海洋細(xì)菌Catenovulum sp.DP03兩個右旋糖酐酶差異分析

田小鵬 ，鄧 甜 ，董冬雪 ，祖航天 ，呂明生 *，3，王淑軍 ，3

（1.江蘇海洋大學(xué) 江蘇省海洋生物資源與環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 連云港222005；2.江蘇海洋大學(xué) 江蘇省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 連云港222005；3.江蘇海洋大學(xué) 江蘇省海洋生物產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 連云港 222005）

右旋糖酐是一種以α-D-吡喃葡萄糖為單體，通過葡糖苷鍵鏈接而形成的多聚糖[1]。它是由某些細(xì)菌如腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）、莢膜醋酸菌（Acetobacter capsulatum）等發(fā)酵將蔗糖轉(zhuǎn)化合成而得到的，主要以α-1，6-糖苷鍵鏈接，除此之外，一些支鏈還包含了α-1，3-糖苷鍵與α-1，4-糖苷鍵[2-3]。

右旋糖酐酶（EC3.2.1.11）是一類能夠?qū)Ｒ恍越到庥倚囚笑?1，6-糖苷鍵的糖苷水解酶，存在于糖苷水解酶（GH）家族49家族和66家族中，并且這兩個家族序列間沒有同源性[4-5]。一般根據(jù)催化位點(diǎn)不同將右旋糖酐酶分為內(nèi)切型右旋糖酐酶（Endodextranase）以及外切型右旋糖酐酶（Exodextranase）[1]。外切型右旋糖酐酶主要切割右旋糖酐鏈的非還原端的α-1，6-糖苷鍵，產(chǎn)生葡萄糖。內(nèi)切型右旋糖酐酶主要從右旋糖酐的內(nèi)部切割α-1，6-糖苷鍵，產(chǎn)生葡萄糖、異麥芽糖以及一系列低聚異麥芽糖[1，6]。目前所報(bào)道的右旋糖酐酶主要為內(nèi)切型右旋糖酐酶。絕大多數(shù)內(nèi)切型右旋糖酐酶只有在具有多個連貫的α-1，6-糖苷鍵存在時才能發(fā)揮水解作用[7]。

右旋糖酐酶在食品、化工以及醫(yī)藥等領(lǐng)域都有著非常廣泛的應(yīng)用[8]，且主要來源于微生物，其產(chǎn)生菌種類繁多，主要分為真菌類與細(xì)菌類[6]。真菌所產(chǎn)生的右旋糖酐酶活性較高，穩(wěn)定性較好，被廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中[9]。但是，許多真菌如霉菌，除了少數(shù)已經(jīng)通過食藥安全認(rèn)證外，絕大多數(shù)的霉菌在發(fā)酵過程中還會伴隨著復(fù)雜的次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生，因而存在安全隱患，從而限制了它們的應(yīng)用，尤其是在醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域[6，10]。相較于真菌，細(xì)菌的生長繁殖速度快，發(fā)酵時間短，產(chǎn)酶效率高。但是，來源于細(xì)菌的右旋糖酐酶普遍酶活較低，穩(wěn)定性較差[6]。已有一些研究者將目光轉(zhuǎn)向了海洋細(xì)菌，海洋環(huán)境孕育著豐富的微生物資源，由于海洋環(huán)境的特殊性，來源于海洋微生物的右旋糖酐酶通常具有耐鹽、耐堿、耐低溫等特性，在工業(yè)生產(chǎn)中有很大的應(yīng)用前景[11-12]。

為了擴(kuò)大海洋微生物右旋糖酐酶的應(yīng)用價值，提高其利用率，作者以產(chǎn)右旋糖酐酶的海洋細(xì)菌Catenovulum sp.DP03為材料，完成了其全基因組測序，比較分析了來源于該菌株的兩種右旋糖酐酶的性質(zhì)及其水解右旋糖酐的產(chǎn)物，為海洋微生物的右旋糖酐酶的克隆表達(dá)與應(yīng)用提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養(yǎng)基

1）2216 E培養(yǎng)基 酵母粉1 g/L，魚粉蛋白胨5 g/L，陳海水配制；pH 7.8；

2）LB培養(yǎng)基 酵母粉5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，蒸餾水配制；pH 7.4。

1.1.2 菌株與試劑

1）菌株 Catenovulum sp.DP03菌株：作者所在實(shí)驗(yàn)室從海洋環(huán)境中篩選得到并保存[13]；大腸桿菌DH5α與大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞：購買自全式金生物科技有限公司；大腸桿菌pET29a：作者所在實(shí)驗(yàn)室保存。

