泡菜中乳酸菌的分離鑒定及抗性篩選

曾維友，周於強(qiáng)，池 浩

（1.重慶市江津區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，重慶 402260；2.重慶市江津區(qū)鄉(xiāng)村發(fā)展服務(wù)中心，重慶 402260）

乳酸菌廣泛存在于人們生活中，在發(fā)酵食品中大量存在[1]。乳酸菌不僅對(duì)食品感官特性具有重要作用，還具有調(diào)節(jié)腸道菌群、增強(qiáng)免疫力、促進(jìn)營養(yǎng)吸收等益生功能[2-4]。大量研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵食品中存在的乳酸菌可以促進(jìn)生物體對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收[5-6]、降低體內(nèi)膽固醇[7]，以及通過增加非特異性（細(xì)胞功能、自然殺傷細(xì)胞活性）和特異性（細(xì)胞因子產(chǎn)生、抗體產(chǎn)生、淋巴細(xì)胞增殖、遲發(fā)型超敏反應(yīng)）宿主免疫應(yīng)答提高機(jī)體免疫力等[8-9]。日本Yakult公司研發(fā)的干酪乳桿菌Shirota（代田株）也是世界知名的益生菌之一，應(yīng)用該菌株的養(yǎng)樂多乳酸菌飲料每年銷售100億瓶以上[10]。丹麥科漢森公司開發(fā)的動(dòng)物雙歧桿菌（Bifidobacterium animalis）BB-12，該菌株暢銷10多個(gè)國家，被廣泛用于嬰幼兒乳品[11]。因此，乳酸菌作為益生菌資源在全球都引起廣泛關(guān)注，并具有重要的商業(yè)價(jià)值。

我國是發(fā)酵食品大國，乳酸菌資源豐富[3]。泡菜是以乳酸菌為優(yōu)勢菌群生產(chǎn)的一種發(fā)酵食品，因其獨(dú)特的風(fēng)味以及開胃健脾、降低膽固醇等作用，深受廣大顧客的青睞[12-13]。目前，我國有數(shù)百家泡菜生產(chǎn)企業(yè)，200多個(gè)泡菜系列，800多個(gè)泡菜品種，年產(chǎn)值突破200億元[14]。泡菜中乳酸菌多樣性豐富，包括植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentium）、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）、布氏乳桿菌（Lactobacillus buchneri）等，對(duì)其乳酸菌進(jìn)行研究具有重要的價(jià)值[14]。但是我國對(duì)乳酸菌資源的開發(fā)起步較晚，核心菌種對(duì)國外的依賴度＞90%。近年來，自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)種質(zhì)資源建設(shè)越來越得到相關(guān)研究人員的關(guān)注。中國光明乳業(yè)股份有限公司的植物乳桿菌ST-Ⅲ就是由江南大學(xué)陳衛(wèi)院士團(tuán)隊(duì)從江南農(nóng)家泡菜中分離，具有耐酸、耐膽鹽、降膽固醇和血脂等作用，被應(yīng)用于光明暢優(yōu)等系列發(fā)酵乳和發(fā)酵乳飲料[15]。

為充分開發(fā)傳統(tǒng)泡菜中乳酸菌種質(zhì)資源，建立特色菌種資源庫，本研究從重慶市泡菜水中分離乳酸菌，采用形態(tài)觀察及分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)分離菌株進(jìn)行16S rDNA鑒定，并研究分離菌株的體外人工胃液、膽鹽耐受性，從而篩選出傳統(tǒng)泡菜中優(yōu)良的乳酸菌，為保健型泡菜及益生菌產(chǎn)品的開發(fā)和應(yīng)用提供潛在益生菌菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

市售泡菜水樣品：購自重慶市各地市場自然發(fā)酵樣本，共11份。MRS肉湯培養(yǎng)基、MRS瓊脂培養(yǎng)基、瓊脂、瓊脂糖、胃蛋白酶（酶活≥250 U/mg）、牛膽鹽（均為生化試劑）：北京索萊寶科技有限公司；鹽酸、巰基乙酸鈉（均為分析純）：成都市科龍化工試劑廠；核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）酶（酶活≥60 U/mg）、2×Taq聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）Master Mix、Ⅱ型核酸染色劑、6×脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）loadingbuffer、100bpDNA ladder（均為分析純）、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒：天根生化科技（北京）有限公司；正向引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3'）、反向引物1495R（5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3'）：生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

