乙肝HBsAg酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)信號(hào)灰區(qū)與血清免疫逃逸變異HBsAg的關(guān)系研究

薛方 李鸝

(1.陜西省第四人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，陜西 西安 710043；2.陜西省疾病預(yù)防控制中心計(jì)劃免疫所(疫苗臨床評(píng)價(jià)中心)，陜西 西安 710054)

乙型肝炎病毒作為臨床常見(jiàn)的病毒類型，具備較強(qiáng)的傳染性，且屬于脫氧核糖核酸病毒，隸屬嗜肝脫氧核糖核酸病毒科[1]。一旦感染后，可直接影響患者日常生活以及身體健康，若未能夠盡早發(fā)現(xiàn)并及時(shí)提供科學(xué)療法，隨著疾病持續(xù)發(fā)展且不斷加重，部分患者可進(jìn)展成為肝硬化或者肝癌，直接危及生命安全[2-3]。有報(bào)道指出[4]，乙型肝炎病毒患者的外周靜脈血中可測(cè)出乙型肝炎病毒DNA、特異性抗體以及抗原等，但部分患者在實(shí)施酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)時(shí)，其中HBsAg檢測(cè)信號(hào)可能位于灰區(qū)，直接影響檢驗(yàn)結(jié)果[5-6]。本文探究乙肝HBsAg ELISA檢測(cè)信號(hào)灰區(qū)與血清免疫逃逸變異HBsAg的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇我院2018年8月至2020年8月納入的100例乙型肝炎病毒患者，其中男54例，女46例；年齡36～70歲，平均年齡(52.38±1.24)歲；初中至以下36例，高中38例，大專至以上26例；體質(zhì)量50～74 kg，平均體質(zhì)量(63.48±1.02)kg；身高157～180 cm，平均身高(170.59±1.45)cm。納入標(biāo)準(zhǔn)[7]：患者與家屬知情同意，經(jīng)本醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(guò)；符合疾病診斷標(biāo)準(zhǔn)，均存在食欲不振、營(yíng)養(yǎng)不良、腹部不適、面色晦暗、消瘦等癥狀；ELISA中顯示乙肝HBsAg檢測(cè)信號(hào)處在灰區(qū)。排除標(biāo)準(zhǔn)[8]：存在免疫系統(tǒng)缺陷或者疾病者；存在精神方面疾病或者溝通、聽力障礙者；合并肝炎史、嚴(yán)重心腦血管疾病者；生化指標(biāo)水平波動(dòng)較大者。

1.2方法 收集并整理所有患者的病歷資料，分別利用市售ELISA試劑盒以及G6-ELISA試劑測(cè)定患者的血清免疫逃逸變異HBsAg。選擇乙型肝炎病毒HBsAg檢驗(yàn)試劑盒(上?？迫A生物工程股份有限公司)，利用ELISA法測(cè)定信號(hào)灰區(qū)的患者血清HBsAg，并嚴(yán)格遵照說(shuō)明書要求進(jìn)行。市售ELISA檢查結(jié)束后再次進(jìn)行G6-ELISA檢驗(yàn)，選擇單克隆抗體(mAb)與pH9.6的碳酸緩沖液稀釋，將稀釋后的G6-mAb緩沖液緩慢加入酶標(biāo)反應(yīng)板上的各個(gè)孔內(nèi)，劑量均保持在85uL左右，最后置于4℃條件下12 h。隨后將G6-mAb樣本置于非離子表面活性劑的磷酸緩沖液，重復(fù)洗滌，單次洗滌時(shí)間控制在60 s左右，放入2%牛血清白蛋白，每孔劑量85uL，置于37℃條件下封閉2 h左右。清除稀釋液中封閉液，加入不同稀釋濃度的血清樣本，酶標(biāo)反應(yīng)孔劑量50uL，置于37℃條件下孵育30 min。常規(guī)洗板，加入羊抗HBS-HRP(50uL)，以上述同樣的條件進(jìn)行孵育。再次洗板并孵育，加入TMB-H2O溶液，使其顯色，時(shí)間10 min左右，隨后選擇硫酸溶液(2 mol/L)停止反應(yīng)，將其放在酶標(biāo)儀上，測(cè)定450 nm波長(zhǎng)位置的吸光度，若P/C≥2.1判定成陽(yáng)性。

