MAD2L1/CAMK2A/PTTG1基因簇失調(diào)維持子宮內(nèi)膜癌干性特征

鄭 菁，張軼雯，潘宗富

1浙江省醫(yī)療健康集團(tuán)杭州醫(yī)院藥劑科，杭州 310022

2浙江省人民醫(yī)院 杭州醫(yī)學(xué)院附屬人民醫(yī)院藥學(xué)部，杭州 310014

3浙江省內(nèi)分泌腺體疾病診治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310014

子宮內(nèi)膜癌(uterine corpus endometrial carcinoma，UCEC)是最常見的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一，占女性惡性腫瘤的7%，發(fā)病率呈現(xiàn)逐年增高及年輕化趨勢[1]。盡管常規(guī)臨床治療效果良好，但復(fù)發(fā)和耐藥仍是目前治療的瓶頸。越來越多的研究表明，UCEC存在一定比例的腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells，CSCs)，并與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)及耐藥密切相關(guān)[2- 5]。CSCs具有正常成體干細(xì)胞相似的特性，可自我更新、無限增殖以及多向分化，同時亦保留腫瘤細(xì)胞的惡性特征。CSCs是UCEC復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的潛在關(guān)鍵細(xì)胞群，針對性消除CSCs或抑制CSCs增殖分化可望從根源上提升治療效果[6- 8]。因此，深入研究UCEC干性特征及調(diào)控機(jī)制將有助于揭示UCEC的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制，并發(fā)現(xiàn)潛在治療靶點(diǎn)。

隨著人工智能及深度學(xué)習(xí)等算法的逐漸成熟與推廣，腫瘤干性特征的研究也形成了新的評價方式。干性指數(shù)是Malta等[9]于2018年提出用于計算組織樣本干性程度的評價模型。通過一類邏輯回歸機(jī)器學(xué)習(xí)算法對包含人類干細(xì)胞及其分化的3個胚層祖細(xì)胞的數(shù)據(jù)集提取轉(zhuǎn)錄組和表觀遺傳特征集，作者獲得基于mRNA表達(dá)及DNA甲基化的干性指數(shù)(mRNAsi及mDNAsi)，并可用于評估CSCs的生物學(xué)過程及腫瘤失分化程度。目前，UCEC的干性特征及調(diào)控機(jī)制仍未完全明確。因此，本研究將基于UCEC轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，通過計算不同樣本mRNAsi評估UCEC與正常組織及不同病理特征腫瘤組織的干性差異，并考察mRNAsi的預(yù)后意義，進(jìn)而利用高頻子通路挖掘算法(high-frequency sub-pathways mining approach，HiFreSP)篩選與預(yù)后密切相關(guān)的關(guān)鍵子通路，最后，通過加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析與mRNAsi密切相關(guān)的基因模塊及關(guān)鍵基因。通過上述研究，將描繪UCEC的干性特征，并挖掘調(diào)控腫瘤干性特征的關(guān)鍵基因，為UCEC的惡性演進(jìn)分子機(jī)制研究提供新思路。

資料和方法

基因表達(dá)譜獲取及注釋從UCSC Xena數(shù)據(jù)庫(https：//xenabrowser.net/datapages/)獲取癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas，TCGA)來源的UCEC轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)及gencode.v22.annotation.gene.probeMap注釋文件，樣本包括UCEC組織537例(Ⅰ期334例，Ⅱ期50例，Ⅲ期124例，Ⅳ期29例)，正常組織35例。由于數(shù)據(jù)集臨床樣本信息有限，尚無法明確正常組織具體來源。在R3.5.1環(huán)境下，將樣本的轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果合并為1個矩陣，利用gencode.v22.annotation.gene.probeMap文件進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)注釋，將基因名稱從Ensembl ID轉(zhuǎn)換為基因符號，隨后采用edgeR包對轉(zhuǎn)錄組測序的Counts數(shù)據(jù)進(jìn)行TMM標(biāo)準(zhǔn)化。

