一種快速提取三孢布拉霉基因組的方法

董雪田，朱愷麗，曲音波，楊培龍，余曉斌，羅 瑋*

（1.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122；2.山東大學(xué) 微生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266237；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部 飼料生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 飼料研究所，北京 100081）

番茄紅素和β-胡蘿卜素具有很強(qiáng)的抗氧化能力，具有提高免疫力、減少細(xì)胞或組織損傷、預(yù)防多種癌癥及心血管疾病、降低血清膽固醇、預(yù)防白內(nèi)障等功效，近年來(lái)被廣泛應(yīng)用于食品、藥品、保健品和動(dòng)物飼料等行業(yè)[1]。三孢布拉霉屬于異宗接合菌，高產(chǎn)類胡蘿卜素，且不需要特殊的生長(zhǎng)條件，是一種理想的β-胡蘿卜素和番茄紅素工業(yè)生產(chǎn)菌株[1-4]，是工業(yè)上用于生產(chǎn)食品級(jí)β-胡蘿卜素和番茄紅素的主要微生物[4]，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。由于傳統(tǒng)誘變選育方法存在盲目性和低效性，利用系統(tǒng)代謝工程和合成生物學(xué)方法進(jìn)行高產(chǎn)菌株的選育已經(jīng)成為一個(gè)重要的研究方向。由于絲狀真菌細(xì)胞壁厚，對(duì)其基因組提取存在諸多問(wèn)題，如方法煩瑣、耗時(shí)費(fèi)力，阻礙了后續(xù)基因工程和代謝工程的操作。目前常用的絲狀真菌基因組提取方法有CTAB法[5]、氯化芐法[6-8]、液氮研磨法[9-11]等，這些方法普遍存在耗時(shí)長(zhǎng)、過(guò)程煩瑣、添加有毒試劑等問(wèn)題，后來(lái)發(fā)展起來(lái)的一些改進(jìn)的方法，如改進(jìn)的CTAB法[8，12-13]，操作安全性較高、簡(jiǎn)便性較強(qiáng)、DNA純度也進(jìn)一步提高；除此以外也發(fā)展了一些新的方法，如微波法[8，14]、凍融法[15]、試劑盒法[16]等，分別在經(jīng)濟(jì)性、安全性或簡(jiǎn)便性方面有所改進(jìn)，但依然要經(jīng)過(guò)抽提、沉淀、洗滌、溶解等4步的重復(fù)，耗費(fèi)時(shí)間依然不少于2 h，再加上種子液的培養(yǎng)，使得整個(gè)周期也很長(zhǎng)，且操作過(guò)程中還會(huì)用到一些毒性較大的試劑。

ITS為真菌 rDNA中 18S rDNA、5.8S rDNA和28S rDNA基因間隔序列，其長(zhǎng)度和序列變化較大，常用于真菌菌種鑒定[17-19]；wc-1a和wc-1b[20]為三孢布拉霉中的兩個(gè)光受體基因；crgA[21]為三孢布拉霉中的一種與類胡蘿卜素合成調(diào)控相關(guān)的負(fù)調(diào)控因子編碼基因；carB[22]為八氫番茄紅素脫氫酶編碼基因。首先篩選出了影響三孢布拉霉基因組釋放的主要因素NaOH，然后對(duì)NaOH濃度、煮沸時(shí)間及基因組來(lái)源（上清液或處理后的菌苔）進(jìn)行了優(yōu)化，而后又對(duì)所提取基因組的穩(wěn)定性以及對(duì)后續(xù)測(cè)序、酶切等實(shí)驗(yàn)的影響進(jìn)行了驗(yàn)證，最后，從三孢布拉霉的其他基因和其他絲狀真菌ITS序列兩個(gè)方面進(jìn)行了基因組快速提取法普適性的分析，確定了一種對(duì)多種絲狀真菌具有較好適用性的基因組快速提取方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 接合菌綱的三孢布拉霉（Blakeslea trispora）負(fù)菌 NRRL2896、卷枝毛霉（Mucor circinelloides）MU 244，絲孢綱的產(chǎn)黃青霉（Penicillium chrysogenum）、煙曲霉（Aspergillus fumigatus）和土曲霉（Aspergillus terreus）、半知菌綱的塔賓曲霉（Aspergillus tubingensi）及散囊菌綱的亮白曲霉（Aspergillus candidus）：作者所在實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 引物 本研究所用引物見(jiàn)表1。

