寄生蟲(chóng)病的實(shí)驗(yàn)室檢查方法

蔡 祺， 王劍飚

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200025）

寄生蟲(chóng)病的實(shí)驗(yàn)室檢查包括病原學(xué)檢查、免疫學(xué)檢查和分子生物學(xué)檢查[1-3]，在寄生蟲(chóng)病的診斷中起著重要的作用。病原學(xué)檢查是指通過(guò)采集患者的血液、組織液、組織、糞便等標(biāo)本，通過(guò)顯微鏡等直接觀察，或在處理、染色后觀察，以發(fā)現(xiàn)寄生蟲(chóng)蟲(chóng)體或蟲(chóng)卵作為診斷依據(jù)，有時(shí)還需進(jìn)行寄生蟲(chóng)體外培養(yǎng)或動(dòng)物接種后再行病原學(xué)檢查。寄生蟲(chóng)病原學(xué)檢查存在一定的局限性，往往由于寄生蟲(chóng)感染階段的不同、寄生部位的不同以及標(biāo)本采集的方法、操作、部位不同等各種因素影響，未能發(fā)現(xiàn)蟲(chóng)體或蟲(chóng)卵而漏診，且檢查過(guò)程耗時(shí)、費(fèi)力，重復(fù)性不佳，結(jié)果完全由檢查者主觀判斷，需要檢查者具有豐富的寄生蟲(chóng)學(xué)知識(shí)和檢測(cè)經(jīng)驗(yàn)。免疫學(xué)檢查和分子生物學(xué)檢查是寄生蟲(chóng)病實(shí)驗(yàn)室診斷的重要組成部分，相較于傳統(tǒng)的病原學(xué)檢查，免疫學(xué)檢查和分子生物學(xué)檢查有更高的敏感性和特異性，且操作相對(duì)簡(jiǎn)便、易行，結(jié)果客觀、準(zhǔn)確，重復(fù)性好，結(jié)合病原學(xué)檢查結(jié)果，可以極大地提高寄生蟲(chóng)的檢測(cè)效率。本文就寄生蟲(chóng)病的實(shí)驗(yàn)室檢查方法進(jìn)行介紹。

1 病原學(xué)檢查

1.1 直接觀察法

1.1.1 薄血膜法 取1滴血滴于1張清潔的載玻片上，另選1張邊緣平整、光滑的載玻片作推片。用左手拇指與中指夾持載玻片2端，右手持推片使其邊緣中點(diǎn)與血滴接觸，并與載玻片呈30°～45°夾角。待血滴沿推片邊緣向兩側(cè)展開(kāi)后，向前勻速推成薄血膜。理想的薄血膜要求紅細(xì)胞均勻地鋪成1層，且無(wú)裂痕，其末端凸出成舌形。涂片制作完成后采用吉姆薩染色或瑞氏染色等方法染色后，行顯微鏡檢查，常用于檢查血液內(nèi)的瘧原蟲(chóng)、微絲蚴、錐蟲(chóng)、弓形蟲(chóng)、巴貝西蟲(chóng)等。

1.1.2 厚血膜法 取2滴血滴于載玻片上，另取1張載玻片作推片，用推片的1個(gè)角接觸血滴，從里向外旋轉(zhuǎn)涂片，使其形成直徑約為0.8 cm、厚薄均勻的圓形血膜，然后平置，待其自然干燥。厚血膜片干燥后，在染色前先用蒸餾水溶血，干燥后再進(jìn)行染色鏡檢。相較于薄血膜法，厚血膜法對(duì)蟲(chóng)體的檢出率更高。

1.1.3 組織取材檢查 收集患者的組織標(biāo)本，包括活檢標(biāo)本、手術(shù)或尸檢標(biāo)本，以切片、染色的載玻片、組織塊或保存的高度懷疑含有寄生蟲(chóng)的病例的組織等形式送至病理科進(jìn)行鑒別診斷。這些組織標(biāo)本通常采用蘇木精-伊紅染色檢查寄生蟲(chóng)。本法可用于旋毛蟲(chóng)、盤尾絲蟲(chóng)、羅阿絲蟲(chóng)及其他蟲(chóng)體的檢查[4-5]。