樣本mRNA干性指數(shù)計算mRNA干性指數(shù)(mRNA stemness index，mRNAsi)是一種計算組織樣本干性程度的評價模型，可用于評估腫瘤細(xì)胞與干細(xì)胞之間的相似程度，從而量化CSCs干性。從SYNAPSE平臺獲取人源干細(xì)胞mRNA數(shù)據(jù)(https：//www.synapse.org/#!Synapse：syn2247799)。在R3.5.1環(huán)境下，利用gelnet、biomaRt和dplyr包，結(jié)合SYNAPSE平臺的干細(xì)胞數(shù)據(jù)，通過一類邏輯回歸機(jī)器學(xué)習(xí)算法構(gòu)建mRNAsi預(yù)測模型(詳細(xì)流程參照https：//bioinformaticsfmrp.github.io/PanCanStem_Web/)，并將上述標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)矩陣導(dǎo)入構(gòu)建好的mRNAsi預(yù)測模型，計算各UCEC樣本的mRNAsi。

差異基因分析在R3.5.1環(huán)境下，利用edgeR包分別篩選UCEC與正常組織和預(yù)后模型中mRNAsi指數(shù)高低組別(基于最佳P值分組)之間的差異基因，并取兩者交集，以篩選UCEC特異變化差異基因，利用Benjamini & Hochberg方法進(jìn)行多重檢驗(yàn)矯正。篩選標(biāo)準(zhǔn)為錯誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate，F(xiàn)DR)<0.05，|log2(FC)|≥1。

Kaplan-Meier生存分析從TCGA獲取UCEC轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)及臨床預(yù)后信息，并在R3.5.1環(huán)境下，利用survival包和survminer包進(jìn)行Kaplan-Meier生存分析，計算mRNAsi和候選基因的最佳分組，比較患者總生存期差異，篩選具有預(yù)后意義的標(biāo)志物。利用Log-Rank檢驗(yàn)兩組生存曲線差異，采用Benjamini & Hochberg方法進(jìn)行多重檢驗(yàn)矯正。

子通路預(yù)后標(biāo)志物挖掘?yàn)檫M(jìn)一步挖掘預(yù)后標(biāo)志物，采用HiFreSP對差異基因進(jìn)行富集及子通路識別。HiFreSP利用隨機(jī)化法將通路隨機(jī)劃分為子集，然后通過高頻打分的方法識別穩(wěn)健的預(yù)后基因特征。本研究采用HiFreSP對差異基因進(jìn)行富集及子通路識別，高頻基因打分(HFG score)閾值設(shè)定0.25，高頻通路打分(HFP score)閾值設(shè)定0.5，以獲取更具魯棒性及可移植性的預(yù)后標(biāo)志物[10]。

加權(quán)共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵模塊分析在R3.5.1環(huán)境下，利用加權(quán)共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)(weighted gene co-expression network analysis，WGCNA)包構(gòu)建基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，并分析關(guān)鍵表達(dá)模塊[11]。取TMM標(biāo)準(zhǔn)化基因表達(dá)矩陣表達(dá)值的方差前25%的基因進(jìn)行共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析。為了使基因間的連通度符合冪律分布，以對數(shù)聯(lián)通性和對數(shù)頻率的線性擬合相關(guān)系數(shù)R2=0.9為閾值，結(jié)合pickSoftThreshold函數(shù)篩選最佳軟閾值為18。利用blockwiseModules函數(shù)對基因共表達(dá)模塊進(jìn)行劃分，并通過合并模塊的最小距離計算得到模塊特征值，設(shè)定切割高度閾值為0.25，模塊最小基因數(shù)為30。將模塊特征值與mRNAsi進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，采用Benjamini & Hochberg方法進(jìn)行多重檢驗(yàn)矯正，以得到mRNAsi高度相關(guān)基因模塊。

基因注釋及功能富集在R3.5.1環(huán)境下，利用clusterProfiler包、org.Hs.eg.db包和ggplot2包，對與mRNAsi高度相關(guān)的模塊進(jìn)行基因本體(生物進(jìn)程)及京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析。篩選標(biāo)準(zhǔn)為FDR<0.05。取顯著性富集的生物進(jìn)程及KEGG通路前10條進(jìn)行結(jié)果展示。