表1 本實(shí)驗(yàn)所用引物Table 1 Primes used in this study

1.1.3 培養(yǎng)基

1） PDA：去皮土豆 200 g/L，葡萄糖 20 g/L，瓊脂粉20 g/L；pH自然。

2）種子液：玉米粉30 g/L，黃豆粉 50 g/L，KH2PO41.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L；pH 6.5。

1.1.4 試劑及試劑盒 NaCl、NaOH、葡萄糖、KH2PO4、MgSO4·7H2O：購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；2×Rapid Taq Master Mix：購(gòu)于南京諾唯贊生物科技有限公司；QuickCut KpnI：購(gòu)于寶日醫(yī)生物技術(shù) （北京）有限公司；溶菌酶、蝸牛酶和纖維素酶：購(gòu)于北京索萊寶生物科技有限公司；液氮：購(gòu)于無(wú)錫市太湖氣體有限公司；快速DNA產(chǎn)物純化試劑盒、植物基因組DNA提取試劑盒、50×Tris-乙酸緩沖液：購(gòu)于康為世紀(jì)生物科技有限公司；瓊脂糖：購(gòu)于生工生物工程（上海）股份有限公司；瓊脂粉：購(gòu)于大連美侖生物技術(shù)有限公司；土豆、玉米粉、黃豆粉：購(gòu)于本地超市。

點(diǎn) 評(píng)：開(kāi)學(xué)第一天，老師和同學(xué)都會(huì)變得格外親切，作者通過(guò)細(xì)節(jié)的捕捉與刻畫(huà)向我們呈現(xiàn)了校園生活的溫馨與快樂(lè)，真誠(chéng)自然。

1.2 方法

1.2.1 影響三孢布拉霉基因組提取效果關(guān)鍵因素的篩選 選擇煮沸30 min、加20 mmol/L NaOH煮沸30 min、穩(wěn)滲液（0.6 mol/L NaCl）配制的復(fù)合酶液（2 g/dL溶壁酶+3 g/dL纖維素酶+3 g/dL蝸牛酶）[21]酶解30 min、復(fù)合酶液酶解30 min后煮沸30 min等4種方法處理B.trispora NRRL2896菌苔，以處理后的菌苔為基因組源，對(duì)crgA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增引物（crgA-F和crgA-R）序列見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)體系和程序見(jiàn)表2～3。

表2 2×Rapid Taq Master Mix PCR體系Table 2 PCR components of 2×Rapid Taq Master Mix

表3 2×Rapid Taq Master Mix PCR程序Table 3 PCR protocol of 2×Rapid Taq Master Mix

1.2.2 NaOH濃度、煮沸時(shí)間及基因組源對(duì)基因組提取效果的影響 選擇不同的NaOH濃度、不同的煮沸時(shí)間和不同的基因組源（處理后的菌苔或上清液）對(duì)btITS進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增引物 （ITS1和ITS4）序列見(jiàn)表1，PCR體系和程序見(jiàn)1.2.1，PCR結(jié)束后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。

1.2.3 提取的基因組穩(wěn)定性測(cè)定 撕取約25 mm2的三孢布拉霉NRRL2896菌苔于50 μL濃度為20、30、40、50 mmol/L NaOH 中，6℃或 25 ℃靜置，分別于不同時(shí)間點(diǎn)取樣，測(cè)dsDNA質(zhì)量濃度及純度，并用Origin8.0繪制質(zhì)量濃度變化曲線；取25℃靜置60 h的樣品上清液，擴(kuò)增btITS，并通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證；分別以NaOH處理菌苔所提取基因組與試劑盒提取的基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。

