要標(biāo)志物[15]。根據(jù)既往文獻(xiàn)[16]報(bào)道，EMT也是NSCLC發(fā)生發(fā)展過程中的重要機(jī)制，并且研究廣泛。在肝細(xì)胞肝癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌等腫瘤中已經(jīng)有很多關(guān)于PROX1通過促進(jìn)EMT促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的機(jī)制研究[11-12, 17]，并且報(bào)道顯示，PROX1也是預(yù)測(cè)腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的重要標(biāo)志物。PROX1過表達(dá)的細(xì)胞中，波形蛋白表達(dá)升高而E-鈣黏著蛋白表達(dá)下降；當(dāng)下調(diào)PROX1的表達(dá)時(shí)，E-鈣黏著蛋白表達(dá)上調(diào)而波形蛋白表達(dá)下降[10-12,18]。這與本研究結(jié)果一致，本研究中敲減NSCLC中的PROX1時(shí)，E-鈣黏著蛋白的表達(dá)升高而波形蛋白的表達(dá)明顯下降。因此，PROX1可能通過EMT過程促進(jìn)NSCLC的增殖、遷移和侵襲。

綜上所述，PROX1的表達(dá)與NSCLC的惡性程度相關(guān)，高表達(dá)PROX1的NSCLC患者預(yù)后更差，PROX1主要通過EMT促進(jìn)NSCLC的進(jìn)展。PROX1可能作為判斷NSCLC預(yù)后的可靠預(yù)測(cè)因子，同時(shí)也是潛在的治療靶點(diǎn)。

利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。