候選基因表達(dá)驗(yàn)證為驗(yàn)證候選基因是否在蛋白水平符合其表達(dá)趨勢，將目的基因于人類蛋白圖譜(https：//www.proteinatlas.org)數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行檢索，獲取相關(guān)免疫組織化學(xué)數(shù)據(jù)。

統(tǒng)計學(xué)處理采用R3.5.1統(tǒng)計軟件，組間均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Pearson檢驗(yàn)，兩組生存曲線差異采用Log-Rank檢驗(yàn)，多重檢驗(yàn)采用Benjamini & Hochberg方法矯正，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

UCEC干性特征及預(yù)后意義基于基因表達(dá)譜計算35例正常樣本及537例UCEC組織的mRNAsi，結(jié)果顯示，UCEC樣本mRNAsi顯著高于正常組織(t=25.095，P<0.001)(圖1A)；mRNAsi隨著UCEC的級別增高而不斷上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)(圖1B)；mRNAsi隨腫瘤分期逐漸上調(diào)，其中Ⅳ期與Ⅰ期相比，mRNAsi上調(diào)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-3.177，P=0.0032)(圖1C)；預(yù)后分析顯示，mRNAsi表達(dá)越高，UCEC患者總生存期越短(χ2=6.864，P=0.0088)(圖1D)。

mRNAsi：mRNA干性指數(shù)；UCEC：子宮內(nèi)膜癌mRNAsi：mRNA stemness index；UCEC：uterine corpus endometrial carcinomaA.腫瘤組織及正常組織的mRNAsi水平；B.不同級別UCEC的mRNAsi水平；C.不同腫瘤分期的mRNAsi水平；D.mRNAsi水平與UCEC患者總生存期A.the level of mRNAsi in tumor and normal tissue；B.the level of mRNAsi in UCEC of different grades；C.the level of mRNAsi in UCEC at different stages；D.the correlation between mRNAsi and overall survival of UCEC patients圖1 UCEC的mRNAsi特征刻畫及預(yù)后分析Fig 1 Profiling and prognosis analysis of mRNAsi in UCEC

UCEC干性相關(guān)差異基因篩選為進(jìn)一步探索引起腫瘤干性高低的關(guān)鍵差異基因，本研究分別考察了UCEC與正常組織及腫瘤mRNAsi指數(shù)高低組別之間的差異基因，并篩選兩者共有差異基因，結(jié)果顯示，以FDR小于0.05、變化倍數(shù)不少于2倍為篩選條件時，UCEC與正常組織之間存在7093個差異基因(上調(diào)3269個，下調(diào)3824個)，mRNAsi評分高低組別之間存在2335個差異基因(上調(diào)926個，下調(diào)1409個)，兩個數(shù)據(jù)集共有差異基因?yàn)?70個(圖2A、B)。熱圖結(jié)果顯示，上述共有差異基因可明顯區(qū)分腫瘤與正常組織，且在腫瘤樣本之間，大部分基因隨著mRNAsi及腫瘤級別升高而顯著上調(diào)或下調(diào)(圖2C)。

A.差異基因的火山圖；B.UCEC干性相關(guān)差異基因篩選；C.UCEC干性相關(guān)差異基因熱圖A.volcanic plot of differentially expressed genes；B.the screening of stemness-associated differentially expressed genes in UCEC；C.the heatmap of stemness-associated differentially expressed genes in UCEC圖2 UCEC干性相關(guān)差異基因分析Fig 2 Analysis of stemness-associated differentially expressed genes in UCEC