1.2.4 NaOH處理對(duì)后續(xù)測(cè)序、酶切等實(shí)驗(yàn)的影響取約 25 mm2菌苔于 50 μL濃度為 40 mmol/L NaOH中，靜置10 min，取上清液為基因組源，PCR擴(kuò)增btITS，用快速DNA產(chǎn)物純化試劑盒純化，取少量送金唯智測(cè)序，根據(jù)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行酶切位點(diǎn)分析，選具有單酶切位點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，酶切體系見(jiàn)表4。

表4 酶切體系Table 4 Components of QuickCut KpnI digestion

1.2.5 基因組快速提取法普適性分析 從擴(kuò)增同一菌株的不同基因和不同菌株的ITS兩個(gè)方面進(jìn)行基因組快速提取法普適性分析。

1）同一菌株不同基因 取約25 mm2三孢布拉霉菌苔于50 μL濃度為40 mmol/L NaOH中，靜置10 min，取上清液為基因組源擴(kuò)增光受體基因wc-1a、wc-1b、類胡蘿卜素合成負(fù)調(diào)控因子編碼基因crgA和八氫番茄紅素脫氫酶編碼基因carB，PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。

2）不同菌株ITS 取少量卷枝毛霉、產(chǎn)黃青霉、煙曲霉、塔賓曲霉、亮白曲霉和土曲霉菌苔或菌絲體，浸于50 μL濃度為40 mmol/L NaOH中，靜置10 min，取上清液為基因組源，擴(kuò)增ITS，PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。

1.2.6 數(shù)理統(tǒng)計(jì) 所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，采用SPSS 20.0進(jìn)行數(shù)理統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 影響三孢布拉霉基因組提取的關(guān)鍵因素

圖1 影響三孢布拉霉基因組提取關(guān)鍵因素的篩選Fig.1 Screening of key factors affecting the release of Blakeslea trispora genome

2.2 基因組提取所需的最適NaOH濃度、煮沸時(shí)間及基因組源的確定

一般進(jìn)行細(xì)菌菌落PCR時(shí)，直接挑取菌落作為基因組源，部分革蘭氏陽(yáng)性菌無(wú)法直接進(jìn)行菌落PCR，需要通過(guò)煮沸或凍融法進(jìn)行破壁處理后，離心取上清液后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。絲狀真菌基因組提取大多將基因組提取純化[12-14]，無(wú)須考慮基因組源的選擇。張曉利等[23]通過(guò)凍融法對(duì)19種絲狀真菌進(jìn)行破壁處理后，離心取上清液作為基因組源進(jìn)行PCR。杜克久等[24]取孢子制成孢子懸液，以孢子懸液為基因組源進(jìn)行PCR。作者用20 mmol/L NaOH煮沸處理菌苔后，菌苔仍為固態(tài)，并未溶于NaOH溶液，此時(shí)，菌苔中的基因組是否釋放到上清液中，基因組源該如何選擇，也需要進(jìn)一步確定。