1.1.4 糞便0.9%氯化鈉溶液直接涂片法 滴加1滴0.9%氯化鈉溶液在載玻片的中間，用竹簽挑取約1/2個(gè)米粒大小的糞粒，讓糞粒和0.9%氯化鈉溶液充分混合，并在載玻片上均勻地涂抹成一層糞膜，置于顯微鏡下觀察。此法需注意的是滴加0.9%氯化鈉溶液的量視糞便的稀稠情況而定。為了提高檢出率，可取不同部位的檢查結(jié)果是陰性的糞便標(biāo)本復(fù)查3次。本法主要用于檢測(cè)大鼠、小鼠、豚鼠等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腸道鞭毛蟲(chóng)和纖毛蟲(chóng)。

1.1.5 糞便直接涂片染色法 本法主要為碘液染色。于載玻片中央滴加1滴碘液，用竹簽挑取少許糞便，在碘液中均勻地涂抹1層糞膜，蓋上蓋玻片，在顯微鏡下觀察。此法適用于犬、猴溶組織內(nèi)阿米巴包囊和結(jié)腸內(nèi)阿米巴包囊、藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(chóng)包囊等原蟲(chóng)包囊的檢測(cè)，顯微鏡下發(fā)現(xiàn)包囊即可判為陽(yáng)性。

1.1.6 糞便厚涂片法 世界衛(wèi)生組織推薦使用改良加藤法（Kato-Katz厚涂片法）蟲(chóng)卵計(jì)數(shù)進(jìn)行定量檢查。該方法適用于多種蠕蟲(chóng)卵的定量檢測(cè)。操作時(shí)首先將100目/寸的尼龍網(wǎng)或金屬篩網(wǎng)覆蓋于待檢糞便上，再用塑料刮片輕壓篩網(wǎng)，輕輕刮取透過(guò)篩網(wǎng)的細(xì)糞渣。將40 mm×30 mm×1.37 mm的聚苯乙烯定量板置于載玻片中間，并用刮片將細(xì)糞渣填入定量板的中央孔內(nèi)（孔徑為8 mm×4 mm，可容納41.7 mg糞便）。小心移去定量板，使標(biāo)本留在載玻片上。將浸透甘油-孔雀綠溶液（甘油100 mL+3%孔雀綠水溶液1 mL+水100 mL）的玻璃紙（5.0 cm×2.5 cm）覆蓋在標(biāo)本上，用膠塞輕輕加壓，使標(biāo)本展平鋪成1個(gè)長(zhǎng)橢圓形。25 ℃環(huán)境下放置1～2 h，糞便透明后即可進(jìn)行鏡檢。觀察并記錄全部蟲(chóng)卵數(shù)，每克糞便的蟲(chóng)卵數(shù)（egg per gram，EPG）=全部蟲(chóng)卵數(shù)×24×糞便性狀系數(shù)（成形便為1、半成形便為1.5、軟濕便為2、粥樣便為3、水瀉便為4）。在操作過(guò)程中需注意保證標(biāo)本新鮮、足量；掌握糞膜的厚度和透明時(shí)間對(duì)蟲(chóng)卵的辨認(rèn)非常重要，鉤蟲(chóng)卵不易透明過(guò)久；親水性玻璃紙剪成30 mm×22 mm的小片，浸于甘油-孔雀綠溶液中至少24 h，直至玻璃紙呈綠色。

1.2 蟲(chóng)卵濃集法

1.2.1 重力沉淀法 利用各種蠕蟲(chóng)卵和原蟲(chóng)包囊比重大于水而自然下沉的原理達(dá)到富集目的（此法對(duì)較小的薄殼蟲(chóng)卵效果較差）。具體操作步驟為：取糞便10～30 g，置于玻璃容器中，加水調(diào)成混懸液，用40～60目的不銹鋼篩網(wǎng)濾入500 mL錐形量杯中。靜置30 min（如收集原蟲(chóng)包囊，需靜置6～8 h）后，去上清液，加等量水清洗沉淀，反復(fù)多次至上清液不混濁，最后取沉渣鏡檢。

1.2.2 醛醚沉淀法 取糞便約1 g，加水15 mL混勻，過(guò)濾至離心管中。1 050×g離心水洗2～3次，去除上清液后，加甲醛固定液10 mL，5 min后加乙醚3 mL，用橡皮塞塞住離心管，用力搖動(dòng)使其充分混合。隨后168×g離心約5 min，此時(shí)管內(nèi)自上而下分為乙醚層、綠色糞渣層、甲醛層、細(xì)渣層4層。取細(xì)渣層鏡檢（查包囊時(shí)加1滴碘液）。