14A04123型立式雙人雙面無菌操作臺(tái)：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；GHP-9080型隔水式恒溫培養(yǎng)箱：常州中捷實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；YXQ-LS-75SⅡ-01-00型立式壓力蒸汽滅菌器：上海博迅生物儀器股份有限公司；minispin高速離心機(jī)：德國艾本德公司；DYS-108型生物顯微鏡：上海點(diǎn)應(yīng)光學(xué)儀器有限公司；S1000型梯度PCR儀：美國Bio-Rad公司；JY-SPFT小型水平電泳槽：北京君意電泳設(shè)備有限公司；Gene Genius凝膠成像系統(tǒng)：英國SynGene公司；PHS-3E pH計(jì)：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；SYNERGYH1酶標(biāo)儀：基因有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的分離純化

取1 mL泡菜水于裝有9 mL無菌生理鹽水（濃度為0.9%）的試管中，充分混勻后再吸取1 mL于裝有9 mL生理鹽水的試管中，依次梯度稀釋至10-5。分別吸取樣液100 μL涂布于MRS瓊脂培養(yǎng)基中，于37 ℃條件下恒溫培養(yǎng)48 h，每個(gè)梯度做兩個(gè)平行。從平板上選取形態(tài)、大小、顏色不同的菌落，反復(fù)劃線分離純化后置于37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)48 h，重復(fù)上述操作直到出現(xiàn)純菌落為止。最后將獲得的菌株進(jìn)行編號(hào)、保存。

1.3.2 菌株的鑒定

形態(tài)觀察：觀察分離菌株的菌落形態(tài)，并按照革蘭氏染色法進(jìn)行染色，然后調(diào)節(jié)雙目顯微鏡于100倍的油鏡下觀察其形態(tài)[12]。

分子生物學(xué)鑒定：按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒中的使用說明書提取總DNA[16]，以其為模板，27F和1495R為引物對(duì)菌株的16S rDNA基因序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系[12]：10 μmol/L引物27F和1495R各1 μL、2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL、DNA模版1 μL、雙蒸水（ddH2O）9.5 μL。PCR擴(kuò)增參數(shù)：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃下再延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送華大科技有限公司進(jìn)行測序。將測序結(jié)果提交至美國國家生物技術(shù)信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)中，采用局部序列比對(duì)基本檢索工具（basic local alignment search tool，BLAST）程序進(jìn)行同源性比對(duì)分析[13]。從GeneBank數(shù)據(jù)庫中選取與所得乳酸菌16S rDNA基因序列同源性大于98%的乳酸菌以及Genome中的標(biāo)準(zhǔn)菌株作為參考的序列，然后使用MEGA5.05軟件中的鄰近（neighbor-joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[17]。

1.3.3 乳酸菌人工胃液耐受性實(shí)驗(yàn)

總之，“情感同構(gòu)”是新時(shí)期增強(qiáng)“概論”課教學(xué)實(shí)效性不可忽視的重要路徑之一。通過師生之間、生生之間、教學(xué)對(duì)象與教學(xué)內(nèi)容之間的情感同構(gòu)，打破傳統(tǒng)的教育理念和教學(xué)模式，讓理論走進(jìn)學(xué)生的大腦，走進(jìn)學(xué)生的生活，走進(jìn)學(xué)生的實(shí)踐，讓學(xué)生在實(shí)踐中認(rèn)識(shí)社會(huì)并深化對(duì)理論的認(rèn)識(shí)，是增進(jìn)“概論”課教學(xué)實(shí)效性的重要途徑。

將配制好的0.2%的NaCl溶液和0.35%的胃蛋白酶（1∶10 000）用玻璃棒充分混勻后，用1 mol/L的HCl調(diào)整溶液的pH值為3.0，于無菌操作臺(tái)里采用0.22 μm濾頭過濾后備用[18]。取5 mL已活化好的菌株培養(yǎng)液加到已滅菌的10 mL離心管中，4 ℃條件下4 000 r/min離心10 min，收集菌體，向離心管中加入5 mL 0.9%的無菌生理鹽水混勻制成菌懸液，然后取1 mL菌懸液與9 mL pH 3.0的人工胃液混合搖勻，于37 ℃、100 r/min的條件下培養(yǎng)3 h，并分別在0 h和3 h取10 μL樣液，用MRS瓊脂培養(yǎng)基傾注后于37 ℃條件下培養(yǎng)48 h。最后用平板計(jì)數(shù)法計(jì)算活菌數(shù)，并計(jì)算存活率，其計(jì)算公式如下[16]：

式中：R為胃液中的存活率，%；m1為3 h的活菌數(shù)，CFU/mL；m2為0 h的活菌數(shù)，CFU/mL。

1.3.4 乳酸菌膽鹽耐受性實(shí)驗(yàn)