以20 mmol/L NaOH處理菌苔10 min，以處理后的菌苔為基因組源擴(kuò)增crgA后雖有目的條帶，但雜帶明顯，菌苔處理?xiàng)l件需進(jìn)行優(yōu)化。作者對(duì)煮沸時(shí)間、NaOH濃度及基因組源的選擇（上清液或處理后的菌苔）進(jìn)行了優(yōu)化。向不同離心管中分別加入50 μL不同濃度的NaOH溶液，取約25 mm2菌苔于離心管，煮沸不同的時(shí)間后，分別取上清液和處理后的菌苔為基因組源，擴(kuò)增btITS，結(jié)果見(jiàn)圖2。當(dāng)NaOH濃度為0、5、10 mmol/L時(shí)，并非所有條件均可擴(kuò)增出btITS，可能是由于NaOH濃度較低（低于20 mmol/L）時(shí)，對(duì)菌絲體的裂解不充分。此外，是否擴(kuò)增出目的條帶與煮沸時(shí)間無(wú)正相關(guān)；當(dāng)NaOH濃度達(dá)到20 mmol/L后，以上清液為基因組源，均可擴(kuò)增出btITS。而以處理后的菌苔為基因組源，僅部分樣品能擴(kuò)增出btITS，可能是由于20 mmol/L以上的NaOH溶液處理菌苔后，均可釋放一定量的基因組到體系中，因而在PCR過(guò)程中，取體系中的上清液為基因組源，均可擴(kuò)增出目的條帶；而以處理過(guò)的菌苔為基因組源時(shí)，菌苔中剩余未釋放的基因組由于暴露于PCR體系中導(dǎo)致不穩(wěn)定，使得PCR體系中其他組分與菌苔中基因組的接觸受阻，因而有時(shí)無(wú)法擴(kuò)增出目的條帶。此外，當(dāng)NaOH濃度到達(dá)20 mmol/L時(shí)，以各種煮沸條件處理菌苔后的上清液為基因組源，均可擴(kuò)增出目的條帶，即擴(kuò)增效果與煮沸時(shí)間同樣無(wú)正相關(guān)。添加20～40 mmol/L NaOH煮沸0 min時(shí)也可擴(kuò)增出目的條帶，可能是由于將菌苔浸入NaOH后到吸取上清液的片刻，部分細(xì)胞壁裂解，釋放出基因組。

圖2 最適NaOH濃度、煮沸時(shí)間及基因組源的確定Fig.2 Determination of the optimal concentration of NaOH and the time of boiling and the source of genome

2.3 提取的基因組穩(wěn)定性分析

將菌苔靜置于NaOH溶液中片刻，即可成功提取出基因組，但高質(zhì)量濃度NaOH會(huì)使DNA降解，無(wú)法確定20～50 mmol/L NaOH較長(zhǎng)時(shí)間存在時(shí)是否會(huì)對(duì)基因組穩(wěn)定性產(chǎn)生影響。作者通過(guò)測(cè)定不同時(shí)間DNA質(zhì)量濃度與純度以及PCR擴(kuò)增目的基因，并通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳觀察其條帶的完整性來(lái)確定基因組的穩(wěn)定性。

分別取約25 mm2菌苔于20～50 mmol/L NaOH中，6℃靜置，并于不同時(shí)間點(diǎn)取樣測(cè)DNA質(zhì)量濃度與純度，繪制質(zhì)量濃度變化曲線，見(jiàn)圖3（a）。當(dāng)靜置108 h后，DNA質(zhì)量濃度依舊沒(méi)有明顯的下降趨勢(shì)，純度也較高（OD260/OD2801.8～2.0），可能與溫度較低有關(guān)。取約25 mm2菌苔于20～50 mmol/L NaOH中，25℃靜置60 h取樣，繪制質(zhì)量濃度變化曲線，見(jiàn)圖3（b）。60 h時(shí)，質(zhì)量濃度依然沒(méi)有下降趨勢(shì)。根據(jù)DNA質(zhì)量濃度變化曲線，將菌苔浸入20～50 mmol/L NaOH后，DNA質(zhì)量濃度迅速上升，并在約5 min后上升速度減慢，10～15 min后DNA質(zhì)量濃度達(dá)到最高值。曲線中DNA質(zhì)量濃度高低與所用NaOH濃度并非正相關(guān)，可能是撕取的菌苔面積大小不同，但DNA質(zhì)量濃度均在150～350 ng/μL，完全滿足PCR擴(kuò)增的要求。

圖3 不同溫度下DNA質(zhì)量濃度變化Fig.3 Changing of DNA concentration at different temperature