1.2.3 碘醛液離心沉淀法 配制MIF液[（甘油5 mL+甲醛25 mL+硫柳汞酊（1：1 000）200 mL+蒸餾水250 mL]和盧戈碘液（碘片5 g+碘化鉀10 g+蒸餾水100 mL）。取MIF液10 mL于試管中，加入糞便1 g，充分?jǐn)噭?。?jīng)2層脫脂紗布過(guò)濾，濾液中加入冰冷乙醚4 mL，置離心管中，塞住管口后用力振蕩混勻。取下管塞，靜置2 min后，430×g離心1 min。此時(shí)管內(nèi)物自上而下分為乙醚層、糞渣層、汞碘層、沉淀層4層。用竹簽剝離管內(nèi)上3層，迅速傾去，取沉淀層行鏡檢。此法適用于檢查蠕蟲(chóng)卵、原蟲(chóng)包囊、滋養(yǎng)體。

1.3 蟲(chóng)卵漂浮法

1.3.1 飽和氯化鈉溶液漂浮法 在100 mL沸水中加入30～40 g氯化鈉，攪拌至飽和。取1塊黃豆大小的糞便粒，置于小玻璃瓶中，加少許飽和氯化鈉溶液。用竹簽將糞便調(diào)勻，再加入飽和氯化鈉溶液至瓶口，但不能溢出。在瓶口放置1塊潔凈載玻片，避免產(chǎn)生氣泡，放置15 min后，將載玻片迅速翻轉(zhuǎn)，立即鏡檢。

1.3.2 硫酸鋅離心漂浮法 取糞便約1 g，放入小燒杯內(nèi)，加10～15倍水，攪勻。用2層濕紗布將糞便濾入離心管內(nèi)。以（670～1 050）×g離心1 min，棄去上清液，加入清水2～3 mL，攪勻，再加清水至8～10 mL，離心，如此反復(fù)3～4次，至水清為止。傾去上清液，加入33%硫酸鋅液3～4 mL，近管口，搖動(dòng)離心管使沉淀物浮起與硫酸鋅混勻，離心1 min后靜置。用白金圈蘸取表層液膜2～3次，置載玻片上，鏡檢。

1.3.3 蔗糖離心浮聚法 取糞便約5 g，加水20 mL，以260目尼龍袋或4層紗布過(guò)濾。將濾液1 509×g離心5～10 min，吸棄上清液，加蔗糖溶液再離心，參照飽和氯化鈉溶液漂浮法，取載玻片表面膜鏡檢。鑒于1 h后卵囊會(huì)脫水變形不易辨認(rèn)，標(biāo)本制備完成后應(yīng)立即鏡檢。此法適用于檢查糞便中隱孢子蟲(chóng)卵囊。

1.3.4 氯化鋅溶液漂浮法 將1塊黃豆大小的糞便粒放入5 mL離心管中，加入4 mL氯化鋅溶液（氯化鋅13.5 g+蒸餾水1 000 mL，溶解后備用）混勻。670×g離心3 min，靜置5 min。取1滴上清液滴在載玻片上，蓋上蓋玻片，鏡檢。此法適用于犬、貓等動(dòng)物細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)的檢測(cè)。

1.4 幼蟲(chóng)孵化法

1.4.1 毛蚴孵化法 此法是診斷日本血吸蟲(chóng)及華支睪吸蟲(chóng)的方法之一。取30 g新鮮糞便，處理方法同重力沉淀法，在燒瓶?jī)?nèi)放入已經(jīng)洗凈的糞渣，加清水或氨水至燒瓶瓶口處，于25～30 ℃培養(yǎng)箱或室溫孵化，2 h后多次觀察有無(wú)毛蚴孵出。如果有毛蚴孵出，在瓶口水面下可見(jiàn)梭狀白色小點(diǎn)做直線運(yùn)動(dòng)。毛蚴孵化法又可改良為常規(guī)沉孵法和棉析毛蚴孵化法。

