添加糖與醬油對油炸鱘魚晚期糖化終末產(chǎn)物形成的影響研究

劉芹邑，張 琪，安 婧，董士遠(yuǎn)

（中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島 266000）

食品加工中發(fā)生美拉德反應(yīng)所形成的潛在危害安全物質(zhì)如丙烯酰胺（acrylamide，AA）、雜環(huán)胺（heterocyclic amines，HAs）和晚期糖化終末產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs）等[1]已受到廣泛關(guān)注。AGEs是經(jīng)過美拉德反應(yīng)中期、后期階段形成的一類復(fù)雜化合物的總稱。近年來，羧甲基賴氨酸（N-ε-carboxymethyllysine，CML）、羧乙基賴氨酸（N-ε-carboxyethyllysine，CEL）作為食品AGEs標(biāo)志性產(chǎn)物備受關(guān)注，而甲基乙二醛氫咪唑酮（N-δ-(5-hydro-5-methyl-4-imidazolon-2-yl)-ornithine，MGH1）目前關(guān)注較少。美拉德反應(yīng)中期階段產(chǎn)生高活性醛類及二羰基化合物，包括乙二醛（Glyoxal, GO）、甲基乙二醛（Methylglyoxal, MGO）與賴氨酸側(cè)鏈共價結(jié)合形成 CML、CEL，MGO與精氨酸側(cè)鏈共價結(jié)合形成MG-H1[2]。目前大量證據(jù)表明，膳食AGEs易在體內(nèi)積累，與諸如動脈粥樣硬化、腎臟疾病等慢性疾病的發(fā)生相關(guān)[3-4]。

影響食品AGEs形成的因素主要包括食品成分、加工方式和加工輔料。食品中含有較高的蛋白、脂質(zhì)和糖類，高蛋白高脂肪食品AGEs相對含量高，低脂牛奶制品、蔬菜、水果等AGEs含量較少[5]。此外，一般來說，干熱加工對食品AGEs形成的促進(jìn)作用強(qiáng)于濕熱（蒸煮）加工[6-7]。蔗糖在受熱條件下可分解為葡萄糖和果糖衍生物，繼續(xù)受熱則會產(chǎn)生羰基化合物[8]，這些都是美拉德反應(yīng)前體物質(zhì)，為促進(jìn)AGEs的形成提供可能。Li等[9]通過使用微波加熱蔗糖-賴氨酸模式體系，證明美拉德反應(yīng)的產(chǎn)生且形成CML；Cerny等[10]發(fā)現(xiàn)蔗糖的添加有助于蛋氨酸-葡萄糖模式體系中葡萄糖降解以及Amadori產(chǎn)物形成；Liang等[11]發(fā)現(xiàn)蔗糖-賴氨酸模式體系初始摩爾比的增加可以顯著促進(jìn)吡咯素的形成。醬油本身含有一定量的AGEs前體物質(zhì)，Liu等[12]發(fā)現(xiàn)深色醬油MGO含量明顯高于蠔油，但GO含量低于醋和蠔油。醬油所含氨基肽氮較多[13]，添加到食品中可能促進(jìn)AGEs形成。Chao等[14]發(fā)現(xiàn)在肉類中添加醬油進(jìn)行烹飪后，CML和戊糖素顯著升高。

迄今為止，關(guān)于糖和醬油添加水平對食品AGEs形成影響的報道較少。鱘魚是我國主要淡水養(yǎng)殖魚類，其肉中蛋白質(zhì)含量高，富含必需氨基酸和多不飽和脂肪酸，相關(guān)鱘魚產(chǎn)品的開發(fā)受到越來越多的重視。本研究采用鱘魚為材料，通過添加不同比例的綿白糖和醬油并進(jìn)行油炸處理，首次系統(tǒng)探究綿白糖和醬油對油炸鱘魚AGEs及其前體物質(zhì)糠氨酸、二羰基化合物形成的影響，為油炸水產(chǎn)品AGEs形成和控制提供理論依據(jù)和技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

西伯利亞鱘、史氏鱘的雜交鱘魚（Acipenser baerii×Acipenser schrenckii） 青島市城陽區(qū)鱘魚養(yǎng)殖場，每條平均體重約1.5～2.5 kg，活鱘魚運(yùn)送至實驗室，去除魚頭、魚皮和魚骨，將魚肉攪碎備用；AGEs標(biāo)準(zhǔn)品：羧甲基賴氨酸（CML）、羧乙基賴氨酸（CEL）、甲基乙二醛氫咪唑酮（MG-H1）、D4-羧甲基賴氨酸（D4-CML）、D4-羧乙基賴氨酸（D4-CML）、D3-甲基乙二醛氫咪唑酮（D3-MG-H1） 純度均大于99%，加拿大TRC公司；甲醇（色譜純） 德國Merck公司；糠氨酸（Furosine）標(biāo)準(zhǔn)品 Neosystem Laboratoire公司；其他試劑 均為分析純或色譜純。