2）試劑 DNA marker10000：購自 Takara-寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；BCA蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度測定試劑盒、細(xì)菌基因組提取試劑盒、高純度質(zhì)粒小提試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒：購自生工生物工程（上海）有限公司；Taq Plus DNA polymerase、限制性核酸內(nèi)切酶Not I與Bgl II：購自NEB（北京）有限公司；其他試劑：分析純，購自國藥化學(xué)試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 Catenovulum sp.DP03基因組提取與全基因組測序 將保存于甘油管中的菌Catenovulum sp.DP03在2216E培養(yǎng)基中活化后，使用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取菌株的基因組，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后送至生工生物工程（上海）有限公司進(jìn)行全基因組測序，分析測序結(jié)果，根據(jù)基因注釋結(jié)果挖掘出其右旋糖酐酶基因序列及蛋白質(zhì)序列，并對該右旋糖酐酶的蛋白質(zhì)進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

1.2.2 右旋糖酐酶基因克隆 根據(jù)右旋糖酐酶基因序列設(shè)計(jì)如下引物（表1），并使用Taq Plus DNA polymerase聚合酶連鎖式反應(yīng) （PCR）擴(kuò)增目的基因；使用瓊脂糖凝膠檢測并回收目的基因；使用限制性核酸內(nèi)切酶Not I與Bgl II同時酶切目的基因與pET29a質(zhì)粒，瓊脂糖凝膠回收目的基因與pET29a；使用Solution I將目的基因與載體pET29a連接后轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，37℃過夜培養(yǎng)后挑選出陽性克隆，送生工生物工程（上海）有限公司測序以驗(yàn)證克隆子的正確性。

表1 引物Table 1 Primers

1.2.3 重組右旋糖酐酶的表達(dá) 使用高純度質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒，取1 μL重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌 BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，37℃過夜培養(yǎng)后挑單菌落于含50 μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、180 r/min培養(yǎng)6～8 h，使菌體OD600=0.6～0.8，然后按2%接種體積分?jǐn)?shù)接種于100 mL含50 μg/mL卡那霉素的新 LB液體培養(yǎng)基中，在37 ℃、180 r/min 培養(yǎng) 4～6 h，使菌體 OD600=0.6～0.8，然后加入終濃度為0.5 mmol/L異丙基-β-D-硫代半乳 糖 苷 （Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG），置于18℃、180 r/min誘導(dǎo)表達(dá)24 h后，離心收集細(xì)胞，使用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）清洗細(xì)胞3次后加入10 mL PBS緩沖液懸浮細(xì)胞，使用超聲波細(xì)胞破碎儀破碎細(xì)胞壁，得到重組右旋糖酐酶粗酶液。

1.2.4 重組右旋糖酐酶的純化 根據(jù)重組右旋糖酐酶所帶的His標(biāo)簽，使用鎳柱親和層析的方法對粗酶液進(jìn)行純化，分別使用含 20、50、70、100、150、200、250 mmol/L咪唑的磷酸鹽緩沖液 （50 mmol/L NaH2PO4，300 mmol/L NaCl，咪唑，使用 NaOH 溶液調(diào)節(jié)pH至8，并使用0.22 μm濾膜過濾除菌）梯度洗脫，并收集洗脫液，然后使用8 g/dL SDS-PAGE電泳檢測純化效果，并使用BCA蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度測定試劑盒測定粗酶液及各洗脫液的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，同時使用DNS法測定其右旋糖酐酶活力。

1.2.5 右旋糖酐酶活力測定 使用DNS法測定右旋糖酐酶酶活力，方法如下：在一定的溫度與pH條件下，將20 μL酶液與180 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%右旋糖酐T70反應(yīng)一定時間后，在反應(yīng)體系中加入200 μL DNS終止反應(yīng)，沸水浴5 min，加入3 mL蒸餾水進(jìn)行稀釋，取200 μL于96孔板中，使用酶標(biāo)儀讀取540 nm處的吸光值，測定其還原糖生成量（以不同質(zhì)量濃度葡萄糖做標(biāo)準(zhǔn)曲線）。以先加入DNS終止反應(yīng)后再加入酶液作為對照組，其他與實(shí)驗(yàn)組相同。酶活力單位定義（U）為上述反應(yīng)條件下，每分鐘釋放 1 μmoL葡萄糖所需的酶量[14]。