1.4.2 常規(guī)沉孵法 常規(guī)沉孵法又稱沉孵法。取糞便約100 g，放入500 mL燒杯中，將糞便加水調(diào)至糊狀，然后再加水至300～400 mL，混勻，用50目的糞篩過(guò)濾到另一個(gè)燒杯內(nèi)，加水沉淀，靜置約20 min后棄去上清液，再加水混勻，繼續(xù)沉淀；反復(fù)3～4次，直至上清液澄清為止。棄去上清液，將上述沉淀糞渣加溫水置于三角燒杯中，水量為離杯口2 cm為宜，并使玻璃管中有一段露出的水柱，瓶口用中央插有玻璃管的膠塞塞上，開(kāi)始孵化。30 min后觀察水柱內(nèi)是否有毛蚴孵出，若無(wú)，每隔1 h觀察1次，直到發(fā)現(xiàn)毛蚴為止。

1.4.3 棉析毛蚴孵化法 棉析毛蚴孵化法簡(jiǎn)稱棉析法。取新鮮糞便約50 g，漂洗后，將糞渣放入300 mL平底孵化瓶中，加入25 ℃清水到瓶頸下部，為了使瓶頸下部不浮動(dòng)，可以在液面上方放1層薄脫脂棉，再緩慢加入溫水至瓶口1～3 cm處。如棉花層上面水中有糞便浮動(dòng)，可將這部分水吸去，再加清水孵化。這種方法比較簡(jiǎn)便，只需漂洗或不漂洗直接裝瓶孵化。毛蚴只集中在棉層上方的清水域中，與下層糞液隔開(kāi)，有利于毛蚴的觀察。

1.4.4 鉤蚴培養(yǎng)法 鉤蚴培養(yǎng)法主要用于檢查鉤蟲(chóng)卵。取15 mL潔凈試管1支，加入蒸餾水1～2 mL，將濾紙剪成與試管等寬但較試管稍短的T字形紙條，取黃豆大小糞粒，均勻地涂抹在紙條2/3處，將紙條插入試管，使下端剛剛與水接觸，以糞便不接觸水面為宜，于25～30 ℃培養(yǎng)箱孵育，3 d后（需每天補(bǔ)充蒸發(fā)的水分）用肉眼或放大鏡觀察管底水中有無(wú)鉤蚴。無(wú)色透明的鉤蚴在水中經(jīng)常呈蛇形游動(dòng)，蟲(chóng)體透明。如未發(fā)現(xiàn)鉤蚴，繼續(xù)培養(yǎng)、觀察至第5天方可結(jié)束。

1.5 肛門拭子法

1.5.1 透明膠帶法 透明膠帶法用于檢測(cè)蟯蟲(chóng)卵。雌性的蟯蟲(chóng)在宿主肛門周圍的皮膚上產(chǎn)卵，蟯蟲(chóng)卵通常在常規(guī)的糞檢中無(wú)法檢出，因此可以用2 cm寬的透明膠帶剪成3～6 cm長(zhǎng)的小段，貼在肛門周圍，取下并粘在載玻片上，置顯微鏡下檢查。此法也適用于檢測(cè)小鼠蟯蟲(chóng)（隱藏管狀線蟲(chóng)）卵和大鼠蟯蟲(chóng)（大鼠管狀線蟲(chóng)）卵。

1.5.2 棉簽拭子法 將10～11 cm長(zhǎng)的竹簽的一端包以脫脂棉，在0.9%氯化鈉溶液中浸濕，然后擠去多余水分，放入試管，蓋上紗布防塵，用時(shí)取出。將棉簽于肛周皺襞表面順一個(gè)方向滾動(dòng)揩拭，然后將棉簽放入試管內(nèi)，并在試管的1/2處加入飽和氯化鈉溶液，用力振蕩數(shù)分鐘，然后迅速將棉簽提起放在試管壁上，擠去多余的水分，棄之。試管內(nèi)加滿飽和氯化鈉溶液，靜置20 min后，用蓋玻片輕輕接觸管口液面，迅速取下，蓋于載玻片上鏡檢。

