同位素稀釋液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)血清睪酮候選參考方法的建立及應(yīng)用

孫賀偉， 居 漪， 朱嶺峰， 李 卿， 金中凎， 張素潔

（上海市臨床檢驗(yàn)中心，上海 200126 ）

睪酮是一種類(lèi)固醇類(lèi)激素，由膽固醇經(jīng)一系列酶促反應(yīng)生成。準(zhǔn)確的睪酮檢測(cè)結(jié)果有助于男性性腺功能減退、腫瘤[1-2]和女性多囊卵巢綜合征[3]等疾病的診斷。目前，血清睪酮檢測(cè)多采用免疫學(xué)方法。臨床常規(guī)方法在檢測(cè)正常男性血清睪酮水平時(shí)具有較好的準(zhǔn)確性，但在檢測(cè)女性或兒童血清睪酮水平時(shí)并不準(zhǔn)確[4]。因此，要想實(shí)現(xiàn)血清睪酮檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)化就必須建立參考方法。目前，德國(guó)臨床化學(xué)和檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)學(xué)會(huì)[5]、比利時(shí)根特大學(xué)[6]已建立了基于氣相色譜質(zhì)譜的參考方法；美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和技術(shù)研究院（the National Institute of Standards and Technology，NIST）[7]和美國(guó)疾病預(yù)防控制中心（the Centers for Disease Control and Prevention，CDC）[8]建立了基于液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography tandem mass spectrometry，LCMS/MS）的參考方法。在此基礎(chǔ)上，本研究擬建立一種基于同位素稀釋液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（isotope dilution liquid chromatography tandem mass spectrometry，ID-LC-MS/MS）的精密度、準(zhǔn)確度均良好，操作簡(jiǎn)便的候選參考方法，并對(duì)該方法的檢測(cè)性能進(jìn)行評(píng)價(jià)，同時(shí)采用該方法對(duì)臨床常規(guī)檢測(cè)方法（微粒子化學(xué)發(fā)光法）進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

LC-MS/MS檢測(cè)系統(tǒng)由5500 QTRP串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國(guó)SCIEX公司）和Agilent1290UPLC液相色譜系統(tǒng)（美國(guó)Agilent公司）組成。Vortex-2渦旋混合器（美國(guó)Scientific Industries公司），5424R冷凍高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司），TS-18824氮吹儀（美國(guó)ThermoFisher Scientific公司），Access 2全自動(dòng)微粒子化學(xué)發(fā)光免疫分析儀（美國(guó)Beckman Coulter公司）及配套睪酮檢測(cè)試劑（微粒子化學(xué)發(fā)光法）。睪酮標(biāo)準(zhǔn)品（純度99%）購(gòu)自德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司；睪酮同位素內(nèi)標(biāo)（睪酮-2，3，4-13C3）購(gòu)自美國(guó)Cerilliant公司[（100.0±0.5）μg/mL]；甲酸（質(zhì)譜純）、正已烷（質(zhì)譜純）、乙酸乙酯（質(zhì)譜純）、乙腈（質(zhì)譜純）均購(gòu)自美國(guó)ThermoFisher Scientific公司。實(shí)驗(yàn)用水由本實(shí)驗(yàn)室采用Millipore純水系統(tǒng)自制（18.2 MΩ）。

1.2 方法

1.2.1 色譜分析條件 分析柱為Kinetex XB C18 100A柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm，美國(guó)Phenomenex公司）；流動(dòng)相A為0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B為0.1%甲酸乙腈溶液，梯度洗脫（0～0.50 min 10%B；0.51～3.00 min 10%～100%B；3.01～4.50 min 100%B；4.51～6.00 min 10%B），流速為0.3 mL/min，進(jìn)樣體積為10 μL。

1.2.2 質(zhì)譜分析條件 電噴霧電離（electrospray ionization，ESI）離子源，正離子模式。噴霧氣為65，輔助加熱氣為65，氣簾氣為30，碰撞氣為中等，離子源電壓為5 500 V，離子源溫度為400 ℃。多反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描分析睪酮的離子通道選擇分別為289.2/97.1 amu、289.2/109.1 amu，睪酮同位素內(nèi)標(biāo)為292.2/100.1 amu、292.2/112.1 amu。

