VemR對野油菜黃單胞菌生物被膜合成和胞外酶活性的調控

林茂娟，吳可建，于燕燕，李春霞，陶 均

（海南省熱帶生物資源可持續(xù)利用重點實驗室，海南大學熱帶作物學院，海南?？?570228）

野油菜黃單胞菌（Xanthomonas campes trispv.campest ris，Xcc）能夠引起十字花科植物的黑腐病，是研究植物與病原菌相互作用的重要模式細菌之一［1-2］.病原體產生的胞外酶、胞外多糖（Extracellular polysaccharide，EPS）、生物被膜（Biofilm）及效應因子等是其能夠成功感染并在宿主組織中定殖的關鍵因素［3-5］.生物被膜的形成在病原體感染寄主植物過程中起著關鍵作用，能夠形成生物被膜的病原菌對抗生素和宿主免疫防御機制具有很強的抗性［6-7］.大多數胞外酶是水解酶或裂解酶，能夠降解宿主植物細胞壁的纖維素、果膠、蛋白質和淀粉等成分，用于侵染初期攻破植物的第一道防線［8］.目前已發(fā)現Ⅱ型分泌系統(tǒng)（Type II secretion system，T2SS）分泌的蛋白酶［9］、纖維素酶（內切葡聚糖酶）［10］、淀粉酶［11］和果膠酶（多聚半乳糖醛酸酶）［12］均在Xcc的毒力中發(fā)揮作用.

VemR是一個僅含有REC（Phosphoacceptor receive）結構域的響應調節(jié)因子（Response regulator，RR），其突變導致Xcc8004菌株的毒力、EPS含量顯著降低.rpo N2、vemR和fleQ基因組成一個操縱子（圖1）［13］.rpo N2編碼一個σ54因子，其突變導致柑橘潰瘍病菌Xc1生物被膜和EPS含量減少［14］.fleQ編碼轉錄激活因子，在XccXC17菌株中可調控fliE、f l iL、fli Q、fl gB、flg G、flhF和flhB A等鞭毛合成基因的表達以及致病力［15-17］.但r po N2-vemR-fleQ操縱子在Xcc中是否調控胞外酶和生物被膜的生物合成并不清楚.本研究構建了r poN2、vemR、f l e Q單突變體、雙突變體以及三重突變體，比較突變體與野生型菌株分泌胞外酶和形成生物被膜的能力，分析rpo N2-vemR-fleQ操縱子對Xcc8004合成胞外酶和生物被膜的調控作用，為進一步探討病原菌的致病機制提供參考.

圖1 rpoN2-vemR-fl eQ操縱子及其編碼蛋白質結構

1 材料與方法

1.1 菌株與質粒Xcc8004菌株和pK18mob S acB質粒為本實驗室保存，大腸桿菌感受態(tài)購自全式金生物技術有限公司.

1.2 培養(yǎng)基與試劑LB培養(yǎng)基（1%胰化蛋白胨、0.5%酵母提取物、1%NaCl），NYG培養(yǎng)基（1%胰化蛋白胨、0.5%酵母提取物、1%甘油），相應的固體培養(yǎng)基另加1.5%的瓊脂.瓊脂糖凝膠回收及質粒提取試劑盒購自天根生化科技有限公司.高保真DNA聚合酶、限制性核酸內切酶及T4連接酶購自NEB公司.其它試劑購自Sigma或廣州化學試劑公司.

1.3 引物序列根據敲除基因兩端序列，運用軟件Primer 5分析、設計引物（表1），并由生工生物工程（廣州）分公司合成.

表1 引物序列

1.4 突變體構建以Xcc8004基因組為模板，PCR擴增目的基因上下游各約500 bp片段.酶切回收后與pK18mobSacB載體相連，轉化E.col iDH5a，經酶切鑒定以及測序確認后獲得敲除載體pK18-rpo N2、pK18-vemR、pK18-fleQ、pK18-rpo N2/vemR、pK18-vemR/fleQ、pK18-rpo N2/fleQ、pK18-rpoN2/vemR/fleQ.利用三親接合法將自殺質粒pK18mob S ac B轉入Xcc8004中，經過兩次交換后獲得突變體菌株，單突變體菌株：Δrpo N2、ΔvemR和ΔfleQ；雙突變體菌株：ΔrpoN2/ΔvemR、ΔvemR/ΔfleQ和ΔrpoN2/ΔfleQ以及三突變體：Δrpo N2/ΔvemR/ΔfleQ.