取25℃靜置60 h的上清液為基因組源，PCR擴(kuò)增btITS，瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，見(jiàn)圖4。結(jié)果表明，全部都能擴(kuò)增出目的條帶，條帶清晰，無(wú)雜帶。因此，至少在25℃靜置60 h或6℃靜置108 h后，基因組仍可以穩(wěn)定存在。

圖4 以NaOH溶液中25℃靜置60 h處理的上清液為基因組源擴(kuò)增的btITSFig.4 btITS exemplified by the genome source that stand in NaOH solutions at 25℃for 60 h

大多數(shù)絲狀真菌基因組提取方法都將基因組分離純化，因而穩(wěn)定性較好，有的甚至可在4℃存放6個(gè)月[12]，但這些方法操作煩瑣，耗時(shí)長(zhǎng)，有的還需要進(jìn)行一些特殊處理或使用昂貴試劑，甚至存在一定的危險(xiǎn)性。因此，根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需求，可對(duì)基因組穩(wěn)定性與操作簡(jiǎn)便性、安全性和經(jīng)濟(jì)性等進(jìn)行一定的取舍。當(dāng)進(jìn)行大批量轉(zhuǎn)化子篩選或進(jìn)行菌種鑒定時(shí)，所提取基因組的長(zhǎng)期穩(wěn)定性對(duì)實(shí)驗(yàn)并無(wú)太大影響，而簡(jiǎn)便性、安全性和經(jīng)濟(jì)性相對(duì)更為重要。因此，本研究?jī)H進(jìn)行了較短時(shí)期的基因穩(wěn)定性研究，未進(jìn)行更長(zhǎng)時(shí)間的穩(wěn)定性測(cè)定。

2.4 NaOH處理對(duì)基因組完整性的影響

NaOH處理菌苔后，不影響PCR的擴(kuò)增效果。為進(jìn)一步確定NaOH對(duì)測(cè)序及酶切等實(shí)驗(yàn)的影響，分別以NaOH裂解提取的基因組和傳統(tǒng)液氮研磨后試劑盒提取的基因組為模板，擴(kuò)增btITS并測(cè)序，兩種方法無(wú)明顯差異，且不影響測(cè)序，見(jiàn)圖5。周禮紅[12]對(duì)提取的基因組DNA進(jìn)行酶解，得到較為均一的完全酶解帶，證明該方法提取的基因組DNA不存在影響酶切的干擾因子，但由于基因組上酶切位點(diǎn)數(shù)量很大，該方法無(wú)法識(shí)別具體的序列變化，因此對(duì)特定序列進(jìn)行酶切更具說(shuō)服力。根據(jù)測(cè)序結(jié)果對(duì)三孢布拉霉btITS進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)分析，選擇具有單靶點(diǎn)的KpnI對(duì)純化的PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，酶切效果良好，見(jiàn)圖6。說(shuō)明NaOH處理未對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生影響，可能是由于NaOH處理菌苔后，體系pH較原NaOH溶液已有所降低 （已通過(guò)pH試紙檢測(cè)驗(yàn)證），而加入PCR體系中的模板量較少，NaOH濃度再次稀釋50倍，且后續(xù)實(shí)驗(yàn)中又經(jīng)過(guò)了純化等步驟，NaOH被去除或再次稀釋，因而未對(duì)基因完整性造成影響。

圖5 以不同方法提取的基因組為模板擴(kuò)增的btITSFig.5 Amplification of btITS with genome extracted by different methods

圖6 btITSPCR產(chǎn)物和酶切產(chǎn)物Fig.6 PCR product and the digestion product of btITS

2.5 方法普適性分析

該方法簡(jiǎn)便快速，具有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，但能否在各種絲狀真菌中廣泛應(yīng)用，還需進(jìn)一步確定。后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選擇在50 μL濃度為40 mmol/L NaOH中靜置10 min作為菌苔或菌絲體處理?xiàng)l件。