選取人工胃液耐受實(shí)驗(yàn)中存活率＞60%的菌株進(jìn)行膽鹽耐受性實(shí)驗(yàn)。取100 μL活化好的菌液分別接種于含0、0.05%、0.10%、0.20%、0.30%牛膽鹽的0.2%的巰基乙酸鈉-MRS培養(yǎng)基中，于37 ℃、100 r/min條件下連續(xù)培養(yǎng)24 h，以未接種菌液的0.2%的巰基乙酸鈉-MRS培養(yǎng)基為對(duì)照。分別吸取200 μL于事先做好標(biāo)記的對(duì)應(yīng)酶標(biāo)板孔中，通過酶標(biāo)儀測定OD600nm值，然后計(jì)算菌株的生長效率，其計(jì)算公式如下[19]：

式中：R為生長效率，%；m1為含膽鹽培養(yǎng)基的OD600nm值；m2為空白培養(yǎng)基的OD600nm值。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，用Excel 2010處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”來表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的形態(tài)學(xué)觀察

從11份泡菜水樣本中共分離純化得到71株菌，經(jīng)革蘭氏染色反應(yīng)以及雙目顯微鏡仔細(xì)觀察后，均為陽性反應(yīng)且形態(tài)較均一，因此，初步判斷為革蘭氏陽性細(xì)菌。其中代表菌株S39的菌落及細(xì)胞形態(tài)見圖1。由圖1可知，菌株S39的菌落呈圓形，表面低凸或凸起狀，較為整潔光滑，呈乳白色或微黃白色；細(xì)胞形態(tài)呈桿狀、長度較短，排列方式為單個(gè)、線狀或簇狀。

圖1 菌株S39的菌落（a）及細(xì)胞（b）形態(tài)Fig.1 Colonial (a) and cell (b) morphology of strain S39

2.2 菌株的分子生物學(xué)鑒定

基于16S rDNA基因序列71株菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖2。

由圖2可知，菌株S1～S4、S6、S9等32株菌株均與消化乳桿菌（Lactobacillus alimentarius）聚在同一個(gè)分支上，同源性達(dá)99%，親緣關(guān)系最近，因此鑒定這些菌株為消化乳桿菌（Lactobacillus alimentarius）。菌株S11、S13、S25等27株菌株均與植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）處于同一分支上，親緣關(guān)系最近，因此鑒定這些菌株為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。菌株S44、S29與棒狀乳桿菌（Lactobacillus coryniformis）聚于同一分支，親緣關(guān)系最近，因此，鑒定這兩株菌為棒狀乳桿菌（Lactobacillus coryniformis）。菌株S19、S22～S24、S27等9株菌株與有害片球菌（Pediococcus damnosus）處于同一分支上，同源性為99%，親緣關(guān)系最近，因此，鑒定這些菌株為有害片球菌（Pediococcus damnosus）。菌株S71與發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentium）處于同一小分支，親緣關(guān)系最近，因此，鑒定該菌株為發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentium）。綜上，71株菌株中32株被鑒定為消化乳桿菌、27株被鑒定為植物乳桿菌、9株被鑒定為有害片球菌、2株被鑒定為棒狀乳桿菌、1株被鑒定為發(fā)酵乳桿菌。在國家食品藥品監(jiān)督部門發(fā)布的《可用于食品的菌種名單》中，以上菌種只有植物乳桿菌與發(fā)酵乳桿菌在其中，因此，選用植物乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌用于后續(xù)的篩選實(shí)驗(yàn)。

2.3 優(yōu)良乳酸菌的篩選

2.3.1 乳酸菌人工胃液耐受實(shí)驗(yàn)結(jié)果

發(fā)酵蔬菜中的乳酸菌對(duì)人體有益，而乳酸菌發(fā)揮有益作用的前提是可以在人體胃腸道中生存并大量繁殖，而胃腸道微生物數(shù)量及種類眾多，機(jī)體為了少受有害微生物的侵害，胃酸和膽鹽便成為了一道天然的防御屏障，其中影響最大的即是胃液中的強(qiáng)酸環(huán)境，絕大多數(shù)菌群通過消化道都會(huì)失去活性，只有那些耐受性較高的乳酸菌能夠抵抗這樣的內(nèi)環(huán)境生存下來[20]。由于人體中胃液的pH值通常在3.0左右[21]，且食物在胃內(nèi)停留的時(shí)間大致為1～2 h，因此模擬人體胃液實(shí)驗(yàn)以pH值3.0和作用時(shí)間3 h為篩選依據(jù)[15]。乳酸菌對(duì)人工胃液的耐受性見表1。