1.5 生物被膜（Biofilm）含量測定將待測菌株于28℃振蕩培養(yǎng)24 h后離心收集菌體，用NYG培養(yǎng)基清洗兩次后稀釋至OD600=1.0，取2 mL菌液接種到試管中，28℃靜置培養(yǎng)72 h.將菌液吸取干凈后，用ddH2O輕輕清洗兩遍，自然風干，加入0.1%結晶紫染液染色30 min，棄結晶紫染液，用ddH2O輕輕清洗兩遍后同樣自然風干，通過觀察氣液表面薄膜環(huán)的大小來推測菌株Biofilm的形成能力.最后加入等量的90%乙醇溶解20 min，混勻后按200μL/孔加入96孔板于A590 nm波長處檢測吸光值，每個樣本做3個重復［18］.

1.6 胞外酶（蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶）活性測定將待測菌株于28℃振蕩培養(yǎng)24 h后離心收集菌體，用ddH2O清洗兩次后稀釋至OD600=1.0，取2μL菌液接種到分別補充有脫脂奶粉、可溶性淀粉以及羧甲基纖維素的NYG固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h.補充有可溶性淀粉和纖維素的平板分別用1∶100的I2/KI（0.08 M I2，3.2 M KI）和0.1%的剛果紅染液染色.通過比較D/d（水解產物的直徑（D）和菌落直徑（d））的大小以鑒定菌株產酶能力，D/d值越大，說明菌株產酶的能力越強［19］.

2 結果與分析

2.1 rpoN2/vemR/fleQ突變體菌株的構建本實驗以Xcc8004作為野生型菌株（WT），利用三親本接合法經過兩次同源重組將rpoN2、vemR和fleQ敲除.用目的基因兩側引物進行PCR檢測，以Xcc8004為陽性對照，ddH2O為陰性對照.r poN2、vemR和fleQ基因大小分別為1 404 bp、384 bp、1 491 bp.如圖2所示，在相應突變體中，野生型擴增片段與突變體擴增片段大小之差正好符合預測敲除基因片段大小，表明突變體已構建成功.

圖2 r poN2、ve mR和fleQ突變體PCR檢測

2.2 VemR、RpoN2和FleQ對Xcc生物被膜的調控作用生物被膜（Biofilm）是指粘附在物體表面或界面由蛋白質、多糖和DNA等組成的細菌群體［20］，能夠保護細菌免受各種物理、化學和生物因素的損傷［21］.本研究通過氣液界面環(huán)形成法以及結晶紫染色分光光度法檢測突變體菌株形成Biofilm的能力.如圖3所示，WT菌株形成的氣液界面環(huán)面積較大，表明其形成Biofilm的能力較強.與WT相比，vemR突變后，氣液界面環(huán)菌落面積明顯減少，結晶紫染色的吸光值降低約88.8%.Δr poN2/ΔvemR和ΔvemR/ΔfleQ雙突變體的吸光值較WT分別降低約75.3%和64.6%，表明ΔrpoN2/ΔvemR和ΔvemR/ΔfleQ的Biofilm形成能力也明顯減弱，但比ΔvemR單突變體略強.Δr poN2、ΔfleQ、Δrpo N2/ΔfleQ和Δr poN2/ΔvemR/Δf l e Q均與野生型結果相似，氣液界面環(huán)菌落面積較大，結晶紫染色吸光值較高，具有較強的Biofilm合成能力.以上結果表明，VemR正調控Biofilm的生物合成，但RpoN2和FleQ可能拮抗VemR的活性，存在部分上位效應.

圖3 rpoN2、vemR和fl eQ突變對Xcc Biofilm含量的影響

2.3 VemR、RpoN2和FleQ對Xcc胞外蛋白酶的調控蛋白酶是一類能夠水解蛋白質肽鏈的酶.細菌若能分泌胞外蛋白酶，則能夠在含有2%脫脂奶粉的平板上形成一個無色透明的水解圈.如圖4所示，除了ΔvemR/Δf le Q雙突變體外，其余所有突變體的水解圈直徑與WT菌株大小幾乎一致.ΔvemR/ΔfleQ雙突變體的水解圈極小，較野生型菌株降低約64.7%，說明其產生蛋白酶的能力明顯減弱.ΔvemR和ΔfleQ單突變體不影響蛋白酶的分泌.以上結果表明，vemR和fl e Q共同調控Xcc8004菌株分泌蛋白酶，在功能上有冗余.但RpoN2可抑制VemR和FleQ的活性，可能在VemR和FleQ的信號下游起作用.