1.2.6 重組右旋糖酐酶最適催化溫度及pH 以3%右旋糖酐 T70（pH 7）為底物，分別在 20、25、30、35、40、45、50℃下測定重組右旋糖酐酶活力，并計(jì)算其酶活力。然后分別配制50 mmol/L不同pH（乙酸-乙酸鈉，pH 4.0～5.0； 磷酸鹽，pH 6.0～7.5；Tris-HCl，pH 8.0～9.0； 碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液：pH 10）的緩沖液，然后用不同緩沖液配制3%右旋糖酐T70為底物，分別在最適溫度下測定右旋糖酐酶活力，并計(jì)算其酶活力。所有試驗(yàn)均設(shè)3個平行。

1.2.7 重組右旋糖酐酶水解右旋糖酐產(chǎn)物分析將重組右旋糖酐酶Cadex2870和Cadex2872與3%右旋糖酐T70（pH 7）分別在45℃和30℃下反應(yīng)0.5、2、6、24 h，沸水浴 1 min 滅活，然后 1 000 r/min離心1 min，取上清液用0.22 μm濾膜過濾。首先，各取0.5 μL反應(yīng)液進(jìn)行薄層層析（TLC）分析該右旋糖酐酶水解右旋糖酐T70產(chǎn)物，展開劑為：5 mL正丙醇、2 mL乙酸乙酯、8 mL乙腈、1 mL乙酸、4.5 mL去離子水；顯色劑為：0.2 g地衣酚、10 mL濃硫酸、80 mL無水乙醇、10 mL去離子水；85℃下顯色5 min。其次，使用高效液相色譜（HPLC）分析2 h與6 h的產(chǎn)物，以葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、麥芽四糖、麥芽五糖、麥芽六糖以及麥芽七糖標(biāo)準(zhǔn)品為對照。色譜條件：色譜柱為Waters sugar-Pak1（300 mm×6.5 mm），流動相為去離子水，流速為0.4 mL/min，柱溫為75℃，進(jìn)樣量為20 μL。使用Empower GPC軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和處理，計(jì)算各產(chǎn)物的峰面積。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 Catenovulum sp.DP03全基因組測序分析

通過Illumina Hiseq4000平臺測序，Catenovulum sp.DP03基因組基本信息見表2?；跍y序數(shù)據(jù)組裝得到樣品DP03基因組大小為4 417 646 bp，GC含量40.95%，共231個拼接，451個重疊群?；蚪M組分分析后發(fā)現(xiàn)，樣品DP03的基因組含有3 801個基因，總長度為3 881 685 bp，平均長度1 021 bp，占基因組全長的88.50%?；蚪M串聯(lián)重復(fù)序列共144個，總長度為16 943 bp，占基因組全長的0.3863%。小衛(wèi)星序列76個，微衛(wèi)星序列27個，tRNA 60個，rRNA 2個。

表2 Catenovulum sp.DP03基因組信息統(tǒng)計(jì)Table 2 Information of Catenovulum sp.DP03 DNA

經(jīng)碳水化合物酶專門數(shù)據(jù)庫 （Carbohydrate-Active enZYmes Database，CAZy） 數(shù)據(jù)庫分析，Catenovulum sp.DP03基因組中含有糖苷水解酶131個，占比42.1%，包括α-木聚糖酶、α-葡糖苷酶、阿拉伯糖苷酶、聚半乳糖醛酸酶、β-半乳糖苷酶、蔗糖磷酸化酶、1，4-α-葡聚糖分支酶 GlgB、淀粉蔗糖酶、α-淀粉酶、果聚糖酶以及右旋糖酐酶等。糖苷轉(zhuǎn)移酶57個，糖水化合物脂酶51個，碳水化合物結(jié)合模塊45個，多糖裂解酶14個，以及輔助模塊的酶13個，見圖1。

圖1 Catenovulum sp.DP03基因功能注釋CAZy圖Fig.1 Gene function annotation by CAZy of Catenovulum sp.DP03