2 免疫學(xué)檢查

2.1 側(cè)流免疫層析檢測(cè)（lateral flow immunochromatographic assay，LFIA）

LFIA的以條狀纖維層析材料為反應(yīng)基質(zhì)，通過(guò)毛細(xì)作用力使標(biāo)本溶液在層析條上泳動(dòng)，與纖維材料上相應(yīng)的抗體相結(jié)合，產(chǎn)生高特異、高親和性的免疫反應(yīng)，并富集在檢測(cè)區(qū)域（檢測(cè)帶），形成可目測(cè)結(jié)果的條帶的檢測(cè)方法，具有檢測(cè)時(shí)間短、成本低等優(yōu)點(diǎn)，極為適合即時(shí)檢驗(yàn)，在寄生蟲(chóng)檢測(cè)領(lǐng)域被廣泛使用。但其也存在特異性不佳、容易產(chǎn)生交叉反應(yīng)等問(wèn)題[6]。因此，僅適合作為快速篩查的輔助方法。石峰等[7]建立了快速檢測(cè)美洲鉤蟲(chóng)特異抗體的膠體金免疫層析試條方法，特異性為94.9%，敏感性為88.7%，與酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的特異性、敏感性均無(wú)差異。GAO等[8]對(duì)快速細(xì)粒棘球蚴、泡狀棘球蚴的LFIA試劑與包蟲(chóng)病的檢驗(yàn)金標(biāo)準(zhǔn)——超聲檢查進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)LFIA的敏感性和特異性均良好，適合作為包蟲(chóng)病疫區(qū)的篩查工具。TACHIBANA等[9]發(fā)現(xiàn)，溶組織內(nèi)阿米巴半乳糖和N-乙酰-D-半乳糖胺抑制凝集素中間亞基的C末端區(qū)域可用于阿米巴病血清學(xué)診斷，并利用熒光二氧化硅納米顆粒開(kāi)發(fā)了一種免疫層析檢測(cè)試劑，其檢測(cè)敏感性和特異性分別為100%和97.6%，是阿米巴病血清學(xué)快速診斷的理想方法。

2.2 免疫熒光檢測(cè)

免疫熒光檢測(cè)是結(jié)合免疫學(xué)技術(shù)和熒光染色法的檢測(cè)方法，包括間接免疫熒光技術(shù)（indirect fluorescent antibody，IFA）、直接免疫熒光技術(shù)（direct fluorescent antibody，DFA）、時(shí)間分辨熒光免疫分析法（timeresolved fluoroimmunoassay，TRFIA）和補(bǔ)體法，檢測(cè)原理是用已標(biāo)記了熒光素的熒光抗體或抗原作為探針，與組織或細(xì)胞標(biāo)本內(nèi)相應(yīng)的抗原或抗體結(jié)合成的抗原-抗體復(fù)合物，可在熒光顯微鏡下進(jìn)行肉眼觀察，標(biāo)本中受激發(fā)光照射而發(fā)出的熒光還可以被定量檢測(cè)。作為一種成熟的方法，免疫熒光檢測(cè)具有可靠、快速、靈敏、適應(yīng)性好等優(yōu)點(diǎn)，常用于臨床寄生蟲(chóng)病的診斷、流行病學(xué)調(diào)查和治療后的復(fù)查，目前弓形蟲(chóng)病等許多人體寄生蟲(chóng)病均已用免疫熒光檢測(cè)進(jìn)行常規(guī)臨床診斷。孟慶東等[10]用抗惡性瘧原蟲(chóng)/間日瘧原蟲(chóng)乳酸脫氫酶抗體1H12作為捕獲抗體包被96孔板，以Sm3+標(biāo)記抗惡性瘧原蟲(chóng)乳酸脫氫酶抗體2A5和Eu3+標(biāo)記抗間日瘧原蟲(chóng)乳酸脫氫酶抗體4F6作為檢測(cè)抗體，建立惡性瘧原蟲(chóng)與間日瘧原蟲(chóng)雙標(biāo)記TRFIA，可同時(shí)檢測(cè)惡性瘧原蟲(chóng)、間日瘧原蟲(chóng)及二者混合感染，陽(yáng)性率為95.28%，高于鏡檢法的92.45%和Optimal法的51.89%。YLLMAZ等[11]使用DFA檢查糞便標(biāo)本中的藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(chóng)，并與直接顯微鏡觀察法作比較，直接顯微鏡觀察法的敏感性僅為DFA的44.4%。

2.3 免疫磁珠酶聯(lián)免疫分析法

免疫磁珠酶聯(lián)免疫分析法的原理是抗原或抗體與包被人造超順磁性磁核的抗體或抗原結(jié)合，在外界電場(chǎng)的作用下定向移動(dòng)，達(dá)到篩選檢測(cè)的目的，常作為大型全自動(dòng)免疫分析儀的檢測(cè)方法，其耗時(shí)短、穩(wěn)定性強(qiáng)、特異性高，但需要較完善的實(shí)驗(yàn)室環(huán)境，不適合即時(shí)檢驗(yàn)和快速臨床篩查。