1290/6460液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Agilent公司；T18basic高速均質(zhì)分散機(jī) 德國IKA公司；GL-21M高速冷凍離心機(jī) 湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司；LC-20AT 高效液相色譜儀、UV-2550紫外可見分光光度計、F-4600熒光分光光度計 日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 鱘魚餅制備 將絞碎的鱘魚肉與1%食鹽混合均勻，按照表1加入調(diào)味料并攪拌均勻。調(diào)味料比例是根據(jù)預(yù)實驗添加調(diào)味料后鱘魚餅的滋味來確定的。隨后使用模具制作重量約40 g、直徑6.5 cm、厚度1 cm的鱘魚餅，設(shè)置對照組為不添加綿白糖和醬油的鱘魚餅。預(yù)實驗結(jié)果表明，在170 ℃油溫下油炸9 min的鱘魚餅品質(zhì)佳，故將鱘魚餅浸沒在170 ℃的大豆油油炸9 min，每隔90 s翻轉(zhuǎn)一次。油炸后的鱘魚餅經(jīng)冷卻、稱重、攪碎、混勻后儲存在-20 ℃以作進(jìn)一步分析。所以樣品均在3 h內(nèi)制備完畢。

表1 調(diào)味料添加比例（w/w，%）Table 1 Seasoning addition ratio(w/w, %)

1.2.2 糠氨酸含量測定 參照Tavares等[7]采用高效液相色譜法檢測油炸鱘魚餅糠氨酸含量變化。準(zhǔn)確稱取200 mg樣品于安瓿瓶中，加入2 mL 9 mol/L HCl并密封，在110 ℃酸解24 h。酸解液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾。取Sep-Park C18柱活化、平衡，取0.5 mL濾液經(jīng)由此柱凈化，并用3 mL 3 mol/L HCl洗脫，收集洗脫液。使用 Allitima C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱進(jìn)行分離分析。流動相A為0.4%乙酸水溶液，流動相B為含有0.3%氯化鉀的0.4%乙酸水溶液。采用等度洗脫，流動相A比例為98%，流動相B比例為2%，流速設(shè)定為1 mL/min，檢測波長為280 nm，柱溫為30 ℃。

1.2.3 甲基乙二醛（MGO）、乙二醛（GO）含量測定參照Zhu等[15]進(jìn)行二羰基化合物含量的測定。

1.2.3.1 樣品前處理 稱取1 g樣品添加10 mL水震蕩提取3 h，然后添加10 mL甲醇沉淀蛋白，并于5000 ×g離心20 min。取2 mL上清液，加入100 μL 40 mg/mL鄰苯二胺于60 ℃衍生2 h；添加2 mL 50%甲醇的水溶液，過0.22 μm濾膜于進(jìn)樣小瓶。標(biāo)準(zhǔn)品濃度設(shè)為0～0.25 μg/mL。

1.2.3.2 樣品的檢測 采用LC-MS/MS分析方法對樣品中MGO、GO含量進(jìn)行檢測。采用Symmetry C18（2.1×100 mm，3.5 μm）色譜柱，流動相A為0.1%甲酸甲醇，流動相B為0.1%甲酸水。流速為0.3 mL/min，流動相梯度設(shè)定如下：0～10 min，70%～40% B；10～12 min，40%～70% B；12～15 min，70% B。柱溫設(shè)定為30 ℃。質(zhì)譜采用電噴霧離子源（ESI），正離子掃描模式，多重反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM），監(jiān)測參數(shù)見表2。

表2 二羰基化合物多重反應(yīng)監(jiān)測參數(shù)Table 2 Mass spectrometric parameters for multiple reactions monitoring AGEs

1.2.4 熒光AGEs含量測定 參照 Delgado-Andrade等[16]的方法檢測油炸鱘魚餅熒光性AGEs含量變化。稱取4 g 樣品分散于20 mL 0.2 mol/L pH8.2 的磷酸鹽緩沖液中，然后加入40 μL堿性蛋白酶，并在55 ℃條件下恒溫水浴1 h。冷卻至室溫后，在8000×g條件下離心15 min，隨后取上清檢測熒光值，激發(fā)波長設(shè)定為347 nm，發(fā)射波長設(shè)定為415 nm，狹縫寬度設(shè)定為5 nm。以1 μg/mL的硫酸奎寧作為100%熒光強(qiáng)度，樣品熒光強(qiáng)度以AU/100 mg protein表示。