1.2.3 樣本處理 吸取100～300 μL血清，加入內(nèi)標(biāo)工作液（10 ng/mL），使得睪酮與內(nèi)標(biāo)的質(zhì)量比為1∶1，室溫平衡1 h，再加入1 mL正已烷-乙酸乙酯（V∶V=1∶1）溶液，渦旋振蕩10 min，然后14 087×g離心5 min，取上清液，30 ℃吹干，加入200 μL 50%乙腈重組，渦旋混勻2 min后，吸取100 μL轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣瓶，上機(jī)分析。

1.2.4 儲(chǔ)備液及工作液配制 睪酮和同位素內(nèi)標(biāo)均用甲醇配成1 mg/mL的儲(chǔ)備液，然后用50%甲醇將睪酮儲(chǔ)備液稀釋至10 ng/mL，作為標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液，4 ℃保存。將同位素內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液稀釋至50 ng/mL，作為內(nèi)標(biāo)工作液，4 ℃保存。分別吸取250、400、500、600、750 μL標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液（10 ng/mL），與100 μL內(nèi)標(biāo)工作液（50 ng/mL）混勻，使標(biāo)準(zhǔn)曲線中睪酮與內(nèi)標(biāo)質(zhì)量比分別為0.5、0.8、1.0、1.2、1.5。

1.3 方法學(xué)評(píng)價(jià)

參考美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）C62-A文件[9]和EP15-A3文件[10]，對(duì)本方法的方法殘留、特異性、線性范圍、精密度、準(zhǔn)確度進(jìn)行驗(yàn)證。

1.3.1 特異性 分析內(nèi)標(biāo)化合物對(duì)分析物的干擾。進(jìn)樣時(shí)，在標(biāo)準(zhǔn)曲線后添加1個(gè)只含內(nèi)標(biāo)不含分析物的樣本（標(biāo)記為QC0）。若每批次QC0樣本的分析物色譜峰信噪比（signal-to-noise ratio，RSN）均<3∶1，則認(rèn)為內(nèi)標(biāo)對(duì)分析物無(wú)干擾。

1.3.2 方法殘留 取睪酮<0.01 ng/mL的低濃度血清，加入睪酮標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成睪酮濃度為20 ng/mL的高濃度樣本（H），將不含分析物的50%甲醇作為空白樣本（O）。經(jīng)過(guò)樣本預(yù)處理后，按照H→O的順序重復(fù)進(jìn)樣3次。若空白樣本O中分析物的RSN<3∶1，則認(rèn)為該方法無(wú)殘留。

1.3.3 精密度 依據(jù)CLSI EP15-A3文件對(duì)精密度的要求，測(cè)定2017年參考實(shí)驗(yàn)室外部質(zhì)量評(píng)價(jià)計(jì)劃（the International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine External Quality Assessment Scheme for Reference Laboratories in Laboratory Medicine，RELA）比對(duì)樣本，共測(cè)定3 d，每天分析1批。每個(gè)批次分析2個(gè)濃度RELA樣本，每批次每個(gè)濃度預(yù)處理3次，并重復(fù)測(cè)定5次，計(jì)算每個(gè)濃度的批內(nèi)變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）和批間CV。

1.3.4 準(zhǔn)確度 通過(guò)測(cè)定有證參考物質(zhì)SRM971和參加RELA來(lái)評(píng)價(jià)本方法的準(zhǔn)確度。每個(gè)樣本共測(cè)定3個(gè)批次，每批次每個(gè)濃度預(yù)處理3次，并重復(fù)測(cè)定3次。

1.3.5 線性范圍 收集睪酮<0.5 ng/mL的低濃度血清，添加睪酮儲(chǔ)備液，配制成血清睪酮濃度為22.00 ng/mL 的高濃度樣本（H），以睪酮濃度為0.034 ng/mL的混合血清樣本為低濃度樣本（L）。按照等體積對(duì)倍稀釋方法稀釋成11個(gè)濃度（0.034、1.14、2.78、4.15、5.53、8.27、11.02、13.76、16.51、19.25、22.00 ng/mL）。將稀釋后的樣本進(jìn)行前處理后重復(fù)檢測(cè)2次，計(jì)算實(shí)測(cè)值與理論值之間的線性關(guān)系。若r≥0.995，且殘差<8.75%，則認(rèn)為本方法在0.034～22.00 ng/mL范圍內(nèi)線性良好。