UCEC干性相關(guān)預(yù)后子通路識別及關(guān)鍵基因預(yù)后分析采用HiFreSP算法富集并識別與預(yù)后相關(guān)的子通路，結(jié)果顯示，整個差異基因集中存在2條子通路與UCEC患者預(yù)后顯著負(fù)相關(guān)，包括卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的子通路及細(xì)胞周期子通路(圖3A)。卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的子通路包含MAD2L1、PLK1、CAMK2A、CCNE1、CCNE2、PTTG1、ESPL1、CDC20等8個基因。細(xì)胞周期的子通路包含SMC1B、MAD2L1、PLK1、CCNB1、CCNB2、PTTG1、ESPL1、CDC20等8個基因。兩條子通路共包含11個差異基因，除CAMK2A為下調(diào)趨勢，其他基因均在腫瘤組織及mRNAsi評分高的樣本中顯著上調(diào)(圖3B)。進(jìn)一步結(jié)果顯示，上述11個差異基因均具有顯著的預(yù)后意義，其表達(dá)越高，UCEC患者預(yù)后越差(圖3C)。

A.UCEC干性相關(guān)差異基因的預(yù)后子通路篩選；B.具有顯著預(yù)后意義子通路的富集基因列表；C.富集基因表達(dá)與UCEC的總生存期A.screening of prognosis-related sub-pathways enriched with stemness-associated differentially expressed genes；B.the list of enriched genes in sub-pathways with prognostic significance；C.the correlations between enriched genes and overall survival of UCEC patients圖3 UCEC干性相關(guān)差異基因的預(yù)后子通路篩選及關(guān)鍵基因的預(yù)后意義Fig 3 The prognostic significance of stemness-associated differentially expressed genes and sub-pathways in UCEC

WGCNA篩選UCEC干性相關(guān)基因模塊為進(jìn)一步探索調(diào)控腫瘤干性特征的潛在機(jī)制，研究通過構(gòu)建WGCNA分析基因模塊與mRNAsi的相關(guān)性。選取β值18為閾值以構(gòu)建穩(wěn)定的無尺度網(wǎng)絡(luò)，并獲得14個基因模塊(圖4A、B)，模塊-性狀分析結(jié)果顯示，與mRNAsi密切相關(guān)的模塊共有3個，包括青色(R=0.34)、黑色(R=-0.37)及藍(lán)色(R=0.38)(圖4C、D)。此外，研究亦考察了上述11個干性相關(guān)關(guān)鍵基因與3個模塊的相關(guān)性，并展示相關(guān)性最高的基因。結(jié)果顯示，MAD2L1與青色模塊相關(guān)性為R=0.79，CAMK2A與黑色模塊相關(guān)性為R=0.68，PTTG1與藍(lán)色模塊相關(guān)性為R=0.79(圖4D)。

A.軟閾值篩選；B.層次聚類及靜態(tài)樹剪枝識別基因模塊；C.基因模塊與mRNAsi相關(guān)性分析；D.MAD2L1、CAMK2A、PTTG1及mRNAsi與基因模塊相關(guān)性A.screening of soft threshold；B.identification of gene modules by hierarchical clustering and static cut-off tree；C the correlations between gene modules and mRNAsi；D.the correlations of MAD2L1，CAMK2A，PTTG1，and mRNAsi with gene modules圖4 基于加權(quán)共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建篩選與UCEC干性相關(guān)的基因模塊Fig 4 Construction and screening of gene modules related to UCEC stemness based on weighted co-expression network

關(guān)鍵基因模塊的功能注釋及通路富集為明確上述3個關(guān)鍵基因模塊的功能，研究通過基因本體(生物進(jìn)程)及KEGG對模塊基因進(jìn)行功能注釋及通路富集。結(jié)果顯示，青色模塊主要參與的生物進(jìn)程包括mRNA加工、RNA剪接、染色體分離、共價染色質(zhì)修飾、組蛋白修飾等(圖5A)。黑色模塊與內(nèi)皮發(fā)育、肌肉收縮、肌肉系統(tǒng)過程、血管生成的調(diào)節(jié)、調(diào)節(jié)脈管系統(tǒng)發(fā)育、腎小球血管發(fā)育、腎系統(tǒng)血管發(fā)育、腎血管發(fā)育、內(nèi)皮細(xì)胞分化及出芽式血管生成等生物進(jìn)程相關(guān)(圖5B)。藍(lán)色模塊主要參與信號識別顆粒依賴的共翻譯、蛋白質(zhì)膜靶向、蛋白靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、非編碼RNA加工、核糖體生物合成、rRNA加工、核糖核蛋白復(fù)合物的生物合成、rRNA代謝過程等生物進(jìn)程(圖5C)。

