氣相色譜法測定葡萄酒中甜蜜素的條件優(yōu)化

鄒大松，向雅潔，鄒昌新

（1.公安縣公共檢驗(yàn)檢測中心，湖北 荊州 434300 ；2.松滋市公共檢驗(yàn)檢測中心，湖北 松 滋 434200；3.松滋市劉家場鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)技術(shù)服務(wù)中心，湖北 松滋434217；4.松滋市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，湖北 松滋 434200）

甜蜜素的化學(xué)名稱為環(huán)己基氨基磺酸鈉，化學(xué)式為C6H11NHSO3Na，于1937 年被Sveda 發(fā)現(xiàn)。由于其甜度遠(yuǎn)高于蔗糖，于是早在1950 年就被當(dāng)作食品甜味劑推廣使用[1-4]。但是關(guān)于甜蜜素作為食品添加劑使用是否對(duì)人體有害這一課題在國際還沒有定論，部分國家全面禁止食品中添加甜蜜素，還有部分國家則是嚴(yán)格限量控制食品中的甜蜜素含量。最新的文獻(xiàn)資料表明，甜蜜素當(dāng)作食品添加劑來使用被人體吸收后，會(huì)給人體骨細(xì)胞正常運(yùn)轉(zhuǎn)帶來負(fù)面影響，尤其是經(jīng)常攝入富含甜蜜素的食品會(huì)對(duì)人體（尤其是排毒能力差老幼群體）肝臟系統(tǒng)造成不良影響。

葡萄酒是用新鮮的葡萄或葡萄汁經(jīng)完全或部分發(fā)酵釀成的酒精飲料，因其營養(yǎng)價(jià)值較高、口感獨(dú)特、酒精含量相對(duì)白酒要低，故廣受消費(fèi)者的青睞。近年來，隨著人們對(duì)食品安全的日漸關(guān)注，相關(guān)部門加強(qiáng)了對(duì)食品衛(wèi)生安全的監(jiān)管，要求各生產(chǎn)企業(yè)嚴(yán)格按照國家標(biāo)準(zhǔn)控制食品中的各種添加劑用量，并不定期抽檢，曝光了一些不法行為。例如，2019 年河南工商部門對(duì)登封市美真宜商貿(mào)有限公司崇高路店銷售的馬峪川甜紅葡萄酒進(jìn)行檢測，查出甜蜜素含量超出國家限量標(biāo)準(zhǔn)。

目前測定食品中甜蜜素含量的方法很多，主要有氣相色譜法、液相色譜法、薄層色譜法、重量法等[5-8]。研究采用氣相色譜法測定葡萄酒中甜蜜素含量，對(duì)樣品前處理?xiàng)l件進(jìn)行了優(yōu)化，以期為同類樣品的甜蜜素分析測定提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)儀器Agilent 7890B 氣相色譜儀，帶FID的檢測器，美國安捷倫公司；UPH 超純水機(jī)，成都優(yōu)普公司；GZX-101-1-BS 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，深圳博泰公司；UMV-1 渦旋振蕩器，北京優(yōu)晟公司；204E 天平，規(guī)格0.000 1 g，美國梅特勒托利多公司。

1.1.2 試驗(yàn)試劑甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)溶液，BW12371-1，含量1 000 mg/mL，北京萬佳首化生物科技有限公司；硫酸，優(yōu)級(jí)純，中國醫(yī)藥集團(tuán)有限公司；亞硝酸鈉，分析純，中國醫(yī)藥集團(tuán)有限公司；氫氧化鈉，分析純，中國醫(yī)藥集團(tuán)有限公司；正庚烷，分析純，中國醫(yī)藥集團(tuán)有限公司；氯化鈉，分析純，中國醫(yī)藥集團(tuán)有限公司；葡萄酒（市場購買），275 mL，酒精含量3.5%，香港新動(dòng)力公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配置將1 000 mg/mL 甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)溶液的母液按照GB5009.97—2016[9]中的方法配制成為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mg/L 的梯度標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用。