1.3.6 最低定量限 用50%甲醇對(duì)已知濃度（4.45 ng/mL）的血清樣本進(jìn)行稀釋?zhuān)玫嚼碚摑舛确謩e為50、20、10 pg/mL的定量限樣本。將不同濃度定量限樣本各分成10份，預(yù)處理后檢測(cè)，得到實(shí)測(cè)值。將同時(shí)滿(mǎn)足偏移≤10%、CV≤7%、RSN≥10的實(shí)測(cè)值定義為定量限。

1.3.7 基質(zhì)效應(yīng) 將6份血清（3份女性樣本、3份男性樣本）分別與等體積50%甲醇混合，得到6份混合血清。將原始血清樣本和混合血清樣本按樣本預(yù)處理方法處理，按混合血清→候選基質(zhì)（50%甲醇）的順序重復(fù)進(jìn)樣3次，計(jì)算分析物/內(nèi)標(biāo)比值。若混合樣本的分析物/內(nèi)標(biāo)比值與理論比值的偏差≤±20%，則判定為無(wú)相對(duì)基質(zhì)效應(yīng)。

1.4 臨床常規(guī)檢測(cè)方法（微粒子化學(xué)發(fā)光法）正確度評(píng)價(jià)

參考CLSI EP9-A3文件[11]，使用建立的IDLC-MS/MS方法對(duì)微粒子化學(xué)發(fā)光法的正確性進(jìn)行評(píng)價(jià)。收集臨床血清樣本122例，排除脂血、黃疸、脂濁等樣本，分別采用微粒子化學(xué)發(fā)光法和本方法檢測(cè)睪酮濃度。每份樣本每種方法均重復(fù)檢測(cè)3次，計(jì)算均值。以ID-LC-MS/MS結(jié)果為橫坐標(biāo)，以微粒子化學(xué)發(fā)光法結(jié)果為縱坐標(biāo)，進(jìn)行偏差分析。

1.5 不確定度初步評(píng)定

依據(jù)文獻(xiàn)[12]對(duì)血清樣本檢測(cè)結(jié)果的不確定度的來(lái)源進(jìn)行分析。其中，A類(lèi)不確定度主要來(lái)自樣本的重復(fù)測(cè)定；B類(lèi)不確定度主要來(lái)源于睪酮標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度、睪酮標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱(chēng)量、睪酮標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶解、移液器移液過(guò)程引入的不確定度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用MedCalc 18.2.1軟件、Excel 2013軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用五點(diǎn)包括法計(jì)算血清睪酮濃度。采用Passing-Bablok線性回歸分析、Bland-Altman一致性分析對(duì)方法比對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 方法建立及方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.1.1 方法殘留和特異性 ID-LC-MS/MS檢測(cè)血清睪酮的分析時(shí)間為5 min，特異性好，無(wú)殘留。見(jiàn)圖1。

圖1 ID-LC-MS/MS的殘留和特異性

2.1.2 精密度 ID-LC-MS/MS的批內(nèi)精密度≤2.3%，批間精密度≤2.2%。見(jiàn)表1。

表1 ID-LC-MS/MS檢測(cè)血清睪酮的精密度

2.1.3 準(zhǔn)確度 在2017年的RELA比對(duì)中，本實(shí)驗(yàn)室（編號(hào)為54）結(jié)果符合等效限要求（±8.75%）。本法測(cè)定有證參考物質(zhì)SRM971的結(jié)果在規(guī)定的不確定度范圍（6.44±0.15）ng/mL]內(nèi)。見(jiàn)表2。

表2 ID-LC-MS/MS檢測(cè)血清睪酮的準(zhǔn)確度

2.1.4 線性范圍 在0.034～22.00 ng/mL范圍內(nèi)，實(shí)測(cè)值和理論值的相關(guān)性良好（r=0.999）。見(jiàn)圖2。