1.2.5 CML、CEL、MG-H1含量測定 參照Sun等[17]的方法檢測油炸鱘魚餅CML和CEL含量變化。

1.2.5.1 樣品預(yù)處理 取40 mg樣品于安瓿瓶中，加入0.4 mL、0.2 mol/L、pH9.2的硼酸鹽緩沖液和0.08 mL的2 mol/L硼氫化鈉溶液（以0.1 mol/L的NaOH配制），并在4 ℃條件下放置8 h，然后添加0.8 mL、6 mol/L HCl，并密封，在110 ℃條件下酸解24 h，并在60 ℃條件下干燥，隨后以2 mL超純水復(fù)溶。取Sep-Park MCX柱活化、平衡，取復(fù)溶液經(jīng)由此柱凈化，并用3 mL含有5%氨水的甲醇洗脫，收集洗脫液，使用0.22 μm濾膜過濾，待上機(jī)檢測。用濃度均為5 μg/mL的CML-d4、CEL-d4、MG-H1-d3、CML、CEL、MG-H1配制2 mL含0.05 μg/mL內(nèi)標(biāo)品的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

1.2.5.2 樣品檢測 采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（LCMS/MS）對所制得的樣品進(jìn)行檢測，使用HILIC Silica column（2.1×100 mm，3 μm）色譜柱對待測物進(jìn)行分離分析。流動相A為0.1%甲酸甲醇，流動相B為0.1%甲酸水。流速為0.2 mL/min，流動相梯度設(shè)定如下：0～3 min，20%～50% B；3～6 min，50%B；6～6.1 min，50%～20% B；6.1～12 min，20% B。柱溫設(shè)定為35 ℃。質(zhì)譜采用電噴霧離子源（ESI），正離子掃描模式，多重反應(yīng)監(jiān)測采集模式（MRM），采集參數(shù)見表3。

表3 AGEs 多重反應(yīng)監(jiān)測采集參數(shù)Table 3 Mass spectrometric parameters for multiple reactions monitoring AGEs

1.3 數(shù)據(jù)處理

本實驗設(shè)計的所有指標(biāo)均設(shè)計3個平行，實驗結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析利用R（v3.5.0）及R Studio（v1.1.453）軟件進(jìn)行，P＜0.05為有顯著差異。所有實驗均重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 添加綿白糖與醬油對油炸鱘魚餅糠氨酸含量的影響

糠氨酸是美拉德反應(yīng)前期的前體物質(zhì)Amadori產(chǎn)物經(jīng)過酸化水解而產(chǎn)生[18]，被認(rèn)為是評價食品加工熱處理強(qiáng)度的技術(shù)指標(biāo)[19]。醬油與綿白糖的添加對油炸鱘魚餅糠氨酸含量影響如圖1所示。油炸鱘魚餅糠氨酸含量隨綿白糖、醬油添加水平增加而增加。與Con相比，T1、T2、T3組糠氨酸含量由15.90 μg/100 mg protein顯著升高到26.49 μg/100 mg protein及以上（P＜0.05），這表明綿白糖的添加大大提高油炸鱘魚餅糠氨酸含量。蔗糖雖是非還原性糖，不能參與美拉德反應(yīng)，但其加熱后的分解產(chǎn)物之一為葡萄糖[20]，為美拉德反應(yīng)提供充足的反應(yīng)物。本團(tuán)隊的另一研究發(fā)現(xiàn)，與未添加糖粉的蝦餅相比，單獨(dú)添加3%糖粉的烘焙蝦餅和微波蝦餅糠氨酸含量分別增加33.3%和28.9%[21]。醬油中含有少量葡萄糖，因此添加醬油也會導(dǎo)致糠氨酸含量的增加。綿白糖與醬油同時添加則進(jìn)一步導(dǎo)致糠氨酸含量增加，最高可達(dá)55.88 μg/100 mg protein。方差分析顯示，綿白糖和醬油對糠氨酸含量均具有極顯著性影響（P＜0.01），綿白糖與醬油共同添加則產(chǎn)生顯著協(xié)同作用影響（P＜0.05），共同促進(jìn)糠氨酸產(chǎn)生。

