自然發(fā)酵豆醬中嗜鹽四聯球菌的分離篩選及生長特性研究

姜錦惠，趙 悅，李盈爍，魏麗麗，趙 越，楊雪萌，潘國楊，烏日娜

（沈陽農業(yè)大學 食品學院 遼寧省食品發(fā)酵技術工程研究中心 沈陽市微生物發(fā)酵技術創(chuàng)新重點實驗室，遼寧 沈陽 110866）

東北豆醬作為我國傳統調味食品，因其獨特的滋味與氣味而受到大眾普遍歡迎[1]。在酶的作用下，大豆中的鐵、磷、鈣等礦物質能更容易的被釋放，從而使大豆中的營養(yǎng)成分更易于人體消化吸收[2-3]。在豆醬自然發(fā)酵過程中，乳酸菌可以利用大豆中的蛋白質、碳水化合物、脂肪等，分解成小分子醛、酸、酯等風味物質，使得豆醬的養(yǎng)分發(fā)生變化，進而影響豆醬的風味[4-5]。

嗜鹽四聯球菌（Tetragenococcus halophilus）是一類廣泛存在于豆醬、醬油、泡菜等含鹽發(fā)酵食品中的乳酸菌。已有研究表明，把從中國傳統發(fā)酵食品豆瓣醬中篩選出的一株嗜鹽四聯球菌菌株作為發(fā)酵劑添加至豆瓣醬的發(fā)酵過程中，豆瓣醬中的揮發(fā)性物質如氨基酸態(tài)氮、酸類、酯類等含量均有提高，其有助于豆瓣醬整體滋味與品質的提升，對發(fā)酵產品有明顯的增益作用[6]。此外，將嗜鹽四聯球菌用于強化豆瓣醬的風味，豆瓣醬中的揮發(fā)性成分如氨基酸態(tài)氮、酸類、醇類等均有所提高，而亞硝酸鹽含量減少39.4%

[7]。有大量研究表明，乳酸菌作為重要的微生物在傳統食品發(fā)酵過程中對風味物質的形成有著至關重要的作用，雖然國內外對傳統發(fā)酵食品的生產工藝、感官品質、理化指標等做了大量的研究，但對其中嗜鹽乳酸菌分離篩選的研究相對較少。

該試驗從傳統自然發(fā)酵豆醬中分離嗜鹽四聯球菌菌株[8-10]，采用分子生物學技術對其進行鑒定[11-13]，并對菌株益生特性進行研究，篩選益生性優(yōu)良的嗜鹽四聯球菌菌株。進一步探討優(yōu)良菌株的最佳生長條件，并以活菌數為響應值，采用單因素及響應面優(yōu)化試驗對其增殖培養(yǎng)基組分進行優(yōu)化，為嗜鹽四聯球菌進一步地開發(fā)與應用提供重要的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料與菌株

高鹽自然發(fā)酵豆醬樣品：采集自遼寧省，共計14份。

大腸桿菌（Escherichia coli）、單核細胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）：中國普通微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2 試劑

脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒：美國OMEGA公司；AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒：美國AXYGEN公司；FastpfuDNAPolymerase：北京TransGen公司；瓊脂糖（生化試劑）：西班牙沃比森公司；聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）引物、擴增體系：北京鼎國昌盛有限公司。其他試劑均為國產分析純或生化試劑。

1.1.3 培養(yǎng)基

分離培養(yǎng)基[14]：蛋白胨10 g，牛肉膏8 g，酵母提取物4 g，葡萄糖20 g，乙酸鈉·3H2O 5 g，吐溫80 1 g，K2HPO42 g，檸檬酸鈉2 g，MgSO4·7H2O 0.58 g，MnSO4·4H2O 0.25 g，氯化鈉150 g，那他霉素2 g，碳酸鈣10 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL。121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

MRS液體培養(yǎng)基[15]：蛋白胨10 g，無水乙酸鈉3 g；K2HPO42 g；MgSO4·7H2O 0.575 g；MnSO4·H2O 0.25 g，葡萄糖20 g，檸檬酸三鈉2.42 g，酵母粉4 g，牛肉浸膏8 g，吐溫80 1 g，瓊脂（半固體）1.75 g，蒸餾水1 000 mL。121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。MRS固體培養(yǎng)基：MRS液體培養(yǎng)基中添加瓊脂20 g。

LB液體培養(yǎng)基[16]：酵母粉5 g，蛋白胨10 g，NaCl 10 g，蒸餾水1 000 mL。121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。

種子培養(yǎng)基[17]：MRS液體培養(yǎng)基中添加氯化鈉100.0g/L，pH 7.0。121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