圖2 ID-LC-MS/MS檢測(cè)血清睪酮的線性范圍

2.1.5 最低定量限 同時(shí)滿(mǎn)足偏移≤10%、CV≤7%、RSN≥10的最低定量限為20 pg/mL。見(jiàn)表3。

表3 ID-LC-MS/MS檢測(cè)血清睪酮的最低定量限

2.1.6 基質(zhì)效應(yīng) 6份混合樣本的分析物/內(nèi)標(biāo)比值與理論比值的偏差（相對(duì)基質(zhì)效應(yīng)）分別為5.6%、2.7%、6.9%、2.8%、-4.4%、-1.50%。見(jiàn)表4。

表4 ID-LC-MS/MS檢測(cè)血清睪酮的基質(zhì)效應(yīng)

2.2 臨床常規(guī)檢測(cè)方法（微粒子化學(xué)發(fā)光法）評(píng)價(jià)

當(dāng)血清睪酮濃度為0.09～18.37 ng/mL時(shí)，微粒子化學(xué)發(fā)光法與ID-LC-MS/MS具有良好的相關(guān)性。2種方法的Passing-Bablok線性回歸方程為Y微粒子化學(xué)發(fā)光法=0.880 597XID-LC-MS/MS-0.109 403（截距的95%可信區(qū)間為0.016 23～0.202 00，斜率的95%可信區(qū)間為0.840 2～0.930 8，r=0.963），見(jiàn)圖3。2種方法檢測(cè)結(jié)果之間的平均偏差為-24.4%，見(jiàn)圖4。高濃度（睪酮>1 ng/mL）樣本2種方法檢測(cè)結(jié)果之間的平均偏差為6.3%，見(jiàn)圖5。低濃度（睪酮≤1 ng/mL）樣本2種方法檢測(cè)結(jié)果之間的平均偏差為62.4%，見(jiàn)圖6。

圖3 微粒子化學(xué)發(fā)光法與ID-LC-MS/MS檢測(cè)血清睪酮的相關(guān)性

圖4 微粒子化學(xué)發(fā)光法與ID-LC-MS/MS血清睪酮檢測(cè)結(jié)果的Bland-Altman圖

圖5 微粒子化學(xué)發(fā)光法與ID-LC-MS/MS檢測(cè)高濃度（睪酮>1 ng/mL）樣本的Bland-Altman圖

圖6 微粒子化學(xué)發(fā)光法與ID-LC-MS/MS檢測(cè)低濃度（睪酮≤1 ng/mL）樣本的Bland-Altman圖

2.3 不確定度評(píng)定

以2017 RELA-A樣本為例，對(duì)ID-LCM S/M S檢測(cè)血清睪酮的不確定度進(jìn)行評(píng)定，結(jié)果見(jiàn)表5。根據(jù)表5中各相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量計(jì)算出合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.012 852。2017 RELA-A樣本測(cè)定均值為4.32 ng/mL，擴(kuò)展不確定度為0.11 ng/mL（包含因子k=2）。

表5 ID-LC-MS/MS檢測(cè)2017 RELA-A樣本的不確定度評(píng)定

3 討論

本研究參考美國(guó)CDC的參考測(cè)量程序，建立了基于LC-MS/MS技術(shù)的血清睪酮候選參考方法。相對(duì)于氣相色譜質(zhì)譜參考方法的樣本前處理過(guò)程，美國(guó)NIST和美國(guó)CDC分別基于LCMS/MS技術(shù)建立的2種參考方法的前處理過(guò)程相對(duì)簡(jiǎn)單，但操作步驟仍較多。美國(guó)NIST參考方法[7]的樣本前處理需先經(jīng)過(guò)液相萃取，再?gòu)?fù)溶，用正己烷進(jìn)行2次液液萃取。美國(guó)CDC參考方法[8]的樣本前處理需先調(diào)節(jié)樣本pH值，再用乙酸乙酯-正已烷（V∶V=3∶2）溶液萃取2次，氮?dú)獯蹈?，然后用碳酸鹽溶液復(fù)溶，之后再用正已烷萃取2次。復(fù)雜的樣本前處理步驟有助于除去雜質(zhì)對(duì)睪酮分析的干擾，提高質(zhì)譜響應(yīng)，但樣本前處理時(shí)間會(huì)大大增加。在滿(mǎn)足精密度和準(zhǔn)確度要求的同時(shí)，本研究對(duì)樣本前處理過(guò)程進(jìn)行優(yōu)化，采用正己烷-乙酸乙酯一步萃取。另外，美國(guó)NIST和美國(guó)CDC參考方法的色譜分析時(shí)間均較長(zhǎng)（美國(guó)CDC方法為16 min，美國(guó)NIST方法為40 min），而本研究建立的ID-LC-MS/MS法采用超高壓液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)和粒徑為1.7 μm的超高效液相色譜柱，色譜分析時(shí)間縮短至5 min。