圖1 醬油與綿白糖的添加對油炸鱘魚餅中糠氨酸含量的影響Fig.1 Effects of the addition of soy sauce and soft white sugar on furosine content in fried sturgeon patties

2.2 添加綿白糖與醬油對油炸鱘魚餅MGO、GO含量的影響

醬油與綿白糖的添加對油炸鱘魚餅中MGO、GO含量影響如圖2所示。T1、T2、T3組MGO、GO含量逐漸增加，表明僅添加綿白糖可促進(jìn)油炸鱘魚餅中MGO、GO的產(chǎn)生，且隨著添加量的增加逐漸增加。有研究表明蔗糖在加熱過程中會發(fā)生焦糖化反應(yīng)，并能夠?qū)⒔到猱a(chǎn)生二羰基化合物[22-23]。與對照相比，J1組MGO、GO含量顯著升高（P＜0.05），而J2組GO含量顯著降低（P＜0.05），表明1%醬油的添加促使油炸鱘魚餅中 MGO、GO形成；2%醬油的添加抑制GO形成。綿白糖與醬油共同添加時，MGO、GO含量呈現(xiàn)非線性變化。在綿白糖固定添加水平情況下，MGO、GO含量隨醬油添加水平增加而逐漸減少。方差分析顯示，綿白糖與醬油共同添加時產(chǎn)生交互作用影響（P＜0.05）。當(dāng)綿白糖添加量為3%、醬油添加量為1%時，MGO、GO含量最高分別為9.94 μg/g protein、2.73 μg/g protein?；旌咸砑訒r，與T1、T2、T3組相比，醬油減弱綿白糖對GO形成的促進(jìn)作用，當(dāng)醬油添加量為2%時抑制效果更加明顯。

圖2 醬油與綿白糖的添加對油炸鱘魚餅中MGO、GO含量的影響Fig.2 Effects of the addition of soy sauce and soft white sugar on MGO, GO content in fried sturgeon patties

2.3 添加綿白糖與醬油對油炸鱘魚餅熒光AGEs含量的影響

醬油與綿白糖的添加對油炸鱘魚餅熒光強(qiáng)度影響如圖3所示。油炸鱘魚餅熒光強(qiáng)度隨綿白糖或醬油添加量的增加而增加。J1、J2組熒光強(qiáng)度顯著高于T1、T2組（P＜0.05），表明醬油對油炸鱘魚餅熒光強(qiáng)度的提高效果高于綿白糖。綿白糖與醬油的共同添加進(jìn)一步提高油炸鱘魚餅中熒光強(qiáng)度。當(dāng)綿白糖添加量為3%、醬油添加量為2%時，熒光強(qiáng)度最高（28.17%/100 mg protein）。熒光AGEs形成途徑之一是氨基與還原糖反應(yīng)。因此，綿白糖促進(jìn)熒光AGEs形成的原因是其通過熱降解提供豐富的還原糖[22]，而醬油中豐富的氨基酸提供充足的游離氨基[24]，因此，無論是單獨(dú)添加還是組合添加均能導(dǎo)致熒光AGEs形成增加，且受添加量影響。另外，從前文得出，2%醬油的添加降低油炸鱘魚餅GO含量，推測醬油中的大部分游離氨基參與美拉德反應(yīng)時可能不形成二羰基化合物，而直接重排形成晚期糖化終末產(chǎn)物，從而促進(jìn)熒光AGEs產(chǎn)生。

圖3 醬油與綿白糖的添加對油炸鱘魚餅熒光強(qiáng)度的影響Fig.3 Effects of the addition of soy sauce and soft white sugar on fluorescence intensity in fried sturgeon patties

2.4 添加綿白糖與醬油對油炸鱘魚餅CML、CEL、MG-H1 含量的影響

醬油與綿白糖的添加對油炸鱘魚餅CML、CEL、MG-H1含量影響如圖4所示。綿白糖的添加促進(jìn)CML、CEL、MG-H1形成，而醬油的添加促進(jìn)CEL形成，卻降低CML、MG-H1形成。無醬油添加時，綿白糖的添加量對CML影響較大?；旌咸砑訒r，相較于綿白糖，醬油對CML形成的抑制效果占主導(dǎo)作用，而相較于醬油，綿白糖對MG-H1形成的促進(jìn)效果占主導(dǎo)作用。

圖4 醬油與綿白糖的添加對油炸鱘魚餅中CML、CEL、MG-H1含量的影響Fig.4 Effects of the addition of soy sauce and soft white sugar on CML, CEL, MG-H1 content in fried sturgeon patties