2.4 免疫傳感器技術(shù)

生物傳感器借助固定化的生物識(shí)別分子和能量轉(zhuǎn)換器，將生化信號(hào)轉(zhuǎn)化為電信號(hào)，可達(dá)到直接檢測(cè)的目的[12]。相較于傳統(tǒng)免疫檢測(cè)方法，其準(zhǔn)確度和靈敏度更高，且操作簡(jiǎn)單，便于推廣。近年來(lái)，隨著納米材料的應(yīng)用，石墨烯/納米金復(fù)合材料的免疫傳感器使檢測(cè)靈敏度和特異性有了進(jìn)一步的提升，已被廣泛用于臨床診斷和寄生蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)室診斷[13]。張玉娟等[14]克隆了表達(dá)弓形蟲(chóng)主要表面抗原1截短型片段——tSAG1，構(gòu)建了tSAG1納米金免疫傳感器，用于檢測(cè)人血清弓形蟲(chóng)抗體，其敏感性為80.9%、特異性為90.9%、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為90.2%，陰性預(yù)測(cè)值為80.6%，診斷效率為85.2%。付益修等[15]將抗日本血吸蟲(chóng)可溶性蟲(chóng)卵抗原納米抗體固定于鍍金的石墨烯薄膜上，制備阻抗型免疫傳感器，用于檢測(cè)日本血吸蟲(chóng)循環(huán)抗原，最低檢測(cè)限可達(dá)0.01 ng/mL，對(duì)于血吸蟲(chóng)病患者血清的陽(yáng)性檢出率為66.7%，優(yōu)于酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)56.7%的檢出率。免疫傳感器檢測(cè)的靈敏度、特異性相較于傳統(tǒng)免疫學(xué)檢測(cè)有一定優(yōu)勢(shì)，但對(duì)檢測(cè)結(jié)果的觀察仍需要較昂貴的儀器來(lái)輔助，目前僅適用于實(shí)驗(yàn)室檢查。

2.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)是經(jīng)典的檢測(cè)方法，其基本原理是將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面，使酶標(biāo)記的抗原抗體反應(yīng)在固相表面進(jìn)行，然后將液相中的多余游離成分洗除。常用的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)包括雙抗體夾心法和間接法，前者用于檢測(cè)大分子抗原，后者用于測(cè)定特異抗體。目前，寄生蟲(chóng)相關(guān)抗原抗體檢測(cè)的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)試劑盒多采用高純度新式抗原或抗體，操作方便、靈敏度高、特異性強(qiáng)，臨床常用于囊蟲(chóng)病、包蟲(chóng)病、肺吸蟲(chóng)病和曼氏裂頭蚴病等寄生蟲(chóng)病的快速檢測(cè)[16-18]。

3 分子生物學(xué)檢查

目前，聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)已有了長(zhǎng)足的發(fā)展，成為分子生物學(xué)領(lǐng)域最常用的方法之一。PCR可以將微量的目標(biāo)DNA片段經(jīng)變性-退火-延伸的多次循環(huán)，在體外擴(kuò)增100萬(wàn)倍以上。PCR技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是能直接檢測(cè)寄生蟲(chóng)病原體的DNA或RNA片段，敏感性高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好，但是由于其反應(yīng)原理的關(guān)系，實(shí)驗(yàn)需要較為精密、昂貴的儀器，且需要較長(zhǎng)的高溫循環(huán)反應(yīng)時(shí)間。在其后誕生的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)可在恒定溫度下，通過(guò)一些特殊的蛋白（酶）使DNA雙鏈解旋，并促使特異性DNA片段擴(kuò)增，以達(dá)到核酸體外擴(kuò)增的效果。相較于PCR技術(shù)，等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)大大縮短了反應(yīng)時(shí)間，降低了對(duì)儀器的依賴，同時(shí)檢測(cè)的靈敏度、特異性都有不同程度的提高。