KEGG通路富集結(jié)果顯示，青色模塊與RNA轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞周期、剪接體、泛素介導(dǎo)的蛋白水解、mRNA 監(jiān)測通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工等通路相關(guān)(圖5D)。黑色模塊與血管平滑肌收縮、環(huán)磷酸鳥苷-蛋白激酶G信號通路、黏著斑及細(xì)胞黏附分子等通路顯著相關(guān)(圖5E)。藍(lán)色模塊主要富集通路包括核糖體、氧化磷酸化、產(chǎn)熱、蛋白酶體、逆行內(nèi)源性大麻素信號、剪接體、RNA聚合酶、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工及心肌收縮(圖5F)。

KEGG：京都基因與基因組百科全書KEGG：Kyoto encyclopedia of genes and genomesA～C.青色、黑色、藍(lán)色基因模塊的基因本體(生物進(jìn)程)注釋；D～F.青色、黑色、藍(lán)色基因模塊的KEGG通路富集A-C.gene ontology(biological process)annotation of turquoise，black，and blue gene modules；D-F.KEGG pathway enrichment of turquoise，black，and blue gene modules圖5 關(guān)鍵基因模塊的基因本體(生物進(jìn)程)和KEGG通路富集分析Fig 5 Gene ontology(biological process)and the KEGG pathway enrichment of key gene modules

UCEC干性相關(guān)基因的表達(dá)驗(yàn)證本研究發(fā)現(xiàn)MAD2L1、CAMK2A、PTTG1在腫瘤與正常組織、mRNAsi評分高低、UCEC患者預(yù)后中均具有顯著意義，且與干性模塊高度相關(guān)，因此進(jìn)一步利用人類蛋白圖譜數(shù)據(jù)庫驗(yàn)證其蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示，MAD2L1與PTTG1在腫瘤組織中明顯上調(diào)，而CAMK2A則在腫瘤組織中下調(diào)，該結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果一致(圖6)。

人類蛋白圖譜數(shù)據(jù)庫檢索MAD2L1、CAMK2A、PTTG1在UCEC及正常組織的表達(dá)The expression of MAD2L1，CAMK2A，and PTTG1 in UCEC and normal tissues retrieved from The Human Protein Atlas圖6 UCEC干性相關(guān)基因的免疫組織化學(xué)表達(dá)驗(yàn)證Fig 6 Expression validation of UCEC stemness-associated genes by immunohistochemistry staining

討 論

CSCs是參與腫瘤惡性進(jìn)展及耐藥的關(guān)鍵細(xì)胞亞群[12]，腫瘤分化程度越低，其干細(xì)胞樣特性則越顯著，腫瘤侵襲性越強(qiáng)[13]。然而，目前UCEC干性特征的調(diào)控機(jī)制尚未明確。本研究通過TCGA數(shù)據(jù)庫聯(lián)合機(jī)器學(xué)習(xí)刻畫了UCEC干性特征，并挖掘調(diào)控腫瘤干性特征的潛在機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，mRNAsi在腫瘤組織中顯著升高，并與腫瘤分級、腫瘤分期呈正相關(guān)，是UCEC患者的不利預(yù)后因素。本研究還進(jìn)一步挖掘了導(dǎo)致mRNAsi產(chǎn)生差異的關(guān)鍵基因集，并通過HiFreSP算法識別發(fā)現(xiàn)兩條關(guān)鍵子通路高表達(dá)可導(dǎo)致UCEC患者總生存期顯著變短。其中，包括MAD2L1、CAMK2A及PTTG1在內(nèi)的11個基因?yàn)樯鲜鲎油烦蓡T并與患者預(yù)后顯著相關(guān)。WGCNA分析顯示，mRNAsi與3個關(guān)鍵模塊密切相關(guān)，同時，MAD2L1，CAMK2A及PTTG1分別與3個基因模塊高度相關(guān)，并在組織樣本中蛋白表達(dá)趨勢與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果一致。提示這些基因的表達(dá)失調(diào)是促進(jìn)UCEC腫瘤干性特征的潛在關(guān)鍵機(jī)制。