2.5.1 對(duì)同一菌株不同基因的普適性 ITS區(qū)存在于各種真核生物中，為最常用的驗(yàn)證基因，大多研究?jī)H通過(guò)這些序列進(jìn)行驗(yàn)證分析，但I(xiàn)TS區(qū)較短，無(wú)法檢測(cè)DNA模板的完整性[23]，因此，對(duì)方法的適用性的確定，還需要通過(guò)更多的基因進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證。曾東方等[15]利用隨機(jī)引物進(jìn)行PCR，獲得DNA指紋圖譜，但由于缺少對(duì)照，無(wú)法判斷圖譜的完整性及重復(fù)性。本研究中，通過(guò)擴(kuò)增三孢布拉霉中其他4種序列較長(zhǎng)的基因來(lái)確定該菌苔處理方法對(duì)三孢布拉霉基因整體的適用性。

用40 mmol/L NaOH處理三孢布拉霉負(fù)菌10 min，擴(kuò)增 wc-1a（2 286 bp）、wc-1b（2 456 bp）、crgA（1 836 bp）和 carB（1 958 bp），條帶大小均正確，且陽(yáng)性率為100%，適用于三孢布拉霉中其他基因的擴(kuò)增，見(jiàn)圖7。

圖7 以快速法提取的基因組為模板擴(kuò)增的wc-1a、wc-1b、crgA和carBFig.7 Amplification of wc-1a，wc-1b，crgA and carB by template extracted by the rapid method

2.5.2 對(duì)不同菌株的普適性 傳統(tǒng)的以及一些改進(jìn)的絲狀真菌基因組提取方法[13-14，23]均存在著一定的普適性，為確定本研究方法對(duì)其他絲狀真菌是否也存在適用性，選取另外6種絲狀真菌進(jìn)一步研究。用40 mmol/L NaOH處理卷枝毛霉、產(chǎn)黃青霉、煙曲霉、塔賓曲霉、亮白曲霉和土曲霉10 min，取上清液擴(kuò)增ITS，卷枝毛霉、產(chǎn)黃青霉、煙曲霉和土曲霉陽(yáng)性率均為100%，但塔賓曲霉和亮白曲霉擴(kuò)增陽(yáng)性率較低，見(jiàn)圖8?？赡茉揘aOH濃度和處理時(shí)間并非其最適條件，從以上結(jié)果可知，NaOH處理法具有一定的普適性，但具體處理?xiàng)l件（NaOH濃度和靜置時(shí)間）可能需隨菌種不同進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。

圖8 以快速提取的卷枝毛霉、產(chǎn)黃青霉、煙曲霉、塔賓曲霉、亮白曲霉和土曲霉基因組為模板擴(kuò)增的ITSFig.8 Amplification of ITS by genome of M.circinelloides，P.chrysogenum,A.fumigatus,A.tubingensi,A.candidus and A.terreus extracted by the rapid method

2.6 三孢布拉霉基因組快速提取法與傳統(tǒng)方法的比較

絲狀真菌基因組提取方法較多，但常用的流程基本都是擴(kuò)大培養(yǎng)、收集菌體、液氮冷凍、研磨破碎菌體、萃取、沉淀、洗滌、溶解基因組，并重復(fù)萃取、沉淀、洗滌和溶解這4個(gè)步驟數(shù)次，因而操作煩瑣、耗時(shí)較長(zhǎng)。表5將快速提取法與最傳統(tǒng)方法進(jìn)行比較，其他優(yōu)化的提取方法未詳細(xì)列出，但快速提取法的優(yōu)點(diǎn)在與其他方法比較時(shí)依然適用。

表5 基因組快速提取法與傳統(tǒng)試劑盒提取法比較Table 5 Comparison of traditional genome extraction method with the rapid method and the traditional kit extraction

3 結(jié) 語(yǔ)