1.3觀察指標(biāo) 對(duì)比兩組血清免疫逃逸變異HBsAg陽(yáng)性率以及P/C數(shù)據(jù)，分析乙肝HBsAg ELISA檢測(cè)信號(hào)灰區(qū)與血清免疫逃逸變異HBsAg的關(guān)系。其中超臨界：P/C水平處于2.6～5.0范圍；亞臨界：P/C水平處于1.2～1.8范圍；臨界：P/C水平處于1.9～2.5范圍。陽(yáng)性率是超臨界率+亞臨界率+臨界率之和[9]。

2 結(jié) 果

2.1兩組血清免疫逃逸變異HBsAg陽(yáng)性率的對(duì)比 市售ELISA組的陽(yáng)性率明顯低于G6-ELISA組(χ2=5.357，P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 兩組血清免疫逃逸變異HBsAg陽(yáng)性率的對(duì)比[n(%)，n=100]

2.2兩組P/C數(shù)據(jù)的對(duì)比 市售ELISA組的超臨界、亞臨界、臨界、總P/C水平均低于G6-ELISA組(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 兩組P/C數(shù)據(jù)的對(duì)比

3 討 論

目前，乙型肝炎病毒已經(jīng)成為全球范圍內(nèi)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題，雖然乙肝疫苗能夠有效控制疾病的患病率以及傳播范圍，但近幾年乙型肝炎病毒的危險(xiǎn)因素不斷增多，尤其是生活水平的提升，飲食以及生活習(xí)慣發(fā)生極大改變，加上工作與生活壓力導(dǎo)致免疫能力降低，直接提升乙型肝炎病毒的患病率[10-11]。若未能夠盡早發(fā)現(xiàn)并及時(shí)選擇相關(guān)干預(yù)，可能增加失代償性肝硬化、肝細(xì)胞癌等嚴(yán)重并發(fā)癥，給患者帶來(lái)嚴(yán)重后果[12]。因此選擇有效檢驗(yàn)方式成為關(guān)鍵。

HBsAg檢查是乙型肝炎病毒中最為多見(jiàn)的診斷方式。以往研究發(fā)現(xiàn)，乙肝HBsAg ELISA檢測(cè)信號(hào)灰區(qū)的產(chǎn)生可能與自身免疫物質(zhì)缺少、檢驗(yàn)標(biāo)本或者試劑污染、食物抗體、血清中某因子過(guò)量以及檢驗(yàn)操作的規(guī)范性等因素存在密切相關(guān)性[13-14]。但關(guān)于乙肝HBsAg ELISA檢測(cè)信號(hào)灰區(qū)與血清免疫逃逸變異HBsAg關(guān)系尚未統(tǒng)一。本文結(jié)果顯示，市售ELISA組的陽(yáng)性率明顯低于G6-ELISA組(P<0.05)。市售ELISA組的超臨界、亞臨界、臨界、總P/C水平均低于G6-ELISA組(P<0.05)，提示乙肝HBsAg ELISA法信號(hào)灰區(qū)患者在排除外界因素干擾的情況下，可明確成乙型肝炎病毒感染，而G6-ELISA法針對(duì)血清免疫逃逸變異HBsAg的敏感性較高。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，目前我國(guó)市售的ELISA試劑均選擇單克隆抗體，且主要針對(duì)HBsAg a決定簇，或者與空間結(jié)果存在關(guān)聯(lián)性的抗原定位點(diǎn)，進(jìn)而使抗原性飄移對(duì)表達(dá)抗原、檢測(cè)試劑中抗體的結(jié)合能力造成一定影響，最終導(dǎo)致檢驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)偏差[15]。除此之外，雖然同一抗體在血清免疫逃逸變異HBsAg可發(fā)揮免疫反應(yīng)，但其親和力較低，也可造成乙肝HBsAg ELISA檢測(cè)信號(hào)灰區(qū)產(chǎn)生。

綜上所述，乙肝HBsAg ELISA檢測(cè)信號(hào)灰區(qū)通常是由血清免疫逃逸變異HBsAg造成，需有效提升其檢驗(yàn)?zāi)芰?，保障后續(xù)疾病診斷結(jié)果的準(zhǔn)確性。