表1 乳酸菌對(duì)人工胃液耐受性的測定結(jié)果Table 1 Determination results of tolerance of lactic acid bacteria to artificial gastric juice

由表1可知，28株不同的乳酸菌中有7株不能在模擬胃液的環(huán)境下生長，其中菌株S13與人工胃液作用0 h的后不能生長，說明該株菌對(duì)人工胃液的耐受能力特別弱，基本不能在胃內(nèi)環(huán)境中生長。其余21株均可生長，但耐受能力不同，存活率在0.03%～108.73%之間，說明乳酸菌抗人工胃液的能力因菌株的不同而有顯著的差異。幾乎所有乳酸菌在人工胃液環(huán)境中暴露3h后活菌數(shù)都有所下降，存活率＞60%的僅占所有菌株的7.14%，其中菌株S74在人工胃液環(huán)境下暴露3 h后的存活率為94.73%，菌株S78的存活率高達(dá)108.73%，說明這兩株乳酸菌與其他菌株相比，對(duì)人工胃液耐受性較高，更適合在人工胃液中生長。

2.3.2 乳酸菌膽鹽耐受實(shí)驗(yàn)結(jié)果

膽鹽是膽汁酸與甘氨酸或?；撬嵬ㄟ^酰胺化作用形成的N-?；０坊衔?。當(dāng)膽鹽達(dá)到一定濃度后便具有抗菌能力，其主要來自于肝臟，可以通過疏水作用將細(xì)菌的細(xì)胞膜脂膜溶解，從而使細(xì)胞膜破裂并造成膜蛋白解離[16]。除此之外，在人體小腸內(nèi)，膽鹽形成的高滲透壓條件也能夠?qū)w細(xì)胞構(gòu)成威脅。因此微生物在腸道內(nèi)發(fā)揮代謝活性的首要條件應(yīng)該為具備一定的膽鹽耐受性[22]。膽鹽在十二指腸中的含量一般為0.03%～0.3%[21]，因此本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)膽鹽含量為0～0.3%。通過測定存活率或生長遲滯期來評(píng)價(jià)菌株的抗膽鹽能力比測定生長效率的實(shí)驗(yàn)更繁瑣耗，所以本實(shí)驗(yàn)采用了乳酸菌在膽鹽環(huán)境中的生長效率來評(píng)價(jià)菌株的抗膽鹽能力。乳酸菌對(duì)不同濃度膽鹽的耐受性見表2。

表2 乳酸菌對(duì)膽鹽耐受性的測定結(jié)果Table 2 Determination results of tolerance of lactic acid bacteria to bile salt

由表2可知，植物乳桿菌S74與S78均能在含量為0～0.3%的膽鹽生長，膽鹽含量逐漸增加后菌株S74的生長效率隨之下降，原因類似前文所述，高濃度膽鹽容易改變細(xì)胞膜通透性并離解膜內(nèi)蛋白質(zhì)，從而使得細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)流出，導(dǎo)致細(xì)胞死亡[23]；而菌株S78的生長效率卻隨著膽鹽含量的增加而上升，且當(dāng)膽鹽含量為0.30%時(shí)生長效率可達(dá)到10.04%。馮金曉等[24]學(xué)者通過模擬胃腸道實(shí)驗(yàn)分析了從傳統(tǒng)泡菜中分離的8株菌，發(fā)現(xiàn)其中存活率最高的菌株僅為2.0%左右；瑪麗娜·庫爾曼等[25]將分離自傳統(tǒng)酵素中菌株進(jìn)行體外抗膽鹽實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示當(dāng)膽鹽含量為0.1%時(shí)，菌株已經(jīng)被脅迫得不能繼續(xù)生長。與以上學(xué)者的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相比，菌株S78有較高的抗膽鹽能力。

3 結(jié)論

本研究從重慶市市售泡菜水中共分離純化得到71株乳酸菌，經(jīng)形態(tài)觀察及分子生物學(xué)鑒定，32株為消化乳桿菌、27株為植物乳桿菌、9株為有害片球菌、2株為棒狀乳桿菌、1株為發(fā)酵乳桿菌。其中27株植物乳桿菌和1株發(fā)酵乳桿菌為食品可用菌株，對(duì)其進(jìn)行人工胃液和膽鹽耐受實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明植物乳桿菌S74與S78在pH3.0的人工胃液處理后存活率高達(dá)（94.73±4.56）%與（108.73±7.16）%，且菌株S78在膽鹽中也能良好生長，生長效率為（10.04±4.90）%，優(yōu)于菌株S74，因此植物乳桿菌S78在功能性泡菜及益生菌制劑方面具有一定的開發(fā)潛力。