SHP-250型生化培養(yǎng)箱：上海精宏實驗設備有限公司；ZHJH-C1112C超凈工作臺：蘇州安泰空氣技術有限公司；ABI-2720 PCR儀：美國AppliedBiosytems公司；DYY-12電泳儀：北京六一生物儀器有限公司；UVPGDS-8000凝膠成像儀：上海精密科學有限公司；Centrifuge 5804R高速臺式冷凍離心機：德國Eppendorf公司；NanoDrop 2000c超微量分光光度計：美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 自然發(fā)酵豆醬中耐鹽乳酸菌的初步分離及純化

將自然發(fā)酵豆醬樣品通過10倍稀釋法用生理鹽水進行梯度稀釋，然后選取2～3個合適梯度的稀釋液涂布于分離培養(yǎng)基中，于30 ℃條件下兼性厭氧培養(yǎng)6 d。挑取單菌落接種到MRS固體培養(yǎng)基純化2～3次。將分離得到的菌株接種于MRS固體培養(yǎng)基，30 ℃條件下培養(yǎng)60 h，挑取單菌落進行革蘭氏染色，采用顯微鏡觀察細胞形態(tài)，記錄菌落特征，從而獲得嗜鹽四聯球菌疑似菌株。

1.3.2 生理生化試驗

參照《常見細菌系統鑒定手冊》[18]對菌株進行生理生化試驗。

1.3.3 分子生物學鑒定

采用試劑盒法提取分離菌株的基因組DNA，采用微量紫外分光光度計對基因組DNA進行濃度和純度的測定，以其為模板，利用16S rRNA基因通用引物[19-20]27f（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）、1492r（5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3'）PCR擴增16S rDNA基因序列。PCR擴增體系：基因組DNA模板1 μL（50 ng/μL），引物27f、1492r各0.5 μL（25 pmol/μL），10×PCR buffer 2.5 μL，脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）MIX 2 μL，ExTaq酶0.2 μL，雙蒸水（ddH2O）18.3 μL；PCR擴增條件：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，27個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR擴增產物經0.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后委托上海桑尼生物技術有限公司進行測序[21-23]。將測序結果提交至美國國立生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數據庫中，采用基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）進行同源性對比搜索，選取同源性較高的模式菌株的16S rDNA基因序列，采用MEGA軟件中的鄰接（neighbor-joining，NJ）法構建系統發(fā)育樹[24-25]。

1.3.4 嗜鹽四聯球菌耐受性試驗

將分離并鑒定到的嗜鹽四聯球菌菌株分別接種于種子培養(yǎng)基，30 ℃靜置培養(yǎng)24 h，作為種子液，備用。

按2%（V/V）的接種量將嗜鹽四聯球菌種子液接種于5 mL MRS液體培養(yǎng)基中，30 ℃、100 r/min搖床培養(yǎng)24 h后，取培養(yǎng)液2 mL，12 000 r/min離心2 min，收集菌體，在超凈工作臺中倒掉上清液并加2 mL滅菌生理鹽水進行重懸；吸取菌懸液0.5 mL分別加入到4.5 mL pH 3.0鹽酸溶液、0.3%膽鹽溶液和滅菌生理鹽水中，30 ℃、100 r/min條件下培養(yǎng)4 h，取500 μL上述處理液到5 mL的MRS液體培養(yǎng)基中，30 ℃、100 r/min條件下培養(yǎng)8 h后，采用超微量分光光度計在波長600 nm處測定吸光度值（OD600nm值），并計算菌株存活率，其計算公式如下：

式中：A表示生理鹽水培養(yǎng)液的吸光度值；B表示各處理培養(yǎng)液的吸光度值。

1.3.5 嗜鹽四聯球菌抑菌性試驗

按2%的接種量將嗜鹽四聯球菌種子液接種到MRS液體培養(yǎng)基中，在30 ℃的條件下培養(yǎng)24 h。將發(fā)酵液在4 ℃、10 000 r/min條件下離心10 min，取上清液過濾除菌，保存?zhèn)溆?。將大腸桿菌（Escherichia coli）、單核細胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）及金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）作為指示菌接種于LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃條件下培養(yǎng)24 h。參照麥氏比濁管，用無菌生理鹽水將指示菌懸液菌體濃度稀釋成105CFU/mL，取100 μL均勻涂布在LB固體培養(yǎng)基上，用無菌鑷子在每個培養(yǎng)皿中等距離的放置3個牛津杯，在每個牛津杯中加100 μL嗜鹽四聯球菌發(fā)酵液，在4 ℃靜置1 h。用游標卡尺量取抑菌圈的直徑，每組做三個平行試驗取其平均值。抑菌圈直徑＞8 mm時有抑菌作用[26]。

