桑葚中黃酮提取方法比較與優(yōu)化及穩(wěn)定性研究

李慧，劉俊果，馮方圓，秦玲，康文懷

(河北科技大學 食品與生物學院，河北 石家莊 050018)

桑葚(MorusalbaL.)是?？浦参锷涞墓麑?，富含多糖、黃酮、多酚等，具有提高免疫力、抗心律不齊等作用[1-4]。目前桑葚花色素苷、多糖等研究較多[5-6]，桑葚中黃酮的報道較少。常見的黃酮提取方法有水提法[7]、堿提酸沉法[8]、有機溶劑法[9]、酶解法[10]和超聲輔助法等[11-12]，但對黃酮穩(wěn)定性研究極少[13]。

本研究比較了不同方法提取桑葚黃酮的效果，并優(yōu)化桑葚黃酮的提取工藝。探討pH值、食品添加劑(苯甲酸鈉、檸檬酸、抗壞血酸)、貯存溫度、貯存時間對桑葚黃酮穩(wěn)定性的影響，以期為桑葚黃酮的提取及穩(wěn)定性研究提供依據(jù)，為我國桑葚產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供技術(shù)支撐。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

桑葚為“黑珍珠”新鮮果實，于2019年5月采自河北省滄州市;蘆丁，色譜純；纖維素酶、果膠酶、淀粉酶均為生化試劑；無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、檸檬酸、抗壞血酸、苯甲酸鈉均為分析純。

UV-5800紫外可見分光光度計；ME104E電子天平；DK-98-Ⅱ恒溫水浴鍋；KQ3200E超聲波清洗器；HPS-3E pH計。

1.2 桑葚黃酮提取

桑葚鮮果→破碎、勻漿→稱取果漿→70 ℃水浴浸提2 h(或超聲輔助水浴浸提)→過濾→提取液濃縮→乙醇定容→桑葚黃酮檢測。

以乙醇法和酶解法為對照組(CK)，超聲輔助法為實驗組(T)，乙醇法設計1個處理,即50%乙醇(v/v)提取，酶解法設計3個處理，即果膠酶酶解、纖維素酶酶解、復合酶酶解。分別對4個處理加以超聲輔助。酶解處理浸提液為磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液。超聲提取溫度40 ℃，超聲時間 30 min。以NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法測定桑葚黃酮含量(以蘆丁計)[14-15]。

1.3 桑葚黃酮穩(wěn)定性研究

1.3.1 pH對桑葚黃酮的影響 分別取桑葚黃酮5 mL， 調(diào)節(jié)pH分別為1.0，3.0，5.0，7.0，9.0，11.0，室溫條件避光保存6 h后，測定其黃酮含量。

1.3.2 食品添加劑對桑葚黃酮的影響 在桑葚黃酮中添加苯甲酸鈉、檸檬酸和抗壞血酸，參考《食品安全國家標準》，設置苯甲酸鈉的質(zhì)量分數(shù)分別為0.05%，0.10%，0.15%，0.20%，0.25%；檸檬酸和抗壞血酸質(zhì)量分數(shù)分別為0.05%，0.10%，0.15%，0.20%，0.25%，待測液于室溫下避光保存6 h后檢測桑葚黃酮含量，探究食品添加劑對桑葚黃酮穩(wěn)定性的影響[13]。

1.3.3 貯存溫度、貯存時間對桑葚黃酮的影響 設置常中高溫(20，40，60 ℃)和低溫(4,20 ℃)兩種條件，在不同時間測定黃酮含量，比較研究貯存溫度、時間對桑葚黃酮穩(wěn)定性的影響。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實驗重復3次，采用SPSS17.0和Origin8.0對數(shù)據(jù)進行相關(guān)分析處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取方法比較