3.1 PCR技術(shù)

近幾十年來(lái)，在PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上衍生出的技術(shù)有很多[19]，包括以巢式PCR引物來(lái)增強(qiáng)反應(yīng)敏感性和特異性的巢式PCR；在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后能對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time quantitative polymerase chain reaction，qPCR）；在1個(gè)反應(yīng)體系中使用多套引物，針對(duì)多個(gè)DNA模板或同一模板不同區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增的多重PCR[20]；在擴(kuò)增結(jié)束后對(duì)每個(gè)反應(yīng)單元的熒光信號(hào)進(jìn)行采集，通過(guò)計(jì)算得到樣品原始濃度或含量的數(shù)字PCR[21]技術(shù)。從最初作為寄生蟲(chóng)病原體的檢測(cè)方法[22]，到進(jìn)一步研究寄生蟲(chóng)各種分子標(biāo)志物的工具，目前又開(kāi)發(fā)出更簡(jiǎn)便易行的核酸檢測(cè)方法，可同時(shí)尋找到治療和檢測(cè)的新靶點(diǎn)，PCR技術(shù)一直是近幾十年來(lái)寄生蟲(chóng)學(xué)發(fā)展的基礎(chǔ)。王瑩等[23]采集細(xì)粒棘球蚴病患者外周血，分離血漿后提取游離DAN（cell free DNA，cfDNA），并測(cè)序，對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并與人參考基因組和細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)基因組進(jìn)行綜合比對(duì)，來(lái)篩選診斷標(biāo)志物候選序列，他們分別以細(xì)粒棘球蚴病患者和健康人血漿cfDNA為模板，采用qPCR分析診斷標(biāo)志物候選序列的特異性和敏感性，初步發(fā)現(xiàn)細(xì)粒棘球蚴病患者血漿中存在的蟲(chóng)源性cfDNA可作為潛在的診斷標(biāo)志物。WU等[24]發(fā)現(xiàn)了利什曼原蟲(chóng)的動(dòng)基體DNA微環(huán)，經(jīng)qPCR分析，不僅可以用于皮膚和內(nèi)臟利什曼病的診斷，且具有很高的敏感性和特異性；還可以用于評(píng)估利什曼病的嚴(yán)重程度和治療效果，具有快速診斷和病情監(jiān)測(cè)的應(yīng)用價(jià)值。SEILIE等[25]比較了瘧原蟲(chóng)18SrRNA作為生物標(biāo)志物用于qPCR檢測(cè)與傳統(tǒng)血涂片法檢測(cè)瘧原蟲(chóng)的效果，發(fā)現(xiàn)PCR陽(yáng)性檢出時(shí)間普遍早于血涂片法。瘧原蟲(chóng)18SrRNA是一種敏感且特異的生物標(biāo)志物，可以合理地代替血液涂片，用于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。

3.2 等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

目前較常用的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)包括環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）、依賴核苷酸序列的擴(kuò)增（nucleic acid sequence-based amplification，NASBA）[26]和連接酶鏈反應(yīng)（1igase chain reaction，LCR）。LAMP是日本學(xué)者Notomi等發(fā)明的一種新型的體外擴(kuò)增DNA的方法，與傳統(tǒng)PCR不同，該方法利用鏈置換反應(yīng)和環(huán)介導(dǎo)進(jìn)行基因擴(kuò)增，用4個(gè)或6個(gè)引物對(duì)DNA的6個(gè)或8個(gè)區(qū)域進(jìn)行目的片段擴(kuò)增[27]。NASBA已在病毒學(xué)、寄生蟲(chóng)學(xué)等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，其可以擴(kuò)增DNA和RNA，是在1對(duì)含有T7啟動(dòng)子序列的引物引導(dǎo)下，進(jìn)行連續(xù)41℃恒溫的酶聚合反應(yīng)，反應(yīng)原料為模板DNA或RNA、逆轉(zhuǎn)錄酶、噬菌體T7核糖核酸聚合酶、核糖核酸酶H和2條寡核苷酸引物；其中上游引物5'末端含有噬菌體T7的依賴于DNA的RNA聚合酶的啟動(dòng)子序列，下游引物的5'端包含與檢測(cè)探針互補(bǔ)的序列，這樣既能為噬菌體T核糖核酸聚合酶提供識(shí)別位點(diǎn)，又能運(yùn)用探針標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。LCR是指在連接酶的作用下，將與模板鏈互補(bǔ)的相鄰寡核苷酸片段與磷酸二酯鍵連接，形成1條新鏈，這條新鏈可作為模板參與反應(yīng)，經(jīng)過(guò)反復(fù)循環(huán)，使模板呈指數(shù)增長(zhǎng)；將引物事先作抗原標(biāo)記，擴(kuò)增后產(chǎn)物就可通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)進(jìn)行分析。