CML與CEL是賴氨酸衍生產(chǎn)物，MG-H1是精氨酸衍生產(chǎn)物[25]。CML可以通過Amadori產(chǎn)物氧化產(chǎn)生，也可通過GO與賴氨酸殘基反應(yīng)產(chǎn)生；CEL通過MGO與賴氨酸殘基反應(yīng)產(chǎn)生；MG-H1通過MGO與精氨酸殘基反應(yīng)產(chǎn)生[26]。作者研究發(fā)現(xiàn)，綿白糖添加導(dǎo)致MGO、GO形成增加，因此綿白糖的添加造成鱘魚餅CML、CEL、MG-H1含量增加。

油炸鱘魚餅中AGEs形成受醬油添加量的影響，主要表現(xiàn)為低水平醬油添加會使油炸鱘魚餅CML、CEL形成增加，高水平醬油添加會使油炸鱘魚餅CML、MG-H1形成減少。推測低濃度醬油中的游離氨基與食品體系中的游離羰基反應(yīng)并占主導(dǎo)作用，并且醬油中的游離氨基還能與MGO、GO反應(yīng)，使得部分AGEs含量升高，另外，醬油中多糖化合物的存在也可能促進(jìn)食品體系中美拉德反應(yīng)的發(fā)生；而醬油中同時含有豐富的大豆異黃酮等酚類化合物及抗氧化性肽，這些成分不僅能與食品體系產(chǎn)生的MGO、GO共價結(jié)合導(dǎo)致MGO、GO含量下降，其本身還具有一定的DPPH自由基清除能力和抗氧化能力[27-28]，有助于抑制食品體系中AGEs形成。與本研究相似，根據(jù)Mashilipa等[29]報道，醬油可以通過抗氧化、螯合金屬離子等作用抑制AGEs形成；Ham等[27]發(fā)現(xiàn)醬油的Fe2+螯合活性和DPPH自由基清除活性可能是防止熟牛肉餅脂質(zhì)氧化的主要機(jī)制，而脂質(zhì)氧化正是AGEs形成途徑之一。從前文可知，高水平醬油添加抑制GO的形成，推測醬油通過抑制GO與賴氨酸殘基反應(yīng)途徑從而造成CML含量降低。另外，AGEs的形成包含有多條途徑，包括美拉德反應(yīng)、脂質(zhì)氧化、糖降解[30]，作者推測，醬油對多條AGEs形成途徑的影響效應(yīng)是不同的，從而導(dǎo)致添加醬油后三種AGEs呈現(xiàn)不同的變化趨勢。

當(dāng)綿白糖與醬油混合添加時，醬油減弱綿白糖對GO、CML的促進(jìn)效果，使GO和CML的形成受到抑制，推測由于醬油中的酚類物質(zhì)及抗氧化肽在GO形成途徑中與GO共價結(jié)合，而綿白糖降解產(chǎn)生GO的速度要慢于GO被共價結(jié)合的速度，因此同時添加會使GO含量降低，從而使CML含量降低。

3 結(jié)論

綿白糖或醬油的添加對油炸鱘魚餅AGEs形成有影響，且兩者共同添加對油炸鱘魚餅AGEs含量具有顯著交互作用（P＜0.05）。綿白糖的添加提高油炸鱘魚餅AGEs（CML、CEL、MG-H1）及其前體物（糠氨酸、MGO、GO）含量，且綿白糖添加量與油炸鱘魚餅AGEs及其前體物含量呈正相關(guān)，表明綿白糖在油炸魚餅過程發(fā)生降解產(chǎn)生醛類物質(zhì)和二羰基化合物，從而促進(jìn)AGEs的形成。醬油的添加增加鱘魚餅糠氨酸、熒光AGEs、CEL含量，但降低油炸鱘魚餅CML、MG-H1含量，1%醬油的添加促進(jìn)油炸鱘魚餅MGO、GO產(chǎn)生，而2%醬油的添加降低油炸鱘魚餅GO產(chǎn)生。綿白糖和醬油共同添加進(jìn)一步促進(jìn)油炸鱘魚餅糠氨酸、熒光AGEs、MG-H1含量增加，而醬油對GO、CML形成的抑制占主導(dǎo)作用。

綜上，在鱘魚餅油炸過程中，添加過多的綿白糖會較大促進(jìn)晚期糖化終末產(chǎn)物的形成，醬油由于其復(fù)雜成分導(dǎo)致其添加對不同AGEs標(biāo)志物形成影響各異。因此，建議未來研究應(yīng)關(guān)注調(diào)味料對魚加工食品AGEs形成機(jī)制方面的研究。