2.2 右旋糖酐酶蛋白質(zhì)序列生物信息學(xué)分析

根據(jù)基因組注釋結(jié)果，Catenovulum sp.DP03中含有兩個右旋糖酐酶基因，基因編號分別為GL002870與GL002872（對應(yīng)編碼的蛋白質(zhì)分別稱為 Cadex2870與 Cadex2872）。如表3所示，GL002870基因大小為2 511 bp，GL002872基因大小為2 805 bp，分別編碼836個氨基酸與935個氨基酸，蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量大小分別為92 100與103 200，等電點(diǎn)分別為pI 4.43與pI 4.33，酸性氨基酸殘基總數(shù)分別為104與106，堿性氨基酸殘基總數(shù)分別為52與46，疏水性總平均值（GRAVYA）分別為-0.416與-0.377，所以這兩種蛋白質(zhì)均為酸性、親水性蛋白質(zhì)。根據(jù)SOPMA對其二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，在Cadex2870的二級結(jié)構(gòu)中，9.45%為α螺旋結(jié)構(gòu) （Alpha helix，h），32.30%為擴(kuò)展長鏈（Extended strand，e），6.82% 為β轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)（Beta turn，t），51.44%為無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)；在Cadex2872的二級結(jié)構(gòu)中，8.02%為α螺旋結(jié)構(gòu)，32.73%為擴(kuò)展長鏈，6.20%為β轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)，53.05%為無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)。Cadex2870與Cadex2872都屬于糖苷水解酶GH49家族。Cadex2870與Cadex2872的蛋白質(zhì)序列與已報(bào)道的右旋糖酐酶蛋白質(zhì)序列相似度比較低。在構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中，Cadex2870與Cadex2872聚為一支，然后與Cellvibrio sp.KY-YJ-3（WP 151055493.1）聚為一支，Cadex2870和Cadex2872序列與其序列相似性分別為49.6%和47.9%，見圖2。

表3 Cadex2870與Cadex2872生物信息學(xué)分析Table 3 BioinformaticsanalysisofCadex2870 and Cadex2872

圖2 Cadex2870與Cadex2872系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of Cadex2870 and Cadex2872

使用 SWISS-MODLE以 AoDex（Arthrobacter oxidans KQ11）為模板進(jìn)行三維同源建模，Cadex2870與Cadex2872的整體結(jié)構(gòu)與AoDex的結(jié)構(gòu)整體相似，其相似性分別為54.53%與53.66%，但是在一些片層與環(huán)區(qū)中仍存在一些差異，見圖3，其氨基酸序列比對結(jié)果見圖4。

圖3 右旋糖苷酶Cadex2870和Cadex2872同源建模與Aodex的結(jié)構(gòu)比較Fig.3 Comparison between Aodex and Cadex2870/Cadex2872

圖4 Cadex2870、Cadex2872與Aodex氨基酸序列比對Fig.4 Sequences blast of Cadex2870，Cadex2872 and Aodex amino

2.3 重組右旋糖酐酶的純化

根據(jù)重組右旋糖酐酶所帶的His標(biāo)簽，經(jīng)鎳柱親和層析純化后，測其不同梯度洗脫液中的蛋白質(zhì)濃度與右旋糖酐酶活力，并進(jìn)行8 g/dL的SDSPAGE電泳檢測，結(jié)果見圖5。其相對分子質(zhì)量大小與經(jīng)氨基酸序列推測出的相對分子質(zhì)量大小一致。在鎳柱純化過程中，低濃度咪唑（20～70 mmol/L）能洗脫出非特異性結(jié)合蛋白質(zhì)；而目的蛋白質(zhì)需要高濃度的咪唑（150～250 mmol/L）才能被洗脫下來。重組右旋糖酐酶Cadex2870與Cadex2872經(jīng)鎳柱純化之后分別被純化了20.5倍與9.7倍，得率分別為76.7%與62.8%，純化之后右旋糖酐酶活力分別為16.2 U/mg 與 4.0 U/mg，見表4。

圖5 重組右旋糖酐酶Cadex2870（a）和Cadex2872（c）經(jīng)鎳柱純化的電泳圖以及不同濃度咪唑洗脫與蛋白質(zhì)濃度和酶活力Cadex2870（b）和 Cadex2872（d）的關(guān)系Fig.5 Purification of the recombinant dextranase Cadex2870 （a）and Cadex2872 （c）by Ni-column and the relationship between concentration of imidazole with protein and activity of dextranase Cadex2870（b）and Cadex2872（d）

表4 重組右旋糖酐酶的純化Table 4 Purification of recombinant dextranase

2.4 溫度及pH對重組右旋糖酐酶活性的影響

如圖6（a）所示，Cadex2870的最適催化溫度為45℃，Cadex2872的最適催化溫度為30℃，在35～50℃范圍內(nèi)，Cadex2870的活性要高于Cadex2872的活性；在20～30℃范圍內(nèi)，Cadex2872的活性高于Cadex2870 的活性。 如圖 6（b）所示，Cadex2870 與Cadex2872的最適催化pH分別為8和7，并且在pH 6～9范圍內(nèi)都具有良好的催化效率，而Cadex2872催化范圍相比于Cadex2870的催化范圍較廣，并且在較酸/堿性條件下催化效率要高于Cadex2870。