圖4 rpoN2、vemR和fl eQ突變對Xc c胞外蛋白酶含量的影響

2.4 VemR、RpoN2和FleQ對Xcc胞外淀粉酶活性的調控Xcc8004具有淀粉酶活性，因此它能夠在含有0.1%可溶性淀粉的NYG平板上形成透明的水解圈.如圖5所示，與WT型相比，ΔvemR和ΔvemR/Δf l e Q突變體的淀粉酶水解圈直徑明顯變小，分別降低約16.4%和23%.其余突變體分泌淀粉酶的能力與WT型差異不大.這表明VemR正調控Xcc淀粉酶的合成或分泌，FleQ可協(xié)同VemR調控胞外淀粉酶活性，但RpoN2具有拮抗VemR和FleQ的功能.因此，VemR和FleQ可能通過負調控RpoN2來調控胞外淀粉酶的合成或分泌.

圖5 rpoN2、vemR和fl eQ突變對Xc c胞外淀粉酶活性的影響

2.5 VemR、RpoN2和FleQ對Xcc胞外纖維素酶活性的調控Xcc8004也具有分泌纖維素酶的功能，能夠在含有0.5%的羧甲基纖維素的固體培養(yǎng)基上形成水解纖維素的圈.如圖6所示，所有vemR缺失突變體（即ΔvemR、ΔrpoN2/ΔvemR、ΔvemR/ΔfleQ和Δr poN2/ΔvemR/Δf le Q）的水解圈均比WT菌株小約12%～17%，而ΔrpoN2、Δfl e Q和ΔrpoN2/ΔfleQ突變體的水解圈大小與野生型菌株沒有明顯差異.以上結果表明，在Xcc8004中，RpoN2和FleQ對纖維素酶的合成或分泌沒有影響，VemR則正調控纖維素酶的合成或分泌.

3 討 論

在病原菌中，毒力因子的產生在多個水平上受到嚴格調控.在黃單胞菌中，EPS、Biofilm和胞外酶的表達主要由Rpf/DSF群體感應系統(tǒng)調節(jié)［23-25］.此外，一些雙組分系統(tǒng)（如RpfC/RpfG、RavA/RavR、HpaS）和轉錄調控因子Clp等也參與其胞外酶和Biofilm等生物合成的調控［26-28］.除了轉錄調控外，全局性轉錄后調節(jié)因子RsmA和小RNA伴侶Hfq也影響XccEPS、纖維素酶和淀粉酶的產生［29-30］.

在許多病原菌中，rpoN2-vemR-fleQ操縱子調節(jié)許多基因的轉錄和表達，調控細菌的生長、毒力、運動性、生物被膜形成、細菌鞭毛的組裝和群體感應等［31-35］.在Xcc8004中，我們先前發(fā)現VemR可調節(jié)EPS的生物合成和細菌的運動能力，進而影響細菌的致病力［13］.在這里，我們還發(fā)現VemR正調控纖維素酶、淀粉酶和蛋白酶的合成或分泌，并且vemR缺失突變后Xcc8004菌株幾乎無法產生生物被膜.這些發(fā)現說明VemR可能是全局性的調節(jié)因子，影響包括胞外酶、EPS、Biofilm、運動性在內的諸多致病相關因子的形成，調控細菌對外界環(huán)境的適應能力，進而影響病原菌的致病力.此外，除纖維素酶外，VemR對上述致病因子的調控均依賴于RpoN2和FleQ，暗示vemR操縱子內的3個基因具有上下位效應，處于一條信號傳遞途徑上.由于RpoN2和FleQ均為DNA結合蛋白，作為轉錄調節(jié)因子起作用，而VemR沒有相關的功能輸出結構域，因此VemR可能影響RpoN2或FleQ的DNA結合活性，進而調控致病因子合成或分泌相關基因的表達，調控病原菌的致病力，但具體機制還需進一步研究.