1.3.6 嗜鹽四聯球菌最適培養(yǎng)條件的測定及菌體生長曲線

將嗜鹽四聯球菌種子液按3%（V/V）的接種量接種于初始pH值為7、NaCl含量為5%的MRS液體培養(yǎng)基中，33 ℃條件下靜置培養(yǎng)32 h，每隔2 h測定其活菌數值，三次重復取均值。在此基礎上考察接種量（1%、2%、3%、4%、5%）（V/V）、培養(yǎng)溫度（27 ℃、30 ℃、33 ℃、35 ℃、37 ℃）、NaCl含量（0、2%、5%、8%、10%）、初始pH值（5、6、7、8、9）對嗜鹽四聯球菌活菌數的影響。

將嗜鹽四聯球菌種子液按最適接種量接種于含最適NaCl含量的MRS液體培養(yǎng)基中，在最適培養(yǎng)條件下靜置培養(yǎng)，每2 h取樣測定活菌數，以培養(yǎng)時間（x）為橫坐標，活菌數（y）為縱坐標為繪制菌株生長曲線。

1.3.7 嗜鹽四聯球菌增殖培養(yǎng)基成分優(yōu)化

單因素試驗：在最適培養(yǎng)條件下，以MRS液體培養(yǎng)基為基礎，分別采用葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、玉米糊精作為培養(yǎng)基的唯一碳源，添加量為2%，考察碳源種類對嗜鹽四聯球菌活菌數的影響；確定最適碳源后，考察碳源添加量（1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%）對嗜鹽四聯球菌活菌數的影響。然后，分別采用蛋白胨、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、硫酸銨作為培養(yǎng)基的唯一氮源，添加量2.5%，考察氮源種類對嗜鹽四聯球菌活菌數的影響；確定最適氮源后，考察氮源添加量（1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%）對嗜鹽四聯球菌活菌數的影響。最后，以未添加果蔬汁的培養(yǎng)基為對照，分別加入胡蘿卜汁、玉米汁、番茄汁、黃豆?jié){，添加量為4%，考察生長因子種類對嗜鹽四聯球菌活菌數的影響；確定最適生長因子后，考察其添加量（2%、4%、6%、8%）對嗜鹽四聯球菌活菌數的影響。以上試驗均在最適培養(yǎng)條件下靜置培養(yǎng)18 h后測定其活菌數，比較不同碳源、氮源、生長因子條件下菌體的生長情況。

響應面優(yōu)化試驗：在單因素試驗的基礎上，以活菌數（Y）為響應值，選擇葡萄糖（A）、蛋白胨（B）和黃豆?jié){（C）為考察因素，選用Box-Benhnken設計法設計響應面試驗，對嗜鹽四聯球菌增殖培養(yǎng)基成分進行優(yōu)化。

2 結果與分析

2.1 嗜鹽四聯球菌疑似菌株的分離及純化

根據乳酸菌的菌落形態(tài)特征從自然發(fā)酵豆醬中初步分離出68株耐鹽乳酸菌。進一步應用革蘭染色進行形態(tài)學觀察，并通過生長試驗、脫脂乳試驗以及過氧化氫酶試驗等生理生化試驗，初步篩選出15株嗜鹽四聯球菌疑似菌株。

2.2 嗜鹽四聯球菌疑似菌株的分子生物學鑒定

15株嗜鹽四聯球菌疑似菌株的系統發(fā)育樹見圖1。由圖1 可知，10 株菌株為嗜鹽四聯球菌（Tetragenococcus halophilus），4株為戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）及1株為肉葡萄球菌（Staphylococcus carnosus）。

圖1 基于16S rDNA基因序列15株菌株的系統發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of 15 strains based on 16S rDNA gene sequences

2.3 嗜鹽四聯球菌的耐受性

10株嗜鹽四聯球菌的耐酸、耐膽鹽性能見圖2。由圖2可知，10株嗜鹽四聯球菌在酸溶液中的存活率均＞30%，其中菌株YSJ-3、YSJ-4、YSJ-5及YSJ-10耐酸性較好；除菌株YSJ-6外，9株嗜鹽四聯球菌在膽鹽溶液的存活率均＞40%，其中菌株YSJ-1、YSJ-5、YSJ-10、YSJ-15的膽鹽耐受性較好。