提取方法對黃酮含量的影響見圖1。

由圖1可知，在未輔助超聲的條件下，乙醇提取測得桑葚黃酮含量為0.83 mg/g，優(yōu)于果膠酶、纖維素酶、復合酶酶解法，在3種酶解處理中，復合酶的提取效果最佳，含量達到0.70 mg/g，其次是纖維素酶，含量為0.70 mg/g，含量最低的為果膠酶，僅有0.67 mg/g。與對照組相比，超聲輔助條件下4種方法(乙醇、果膠酶、纖維素酶、復合酶)的桑葚黃酮含量分別提高了1.1%，11.1%，8.4%，9.1%，究其原因為超聲的空穴作用有利于桑葚黃酮的溶出[16-18]；不同酶解在超聲及未超聲條件下的提取效果均次于乙醇，這可能與浸提液有關(guān)。乙醇提取法與超聲輔助法相比，提取效率高，且乙醇提取法可節(jié)約成本和時間，因此對乙醇提取法優(yōu)化其提取條件。

圖1 不同提取方法下桑葚黃酮含量Fig.1 Content of flavonoids in mulberry under different extraction methods

2.2 乙醇提取法單因素實驗

2.2.1 溫度的影響 浸提溫度對桑葚黃酮含量的影響見圖2。

圖2 浸提溫度對桑葚黃酮含量的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on the content of flavonoids in mulberry

由圖2可知，在50～70 ℃時，桑葚總黃酮提取含量上升緩慢；70～80 ℃時，桑葚黃酮類化合物含量呈現(xiàn)迅速上升狀態(tài)，80 ℃時，桑葚總黃酮含量最高，達到了1.11 mg/g；但繼續(xù)升溫至90 ℃時，桑葚黃酮含量迅速降低，這說明高溫可能會造成桑葚黃酮分解。

2.2.2 時間的影響 浸提時間對黃酮含量的影響見圖3。

由圖3可知，桑葚黃酮含量隨時間的延長呈上升趨勢，>120 min后，上升趨勢減緩，且趨于平穩(wěn)，桑葚黃酮的含量變化不明顯，這可能是隨著提取時間延長，植物細胞中雜質(zhì)溶出，增加了提取難度；另一方面，有桑葚黃酮分解的可能。綜合考慮，提取時間最優(yōu)為120 min。

圖3 浸提時間對桑葚黃酮含量的影響Fig.3 Effect of extraction time on the content of flavonoids in mulberry

2.2.3 乙醇濃度的影響 由圖4可知，隨著乙醇體積分數(shù)的增加桑葚總黃酮含量呈先升高后下降趨勢，乙醇體積分數(shù)>70%時，桑葚黃酮含量反而呈下降趨勢，這可能是提取溶液的極性影響桑葚黃酮提取效果，乙醇體積分數(shù)為70% 時，桑葚黃酮含量最高，為1.05 mg/g。

圖4 乙醇體積分數(shù)對桑葚黃酮含量的影響Fig.4 Effect of ethanol volume fraction on the content of flavonoids in mulberry

2.3 正交實驗優(yōu)化[19-20]

在單因素實驗的基礎上，設計正交實驗對桑葚黃酮提取條件進行優(yōu)化。因素、水平見表1，結(jié)果見表2。

表1 正交實驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

由表2可知，影響桑葚黃酮提取效果的各因素主次順序是A=B>C，即時間和溫度對桑葚黃酮含量都有較大影響，乙醇體積分數(shù)次之。 乙醇提取法最優(yōu)組合是A1B2C3，即浸提溫度70 ℃，浸提時間120 min，乙醇體積分數(shù)80%。在最優(yōu)條件下對桑葚提取工藝進行驗證，桑葚黃酮提取量為1.19 mg/g，說明上述條件最優(yōu)。

表2 正交實驗結(jié)果Table 2 Orthogonal experimental results

2.4 貯存條件對桑葚黃酮穩(wěn)定性的影響[21]

2.4.1 pH對桑葚黃酮穩(wěn)定性影響 pH值對黃酮含量的影響見圖5。

圖5 pH值對桑葚黃酮穩(wěn)定性的影響Fig.5 Effect of pH value on the stability of flavonoids in mulberry

由圖5可知，在pH值為1,3,9,11時，黃酮含量較低；在pH值為5,7時，黃酮含量較高，分別達到0.75,0.73 mg/g 。在強酸強堿條件下，黃酮含量低，性質(zhì)不穩(wěn)定，強酸導致黃酮結(jié)構(gòu)變化，堿性環(huán)境，黃酮會發(fā)生酚羥基醚化[9]。因此桑葚黃酮宜在pH=5～7條件下保存。