真菌具有復(fù)雜的、動(dòng)態(tài)的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，在抵御外界刺激過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[25]。絲狀真菌細(xì)胞壁主要由葡聚糖、幾丁質(zhì)、殼聚糖、甘露聚糖、糖蛋白等組成[26-28]，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，外界物質(zhì)不易穿透，因而無(wú)法像原核生物那樣不經(jīng)過(guò)處理或經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單處理后即可進(jìn)行菌落PCR。因此，當(dāng)對(duì)絲狀真菌進(jìn)行基因編輯操作后，篩選轉(zhuǎn)化子的工作便非常耗時(shí)耗力，且無(wú)法大批量進(jìn)行。本研究中，先篩選出影響三孢布拉霉基因組釋放的關(guān)鍵因素，確定了在添加20 mmol/L NaOH煮沸30 min后，取菌苔作為基因組源可擴(kuò)增出目的條帶；然后對(duì)NaOH濃度、煮沸時(shí)間及基因組源（上清液或處理后的菌苔）進(jìn)行了優(yōu)化。當(dāng)NaOH濃度達(dá)到20 mmol/L后，以上清液為基因組源均可擴(kuò)增出目的條帶。對(duì)所提取基因組的穩(wěn)定性及其對(duì)后續(xù)測(cè)序、酶切等實(shí)驗(yàn)的影響進(jìn)行了驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)快速法提取的基因組至少在25℃靜置60 h或6℃靜置108 h后質(zhì)量濃度（150～350 ng/μL）與純度 （OD260/OD2801.8～2.0）依然非常理想，用于PCR時(shí)與傳統(tǒng)基因組提取法效果無(wú)明顯差異，且不影響后續(xù)基因測(cè)序和對(duì)基因片段的酶切等研究；最后，從三孢布拉霉其他基因和其他絲狀真菌ITS序列兩個(gè)方面進(jìn)行了基因組快速提取法普適性的分析，發(fā)現(xiàn)在40 mmol/L NaOH處理10 min的條件下，三孢布拉霉中wc-1a、wc-1b、crgA和carB的擴(kuò)增的陽(yáng)性率均為100%，卷枝毛霉、產(chǎn)黃青霉、煙曲霉和土曲霉ITS的擴(kuò)增陽(yáng)性率也為100%，但塔賓曲霉和亮白曲霉ITS的陽(yáng)性率不高，只有30%，可能是因?yàn)樵摋l件對(duì)其而言非最佳提取條件，需要對(duì)NaOH濃度和處理時(shí)間重新進(jìn)行優(yōu)化。從以上結(jié)果可知，NaOH處理法對(duì)多種絲狀真菌基因組的快速提取具有較好的適用性，但最適處理?xiàng)l件需依照不同菌株進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。由于過(guò)高的NaOH濃度會(huì)對(duì)基因組的穩(wěn)定性產(chǎn)生影響，過(guò)長(zhǎng)的NaOH處理時(shí)間違背了快速提取法的快速性，因此無(wú)法確定一個(gè)既相對(duì)溫和又適用于各種絲狀真菌的處理?xiàng)l件。針對(duì)不同的菌種，可通過(guò)控制NaOH處理時(shí)間并對(duì)NaOH濃度進(jìn)行簡(jiǎn)單的優(yōu)化來(lái)確定其最適處理?xiàng)l件。

基因組常規(guī)提取法需要先對(duì)目的菌株進(jìn)行種子培養(yǎng)，然后收集菌體，經(jīng)液氮研磨后利用試劑盒或其他自備的試劑進(jìn)行基因組的萃取、沉淀、洗滌、溶解，整個(gè)過(guò)程耗時(shí)很長(zhǎng)，需要一些設(shè)備及試劑的支持，既耗時(shí)耗力，還存在一定的安全隱患。而快速提取法只經(jīng)過(guò)NaOH靜置處理一步，操作簡(jiǎn)便，耗時(shí)非常短，所需材料少，不需要特殊設(shè)備，既可少量提取，也可大量制備，且不影響后續(xù)分子操作，具有很高的經(jīng)濟(jì)性、簡(jiǎn)便性與高效性，為絲狀真菌大規(guī)模基因編輯提供了有利條件。