采用LC-MS/MS技術(shù)實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確測(cè)量的關(guān)鍵之一是排除與分析物結(jié)構(gòu)相同或相似物質(zhì)的干擾，BOTELHO等[8]證實(shí)18種與睪酮相對(duì)分子質(zhì)量接近的化合物對(duì)美國(guó)CDC參考方法檢測(cè)睪酮無(wú)影響。張?zhí)鞁傻萚13]的研究結(jié)果顯示，與睪酮相對(duì)分子質(zhì)量相同的表雄酮經(jīng)過(guò)液相分離，可以排除對(duì)睪酮檢測(cè)的影響。本研究的不足之處在于未對(duì)睪酮結(jié)構(gòu)類(lèi)似物等物質(zhì)進(jìn)行干擾分析，但可以通過(guò)2點(diǎn)間接排除部分干擾物對(duì)IDLC-MS/MS法檢測(cè)睪酮的影響：（1）相對(duì)于氘標(biāo)記的同位素內(nèi)標(biāo)，采用13C標(biāo)記的同位素內(nèi)標(biāo)在液相色譜和質(zhì)譜中的變化與睪酮高度一致，且物理性狀穩(wěn)定，半衰期更長(zhǎng)；（2）ID-LCMS/MS檢測(cè)122例臨床樣本血清睪酮的定量色譜峰和定性色譜峰面積比值與標(biāo)準(zhǔn)曲線中兩者的峰面積比值進(jìn)行比較，無(wú)明顯差異。

本研究結(jié)果顯示，臨床常規(guī)檢測(cè)方法（微粒子化學(xué)發(fā)光法）與ID-LC-MS/MS法檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性較好（r=0.963），但結(jié)果偏差較大，平均偏差為-24.4%。本研究根據(jù)ID-LC-MS/MS檢測(cè)結(jié)果將臨床樣本分為高、低2個(gè)濃度，低濃度為血清睪酮≤1 ng/mL，高濃度為血清睪酮>1 ng/mL，然后再進(jìn)行Bland-Altman一致性分析。結(jié)果顯示，低濃度樣本2種方法的平均偏差為-62.4%，高濃度樣本2種方法的平均偏差為6.3%，與文獻(xiàn)報(bào)道[14]一致。由此可見(jiàn)，微粒子化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)低濃度睪酮的正確性并不理想。原因可能是抗體與其他類(lèi)固醇激素會(huì)產(chǎn)生交叉反應(yīng)，也可能與睪酮低濃度標(biāo)準(zhǔn)工作液的準(zhǔn)確性有關(guān)。具體原因仍需進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究建立了檢測(cè)血清睪酮的ID-LC-MS/MS候選參考方法。該方法精密度、準(zhǔn)確度均較好，且操作相對(duì)簡(jiǎn)便，分析時(shí)間短。臨床常規(guī)檢測(cè)方法（微粒子化學(xué)發(fā)光法）與ID-LC-MS/MS的相關(guān)性良好，但低濃度樣本2種方法之間偏差較大，仍需加強(qiáng)血清睪酮臨床常規(guī)檢測(cè)方法的質(zhì)量控制。開(kāi)展正確度驗(yàn)證計(jì)劃是提升臨床血清睪酮檢測(cè)質(zhì)量的有效方法。本研究建立的候選參考方法可在臨床血清睪酮檢測(cè)質(zhì)量改善中發(fā)揮積極作用。