目前，雖然在UCEC中已鑒定出CSCs，但多數(shù)研究在評價腫瘤干性時主要考察一些特定CSCs標(biāo)志物，如CD133、ALDH1等[14]，而對UCEC的干性特征缺乏全面了解。干性指數(shù)是一種新穎的評價模型，通過一類邏輯回歸機(jī)器學(xué)習(xí)算法提取人類干細(xì)胞及分化各階段的祖細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和表觀遺傳特征，可用于評估不同腫瘤亞型、臨床特征下腫瘤干性差異以及預(yù)后意義[9]。其中，mRNAsi是基于基因表達(dá)數(shù)據(jù)計算所得的干性指數(shù)，指數(shù)越接近1，表明腫瘤細(xì)胞分化程度越低，干性特征越強(qiáng)。本研究通過計算UCEC樣本的mRNAsi發(fā)現(xiàn)，UCEC腫瘤組織不僅比正常組織干性程度高，而且mRNAsi隨著腫瘤的分級及腫瘤分期逐步上調(diào)，在高級別腫瘤及晚期患者中指數(shù)最高。更為重要的是，mRNAsi指數(shù)越高，則UCEC患者預(yù)后越差，表明mRNAsi是一個潛在的UCEC預(yù)后標(biāo)志物。由于CSCs在腫瘤惡性演進(jìn)及臨床治療的重要地位，評估腫瘤干性指數(shù)可潛在輔助疾病進(jìn)程判斷及臨床療效評估。

為探索導(dǎo)致UCEC干性特征差異的潛在機(jī)制，本研究篩選并發(fā)現(xiàn)腫瘤mRNAsi指數(shù)高低組別之間存在570個特異變化差異基因，這些基因與腫瘤干性特征密切相關(guān)。腫瘤干性特征的本質(zhì)是多基因異常表達(dá)導(dǎo)致通路失調(diào)，通過維持CSCs自我更新或促使腫瘤細(xì)胞失分化而獲得干細(xì)胞樣特性。為研究差異基因所參與的信號通路，傳統(tǒng)手段一般采用KEGG、基因集富集分析等手段進(jìn)行通路分析。然而，信號通路往往由龐大的基因集構(gòu)成，各基因的重要程度卻無法區(qū)分[10]。因此，從通路中進(jìn)一步挖掘關(guān)鍵子通路，識別其預(yù)測性，不僅可以獲取具有較高預(yù)后判斷能力的標(biāo)志物，還可以更好闡釋腫瘤惡性演進(jìn)的機(jī)制。HiFreSP是基于隨機(jī)策略與子通路挖掘相結(jié)合的一種新穎算法，與拉索回歸及隨機(jī)森林預(yù)后模型相比，HiFreSP具有更好的預(yù)后評估性能及魯棒性[10]。為探索UCEC干性相關(guān)差異基因的生物學(xué)意義，研究采用HiFreSP算法富集并識別了卵母細(xì)胞減數(shù)分裂子通路及細(xì)胞周期子通路為UCEC患者預(yù)后的潛在標(biāo)志物，進(jìn)一步分析結(jié)果表明，上述子通路中多數(shù)成員為細(xì)胞周期相關(guān)基因，且均與UCEC患者總生存期呈負(fù)相關(guān)。Horning等[15]通過對前列腺癌組織進(jìn)行單細(xì)胞測序發(fā)現(xiàn)，PTTG1、CDC20、PLK1、CCNB1等10個細(xì)胞周期相關(guān)基因在具有干細(xì)胞樣特征的亞群中表達(dá)上調(diào)，且這些細(xì)胞對G2/M周期阻滯劑不敏感，提示細(xì)胞周期在維持腫瘤干性中具有重要作用。雖然已有一些研究發(fā)現(xiàn)卵母細(xì)胞減數(shù)分裂或細(xì)胞周期通路在子宮內(nèi)膜癌中被富集[16]，但本研究進(jìn)一步明確了上述通路與腫瘤干性特征密切相關(guān)，可作為潛在的預(yù)后標(biāo)志物。