圖6 溫度（a）以及pH（b）對酶活性的影響Fig.6 Effect of temperature（a） and pH（b） on dextranase

2.5 重組右旋糖酐酶水解右旋糖酐產(chǎn)物分析

如圖7和表5所示，重組右旋糖酐酶Cadex2870與Cadex2872水解右旋糖酐T70的產(chǎn)物主要為異麥芽七糖、異麥芽五糖以及異麥芽四糖，其中，當(dāng)水解時間延長時，Cadex2870水解右旋糖酐的產(chǎn)物還伴隨有少量的異麥芽糖產(chǎn)生，并且異麥芽四糖的量要高于其他寡糖的量。

圖7 重組右旋糖酐酶水解右旋糖酐T70產(chǎn)物分析Fig.7 Products analysis of recombinant dextranases hydrolyzed dextran T70

表5 重組右旋糖酐酶水解右旋糖酐T70產(chǎn)物質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 5 Content of sugar in hydrolysates after enzymatic hydrolysis of dextran by recombinant dextranase

3 討論

對海洋細(xì)菌Catenovulum sp.DP03的全基因組進(jìn)行了測序，從其基因組中挖掘到兩個右旋糖酐酶基因。目前，已有少數(shù)的右旋糖酐酶的蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)已被成功解析，并上傳至Protein Date Bank（PDB）數(shù)據(jù)庫中，包括來源于Streptococcus mutans的右旋糖酐酶SmDex[15]、Thermoanaerobacter pseudethanolicus的右旋糖酐酶 TpDex[16]、Penicillium minioluteum的右旋糖酐酶Dex49A[4]以及海洋細(xì)菌Arthrobacter oxydans KQ11的右旋糖酐酶AoDex[17]。以海洋細(xì)菌A.oxydans KQ11的右旋糖酐酶AoDex為模板進(jìn)行三維同源建模，Cadex2870與Cadex2872的整體結(jié)構(gòu)與AoDex的結(jié)構(gòu)整體相似，在其N端與C端各有一個結(jié)構(gòu)域，AoDex的催化區(qū)域?yàn)镼418-D440，分別對應(yīng) Cadex2870的 Q431-D453以及Cadex2872的Q425-D447，且在催化位點(diǎn)處具有高度保守性；AoDex中的Asp439與Asp420分別為催化酸和堿，分別對應(yīng)Cadex2870的Asp433和Asp452，以及Cadex2872的Asp427和Asp446（圖4，紅色虛線方框內(nèi)）。

Cadex2870的最適催化溫度為45℃，Cadex2872的最適催化溫度為30℃，在低溫下，Cadex2872催化效率更高，這與一些冷適應(yīng)性酶性質(zhì)相似，例如冷適應(yīng)的β-卡拉膠酶、冷適應(yīng)的β-葡萄糖苷酶以及冷適應(yīng)的β-淀粉酶等等，他們在低溫下具有更高的活性[18-20]。Cadex2870與Cadex2872的最適催化pH分別為8和7，并且在pH 6～9范圍內(nèi)都具有良好的催化效率，而Cadex2872催化范圍相比于Cadex2870的催化范圍較廣，并且在較酸/堿性條件下催化效率要高于Cadex2870。陸源微生物所產(chǎn)的右旋糖酐酶絕大多數(shù)最適催化溫度都在45～65℃，最適催化pH在5.0～6.5，并且在低溫條件下催化效率較低[21-24]。該兩種重組右旋糖酐酶在較低溫度下有更高的活性，并且pH作用范圍廣，因此，該酶在工業(yè)應(yīng)用中具有更高的價值。例如，在低溫或者室溫條件下的生產(chǎn)過程中，無須加熱或者冷卻，從而降低生產(chǎn)的成本；還可通過溫和的熱處理使酶失活，從而快速終止反應(yīng)[25]。另外，該酶的最適作用溫度與pH條件接近人的口腔環(huán)境，將該酶作為口腔牙菌斑的防治藥物具有潛在價值。并且越來越多的證據(jù)表明，堿的產(chǎn)生在pH穩(wěn)態(tài)中起著重要作用，pH穩(wěn)態(tài)可能調(diào)節(jié)齲病的發(fā)生和發(fā)展[26-27]。因此，該右旋糖酐酶在用于開發(fā)新的海洋藥物來治療這種情況具有重要意義。