1.2.2 葡萄酒樣品前處理及條件優(yōu)化（1）水浴除酒精和二氧化碳：用天平準(zhǔn)確稱取25.0 g 葡萄酒樣品到燒杯中，先用氫氧化鈉溶液（40 g/L）將葡萄酒樣品的pH 調(diào)至7～8；置于60℃水浴中處理30 min，以去除葡萄酒中的酒精與二氧化碳；將水浴后的葡萄酒放置到常溫，用超純水定容到50 mL，備用。（2）衍生化反應(yīng)：分別向去除酒精和二氧化碳的葡萄酒溶液中加入5.0 mL 正庚烷、2.5 mL 亞硝酸鈉溶液（50 g/L）以及2.5 mL 硫酸溶液，水浴反應(yīng)30 min；加入2.5 g 氯化鈉，采用渦旋混合器充分混勻；高速離心分層后取上清液待測[10-14]。該研究重點(diǎn)優(yōu)化了葡萄酒樣品衍生化反應(yīng)的條件，包括硫酸濃度（50、100、150、200、250 g/L）、水浴溫度（10、20、30、40、50℃）和渦旋振蕩時(shí)間（20、40、60、80、100、120 s），得出最佳衍生化反應(yīng)條件。

1.2.3 色譜參數(shù)參考GB5009.97—2016 中色譜條件相關(guān)參數(shù)，使用DB-1 弱極性毛細(xì)色譜柱。檢測器選擇為FID；分流進(jìn)樣，分流比為30 ∶1；進(jìn)樣口溫度230℃；進(jìn)樣量體積為1 μL；色譜柱選擇程序升溫，先以5℃/min 的速度從65℃升溫至85℃，然后以18℃/min 的速度升溫至220℃，在220℃下保持10 min。

1.2.4 方法驗(yàn)證（1）精密度檢驗(yàn)：將同1 次葡萄酒樣品連續(xù)使用氣相色譜檢測7 次，考察方法的精密度。（2）加標(biāo)回收率檢驗(yàn)：在葡萄酒樣品中分別加入100、150 及200 μL 10.00 mg/mL 的甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照優(yōu)化后的衍生化反應(yīng)條件進(jìn)行衍生化，然后上機(jī)檢測，考察樣品的加標(biāo)回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 衍生化反應(yīng)條件優(yōu)化

2.1.1 最佳硫酸濃度從圖1 可以看出，當(dāng)硫酸濃度在在50～150 g/L 區(qū)間內(nèi)，甜蜜素的峰面積與硫酸濃度呈正相關(guān)性，即隨著硫酸濃度的升高，峰面積增加；當(dāng)硫酸濃度在150～250 g/L 區(qū)間內(nèi)，甜蜜素的峰面積呈緩慢下降趨勢(shì)；當(dāng)硫酸濃度為150 g/L 時(shí)，檢測到的甜蜜素峰面積最大。葡萄酒樣品處理中加入硫酸的目的是讓衍生化反應(yīng)處于有利的酸性環(huán)境，同時(shí)硫酸能促進(jìn)葡萄酒樣品中的亞硝酸鈉反應(yīng)為亞硝酸，并為衍生化反應(yīng)帶來羥基促進(jìn)最終產(chǎn)物的合成[15]。試驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)硫酸濃度為150 g/L 時(shí)，最有利于甜蜜素衍生反應(yīng)的進(jìn)行。

圖1 不同濃度硫酸處理甜蜜素的峰面積

2.1.2 最適水浴溫度由圖2 可知，甜蜜素的峰面積與水浴溫度呈正相關(guān)性，即隨著水浴溫度的升高，甜蜜素的峰面積增加；尤其當(dāng)水浴溫度從10℃上升到30℃時(shí)，甜蜜素峰面積增加顯著，而當(dāng)水浴溫度由30℃上升到50℃時(shí)，甜蜜素峰面積增加值趨于穩(wěn)定。葡萄酒樣品衍生化反應(yīng)的原理是甜蜜素在酸性環(huán)境下先生成環(huán)己胺，然后環(huán)己胺與亞硝酸反應(yīng)結(jié)合為重氮鹽，但是重氮鹽在溫度較高時(shí)容易自我分解生產(chǎn)氮?dú)鈁16]。在試驗(yàn)過程中，當(dāng)溫度達(dá)到30℃及以上時(shí)，重氮鹽的結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，產(chǎn)生大量氣體，溫度越高反應(yīng)越劇烈，導(dǎo)致葡萄酒樣品的溶液隨著氣體產(chǎn)生形成飛濺，造成樣品中甜蜜素含量的部分損失。因此，葡萄酒樣品前處理法中衍生化反應(yīng)的最適水浴溫度為30℃。