WGCNA分析顯示，3個共表達(dá)模塊與mRNAsi密切相關(guān)，其中與mRNAsi正相關(guān)的模塊主要與RNA轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞周期、剪接體、氧化磷酸化、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工等通路相關(guān)，而與mRNAsi負(fù)相關(guān)的模塊主要富集于環(huán)磷酸鳥苷-蛋白激酶G信號通路、黏著斑及細(xì)胞黏附分子等通路，提示腫瘤干性特征調(diào)控機(jī)制的復(fù)雜性。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，MAD2L1，CAMK2A及PTTG1不僅是上述子通路的成員，而且分別與3個基因模塊高度相關(guān)。MAD2L1是有絲分裂紡錘體組裝檢查點(diǎn)蛋白，與細(xì)胞周期密切相關(guān)。Bidus等[17]研究發(fā)現(xiàn)，MAD2L1在發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的子宮內(nèi)膜癌組織中高表達(dá)，可作為預(yù)測淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的指標(biāo)之一。此外，MAD2L1與BUB1可聯(lián)合作為UCEC的預(yù)后標(biāo)志物，其表達(dá)與腫瘤分化程度、腫瘤分期相關(guān)[18]。這些研究提示MAD2L1在促進(jìn)UCEC惡性進(jìn)展中具有重要作用，但MAD2L1參與調(diào)控UCEC干性特征的研究鮮有報道。CAMK2A參與編碼CaMKII的α亞基，目前CAMK2A在UCEC中的作用研究較少，Takai等[19]研究指出，CAMKI和CAMKII抑制劑KN- 93可顯著誘導(dǎo)UCEC細(xì)胞發(fā)生G0/G1期阻滯，并誘導(dǎo)凋亡。然而本研究發(fā)現(xiàn)，CAMK2A在腫瘤組織及mRNAsi指數(shù)高的組別中表達(dá)顯著下調(diào)，且免疫組織化學(xué)進(jìn)一步驗(yàn)證了該結(jié)果，提示CAMK2A可能與腫瘤干性特征負(fù)相關(guān)。CAMKII作為激酶，除了自身表達(dá)水平，其酶活性、胞內(nèi)定位及作用底物都將影響其生物學(xué)效應(yīng)，因此，需要更充分的證據(jù)明確CAMK2A在UCEC干性特征維持中的作用。人垂體腫瘤轉(zhuǎn)化基因1(由PTTG1編碼)作為癌基因，在多種腫瘤中發(fā)揮促癌作用且與維持CSCs干性相關(guān)[20- 23]。在乳腺癌中，PTTG1可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化以及維持CSCs自我更新能力及數(shù)量[24]。Feng等[25]研究顯示，PTTG1表達(dá)與UCEC的TMN分期呈正相關(guān)，但與其他臨床特征關(guān)系不顯著。本研究通過多重篩選發(fā)現(xiàn)，PTTG1作為卵母細(xì)胞減數(shù)分裂子通路及細(xì)胞周期子通路共有的基因，其表達(dá)與UCEC患者預(yù)后負(fù)相關(guān)，且與干性相關(guān)基因模塊具有較高的相關(guān)性，提示PTTG1在維持UCEC干性特征中具有重要作用。

綜上，本研究基于機(jī)器學(xué)習(xí)算法，刻畫了UCEC的干性特征，識別了干性相關(guān)的基因及預(yù)后標(biāo)志物，分析了維持UCEC干性特征的潛在機(jī)制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MAD2L1、CAMK2A及PTTG1等一系列與腫瘤細(xì)胞干性密切相關(guān)的基因。后續(xù)將聚焦UCEC的干性特征，在分子、細(xì)胞、動物水平充分論證上述基因在調(diào)控腫瘤干性中的作用及機(jī)制。鑒于CSCs在腫瘤治療中的地位逐漸被重視，研究所獲結(jié)果有望為UCEC的精準(zhǔn)治療提供潛在標(biāo)志物及候選靶點(diǎn)。