Cadex2870與Cadex2872水解右旋糖酐T70的產(chǎn)物主要為異麥芽七糖、異麥芽五糖以及異麥芽四糖，當(dāng)水解時間延長時，Cadex2870水解右旋糖酐的產(chǎn)物還伴隨有少量的異麥芽糖產(chǎn)生，該兩種重組右旋糖酐酶與目前所報(bào)道的絕大多數(shù)右旋糖酐酶的性質(zhì)相似，他們催化水解右旋糖酐主要產(chǎn)生異麥芽寡糖，而葡萄糖的含量很低或者沒有，這類右旋糖酐酶被鑒定為內(nèi)切型右旋糖酐酶，他們從右旋糖酐的內(nèi)部水解α-1，6-糖苷鍵[28-32]。目前所報(bào)道的右旋糖酐酶絕大多數(shù)都屬于內(nèi)切型右旋糖酐酶，其能夠水解右旋糖酐產(chǎn)生異麥芽寡糖，具有很好的應(yīng)用價值。異麥芽寡糖不會被人體和動物消化吸收，但是能夠被腸道的有益微生物雙歧桿菌所利用，促使雙歧桿菌增殖，但腸道內(nèi)其他有害微生物如大腸桿菌、金色葡萄球菌則不能利用此糖，從而抑制了腸道有害微生物的生長，使腸道內(nèi)微生態(tài)向良性循環(huán)調(diào)整。如維持腸道正常細(xì)菌群平衡，抑制病原菌與腐敗菌生長，維持腸道正常功能；降低膽固醇水平，防治高血壓；增強(qiáng)人體免疫功能；雙歧桿菌還具有抗腫瘤活性[33-35]。異麥芽寡糖還具有甜度低、難以被胃酶消化，不會改變血液中胰島素水平，也不會增加血糖等特點(diǎn)，所以糖尿病患者可放心食用[33，36]。除此之外，異麥芽寡糖不會被口腔鏈球菌利用，因而能夠防止齲齒[32-33]。因此，利用該兩種重組右旋糖酐酶水解右旋糖酐產(chǎn)生一系列異麥芽寡糖，在生產(chǎn)益生元等功能性食品方面具有很好的前景。

4 結(jié) 語

從海洋細(xì)菌Catenovulum sp.DP03的全基因組中挖掘出兩個右旋糖酐酶基因，其中GL002870基因大小為2 511 bp，編碼836個氨基酸，蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量大小為 92 100，等電點(diǎn)為 pI 4.43；GL002872基因大小為2 805 bp，編碼935個氨基酸，蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量大小為103 200，等電點(diǎn)為pI 4.33，都屬于酸性、親水性蛋白質(zhì)。在Cadex2870的二級結(jié)構(gòu)中，9.45%為α螺旋結(jié)構(gòu)，32.30%為擴(kuò)展長鏈，6.82%為β轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)，51.44%為無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)；在Cadex2872的二級結(jié)構(gòu)中，8.02%為α螺旋結(jié)構(gòu)，32.73%為擴(kuò)展長鏈，6.20%為 β轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)，53.05%為無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)。Cadex2870與Cadex2872都屬于糖苷水解酶GH49家族，在系統(tǒng)發(fā)育樹中，Cadex2870與Cadex2872聚為一支，然后與Cellvibrio sp.KY-YJ-3聚為一支。Cadex2870與Cadex2872的3D結(jié)構(gòu)與AoDex的結(jié)構(gòu)整體相似，其相似性分別為54.53%與53.66%，AoDex的催化區(qū)域?yàn)镼418-D440，分別對應(yīng)Cadex2870的Q431-D453以及Cadex2870的Q425-D447，且在催化位點(diǎn)處具有高度保守性。將Cadex2870與Cadex2872基因克隆表達(dá)后，得到純化的Cadex2870的酶活力為16.2 U/mg，Cadex2872的酶活力為4 U/mg，分別被純化了20.5與9.7倍，得率分別為76.7%與62.8%。Cadex2870與Cadex2872的最適催化溫度分別為45℃與30℃，最適催化pH分別為7和8；Cadex2870水解右旋糖酐的產(chǎn)物為異麥芽七糖、異麥芽五糖、異麥芽四糖以及少量異麥芽糖；Cadex2872水解右旋糖酐的產(chǎn)物為異麥芽七糖、異麥芽五糖以及異麥芽四糖，所以，這兩種右旋糖酐酶均屬于內(nèi)切型右旋糖酐酶。