圖2 不同水浴溫度處理甜蜜素的峰面積

2.1.3 最佳渦旋振蕩時(shí)間從圖3 可以看出，甜蜜素峰面積與渦旋振蕩時(shí)間呈正相關(guān)性，即隨著渦旋振蕩時(shí)間的延長，峰面積增加；當(dāng)渦旋振蕩時(shí)間在20～80 s 范圍內(nèi)時(shí)，峰面積與渦旋振蕩時(shí)間的相關(guān)性較為明顯，渦旋振蕩處理80 s，甜蜜素的峰面積最大；而當(dāng)渦旋振蕩時(shí)間在80～120 s 區(qū)間時(shí)，峰面積與渦旋振蕩時(shí)間的相關(guān)性趨于平穩(wěn)[17]。在實(shí)際操作過程中，從節(jié)約時(shí)間與節(jié)省資源的角度考慮，以渦旋振蕩處理80 s，最有利于甜蜜素衍生化反應(yīng)的進(jìn)行。

圖3 不同渦旋振蕩時(shí)間處理的甜蜜素峰面積

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及色譜圖

如圖4 所示，該檢測方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=5 220.3x+ 989.03，R2=0.999 6 ＞0.995，可以滿足試驗(yàn)要求。衍生化反應(yīng)條件優(yōu)化后，葡萄酒樣品中的甜蜜素色譜峰如圖5 所示，各物質(zhì)的分離度較好，不存在相互干擾，且峰型完整，甜蜜素的保留時(shí)間為5.387 min。

圖4 甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖5 葡萄酒樣品的甜蜜素色譜圖

2.3 精密度檢驗(yàn)

精密度試驗(yàn)結(jié)果顯示，7 次測定的峰面積平均值為10 837.6，標(biāo)準(zhǔn)偏差為475.4，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差為4.4%，小于5%，表明該檢測方法滿足試驗(yàn)要求。

2.4 加標(biāo)回收率檢驗(yàn)

由表1 可知，甜蜜素的回收率在90%～110%之間，符合試驗(yàn)要求。

表 1 甜蜜素的加標(biāo)回收率檢驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié) 論

由于供試葡萄酒樣品種類較為單一，所有樣品中測得的甜蜜素含量均低于儀器與方法的檢出限，為了便于研究的開展，采用樣品加標(biāo)法[18-20]在購買的葡萄酒樣品中加入了10.00 mg/mL 甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)溶液200 μL。

該研究以葡萄酒樣品中的甜蜜素為對(duì)象，參考GB5009.97—2016 中的儀器配置、試驗(yàn)條件、前處理法以及衍生法的相關(guān)要求，優(yōu)化了衍生化反應(yīng)中的硫酸濃度、水浴溫度和渦旋振蕩這3 個(gè)參數(shù)。結(jié)果表明：葡萄酒樣品中甜蜜素的最佳衍生化反應(yīng)條件為硫酸濃度150 g/L、水浴溫度30℃、渦旋振蕩時(shí)間80 s，采用氣相色譜法獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=5 220.3x+ 989.03，R2=0.999 6 ＞0.995；對(duì)同1 樣品進(jìn)行7 次測定，峰面積的平均值為10 837.6，標(biāo)準(zhǔn)偏差為475.4，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差為4.4%，小于5%，加標(biāo)回收率在90%～110%之間，表明該研究建立的葡萄酒中甜蜜素含量的氣相色譜檢測方法重現(xiàn)性好、精密度高，符合分析檢測要求，可應(yīng)用于同類樣品的甜蜜素分析檢測。