2.4.2 食品添加劑對桑葚黃酮穩(wěn)定性的影響 苯甲酸鈉是一種廣譜性抑菌劑，是常用的食品添加劑；抗壞血酸是常見的抗氧化劑，可消耗氧氣使目標物不被氧化；檸檬酸是一種酸味劑，有輔助防腐的作用。實驗研究了這3種添加劑對桑葚黃酮穩(wěn)定性的影響。

由圖6可知，桑葚黃酮含量隨著苯甲酸鈉添加量增大變化不明顯，因此在桑葚黃酮保存過程中可適當添加或不添加。桑葚黃酮含量隨著抗壞血酸用量的增大而升高，這是因為抗壞血酸含量高時其抗氧化作用強，能保護桑葚黃酮不被快速氧化分解的緣故。桑葚黃酮含量隨檸檬酸用量的增大而降低，這可能與檸檬酸含有多個H+有關(guān)。

圖6 食品添加劑對桑葚黃酮穩(wěn)定性的影響Fig.6 Effect of food additives on the stability of flavonoids in mulberryA.苯甲酸鈉對桑葚黃酮穩(wěn)定性的影響；B.檸檬酸和抗壞血酸對桑葚黃酮穩(wěn)定性的影響

綜上，在桑葚黃酮保存過程中，可適當添加抗壞血酸，提高其穩(wěn)定性。

2.4.3 貯存溫度、貯存時間對桑葚黃酮穩(wěn)定性的影響 不同貯存溫度條件下、不同時間內(nèi)，桑葚黃酮隨時間變化趨勢見圖7。

由圖7(A)可知，在20，40，60 ℃時，黃酮含量隨時間變化均呈下降趨勢，不同貯存溫度間差異不明顯。常中高溫條件下，在0～9 h內(nèi)，黃酮含量變化不明顯，性質(zhì)較為穩(wěn)定；而在9～12 h內(nèi)，其下降趨勢明顯。由圖7(B)可知，桑葚黃酮在4 ℃保存過程中，24 h 內(nèi)下降趨勢緩慢，24 h后，桑葚黃酮含量急劇下降；在-20 ℃條件下，36 h內(nèi)含量基本不變，36 h后才有下降趨勢。因此，桑葚黃酮宜低溫保存。

圖7 溫度、時間對桑葚黃酮穩(wěn)定性的影響Fig.7 Effect of temperature and time on the stability of flavonoids in mulberryA.常中高溫;B.低溫

3 結(jié)論

(1)采用乙醇法、酶解法及超聲輔助法提取桑葚黃酮，實驗表明，在超聲輔助下，黃酮含量有一定程度升高；在未使用超聲輔助時，乙醇提取的黃酮含量明顯高于酶解提?。?種酶解提取中復合酶最優(yōu)，纖維素酶次之，果膠酶較差，綜合考慮，最適于桑葚黃酮的方法是乙醇提取，最優(yōu)提取條件為：溫度70 ℃， 時間120 min，乙醇體積分數(shù)80%。此時桑葚黃酮含量可達到1.19 mg/g。

(2)在pH為5～7條件下，桑葚黃酮穩(wěn)定，強酸強堿均會破壞桑葚黃酮結(jié)構(gòu)導致其含量降低；添加苯甲酸鈉，對黃酮穩(wěn)定性無影響[21]；添加檸檬酸會造成桑葚黃酮含量降低；抗壞血酸因其抗氧化作用對桑葚黃酮有保護作用，有益于桑葚黃酮穩(wěn)定性。因此，在貯存過程中可適量添加抗壞血酸、少添加或不添加苯甲酸鈉。

(3)短時間內(nèi)，桑葚黃酮在常中高溫和低溫條件下均不易分解，隨著時間延長，常中高溫下桑葚黃酮含量下降明顯呈現(xiàn)出不穩(wěn)定性，低溫環(huán)境則穩(wěn)定性較好，因此低溫有利于桑葚黃酮穩(wěn)定性。