等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在恒溫下進(jìn)行，可以使用簡(jiǎn)單的加熱模塊或者水浴，不需要熱循環(huán)儀等昂貴儀器，比傳統(tǒng)PCR操作更簡(jiǎn)便，且成本較低，還保留了PCR技術(shù)特異性好、敏感性高、結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)克服了傳統(tǒng)PCR不能在實(shí)驗(yàn)室外操作的不足，在寄生蟲(chóng)病快速檢測(cè)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值[28]。ORDó?EZ等[29]利用LAMP技術(shù)檢測(cè)血液中克氏錐蟲(chóng)的高同源衛(wèi)星重復(fù)序列（231 bp），證實(shí)了其不俗的檢測(cè)效能，和更方便、快捷、準(zhǔn)確的優(yōu)勢(shì)，特別在資源有限的地區(qū)，可以作為快速診斷錐蟲(chóng)病的即時(shí)檢測(cè)方法；GRAB等[30]利用LAMP技術(shù)檢測(cè)布魯氏錐蟲(chóng)病患者腦脊液中的錐蟲(chóng)pan-T多拷貝基因，發(fā)現(xiàn)通過(guò)檢測(cè)腦脊液中的錐蟲(chóng)DNA，能監(jiān)測(cè)錐蟲(chóng)病的嚴(yán)重程度，適合臨床一線作為錐蟲(chóng)病病情監(jiān)測(cè)的即時(shí)檢測(cè)方法。CHAOUCH等[31]采用LAMP方法檢測(cè)皮膚利什曼病患者利什曼原蟲(chóng)的半胱氨酸蛋白酶B基因的敏感性為84%，特異性為100%，可區(qū)分蟲(chóng)種。MORRIS等[32]詳細(xì)比較了LAMP技術(shù)與其他瘧原蟲(chóng)檢測(cè)方法的差異，發(fā)現(xiàn)LAMP技術(shù)相較于傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡檢測(cè)、免疫學(xué)檢測(cè)和傳統(tǒng)PCR等方法，在敏感性和特異性方面均有較大的優(yōu)勢(shì)，且檢測(cè)限普遍低于其他方法，不僅適合瘧疾流行區(qū)的臨床診斷，亦適合在瘧疾非流行區(qū)進(jìn)行疾病的篩查。

4 總結(jié)和展望

經(jīng)過(guò)60多年的努力，我國(guó)寄生蟲(chóng)病的防治取得了巨大的成就，許多過(guò)去廣泛流行的寄生蟲(chóng)病已經(jīng)消除或接近消除。隨著社會(huì)和經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，國(guó)際間交流的日益頻繁，寄生蟲(chóng)病的流行特點(diǎn)也發(fā)生了巨大改變。食源性寄生蟲(chóng)病、輸入性寄生蟲(chóng)病、機(jī)會(huì)性寄生蟲(chóng)病等新型寄生蟲(chóng)病成為目前寄生蟲(chóng)病的主要發(fā)病因素[33]。因此，寄生蟲(chóng)的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)對(duì)于寄生蟲(chóng)病的防治尤為重要。近年來(lái)，免疫學(xué)和分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)的不斷突破，也為寄生蟲(chóng)病的診斷和防治提供了強(qiáng)有力的支持。但目前，我國(guó)獲得寄生蟲(chóng)病預(yù)防控制體系認(rèn)證、認(rèn)可的實(shí)驗(yàn)室數(shù)量仍相對(duì)較少[34]，室均檢測(cè)項(xiàng)目數(shù)尚不足以覆蓋常見(jiàn)寄生蟲(chóng)，有可用標(biāo)準(zhǔn)但未使用的檢測(cè)項(xiàng)目仍較多。在新的寄生蟲(chóng)病流行環(huán)境下，有必要加強(qiáng)認(rèn)證、認(rèn)可實(shí)驗(yàn)室的建立和能力提升，同時(shí)還應(yīng)適應(yīng)新的形勢(shì)，不斷學(xué)習(xí)和開(kāi)展寄生蟲(chóng)病檢測(cè)新技術(shù)，進(jìn)一步提升我國(guó)寄生蟲(chóng)病實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力。