圖2 嗜鹽四鏈球菌耐受性試驗結果Fig.2 Result of tolerant test of Tetragenococcus halophilus

2.4 嗜鹽四聯球菌的抑菌性

10株嗜鹽四聯球菌對3種致病菌的抑制效果見表1。由表1可知，10株嗜鹽四聯球菌對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌及單核細胞增生李斯特菌均具有抑菌作用，其中菌株YSJ-5、YSJ-11對致病菌的抑菌性較好。綜上，菌株YSJ-5具有較好的耐受性和抑菌性，為優(yōu)良的嗜鹽四聯球菌。

表1 嗜鹽四聯球菌對致病菌的抑制效果Table 1 Inhibitory effect of Tetragenococcus halophilus on pathogenic bacteria

2.5 優(yōu)良嗜鹽四聯球菌YSJ-5最適培養(yǎng)條件的確定

2.5.1 最適接種量的確定

不同接種量對優(yōu)良菌株YSJ-5生長的影響見圖3。由圖3可知，隨著接種量的升高，活菌數呈先升高后降低的趨勢。當接種量為3%時，培養(yǎng)18 h后活菌數最高達到0.28×109CFU/mL，確定最優(yōu)接種量為3%。

圖3 接種量對嗜鹽四聯球菌YSJ-5生長的影響Fig.3 Effect of inoculum on the growth of Tetragenococcus halophilus YSJ-5

2.5.2 最適培養(yǎng)溫度的確定

不同培養(yǎng)溫度對優(yōu)良菌株YSJ-5生長的影響見圖4。由圖4可知，隨著培養(yǎng)溫度的升高，活菌數呈先升高后降低的趨勢。當培養(yǎng)溫度為33 ℃時，培養(yǎng)18 h后活菌數最高達到0.29×109CFU/mL，確定最優(yōu)培養(yǎng)溫度為33 ℃。

圖4 培養(yǎng)溫度對嗜鹽四聯球菌YSJ-5生長的影響Fig.4 Effect of culture temperature on the growth of Tetragenococcus halophilus YSJ-5

2.5.3 最適NaCl含量的確定

不同NaCl含量對優(yōu)良菌株YSJ-5生長的影響見圖5。有研究發(fā)現[27]，嗜鹽四聯球菌最高可耐受NaCl含量26%，最適生長NaCl含量為5%～10%，大多數菌株在無NaCl的情況下也能生長。由圖5可知，隨著NaCl含量的升高，活菌數整體呈先升高后降低的趨勢。當NaCl含量為5%時，培養(yǎng)16 h后活菌數最高達到0.30×109CFU/mL，確定最優(yōu)NaCl含量為5%。

圖5 NaCl含量對嗜鹽四聯球菌YSJ-5生長的影響Fig.5 Effect of salt concentration on the growth of Tetragenococcus halophilus YSJ-5

2.5.4 初始pH值的確定

不同初始pH值對優(yōu)良菌株YSJ-5生長的影響見圖6。由圖6可知，隨著pH值的升高，活菌數整體呈先升高后降低的趨勢。當pH值為8時，培養(yǎng)16 h后活菌數最高達到0.35×109CFU/mL，確定最優(yōu)pH值為8.0。

圖6 初始pH值對嗜鹽四聯球菌YSJ-5生長的影響Fig.6 Effect of initial pH value on the growth of Tetragenococcus halophilus YSJ-5

2.5.5 嗜鹽四聯球菌YSJ-5的生長曲線

嗜鹽四聯球菌YSJ-5的最適培養(yǎng)條件為：接種量3%，培養(yǎng)溫度33 ℃，NaCl含量5%，pH值8.0。在最適生長條件下，菌株YSJ-5的生長曲線見圖7。

圖7 在最適生長條件下嗜鹽四聯球菌YSJ-5的生長曲線Fig.7 Growth curve of Tetragenococcus halophilus YSJ-5 under optimum growth conditions

由圖7可知，培養(yǎng)0～8 h為遲滯期，8～16 h為對數增長期，16～24 h為穩(wěn)定期，24 h后為衰亡期。培養(yǎng)16 h時，活菌數達到最高，為0.35×109CFU/mL。

2.6 嗜鹽四聯球菌YSJ-5增殖培養(yǎng)基組成優(yōu)化試驗

2.6.1 碳源種類及添加量對菌株YSJ-5生長的影響

不同碳源及葡萄糖添加量對優(yōu)良嗜鹽四聯球菌菌株YSJ-5生長的影響見圖8。

由圖8a可知，蔗糖和葡萄糖的增殖效果要明顯優(yōu)于淀粉和麥芽糊精，當碳源為葡萄糖時，菌株YSJ-5的活菌數最高，達到0.59×109CFU/mL。因此，確定最優(yōu)碳源為葡萄糖。由圖8b可知，隨著葡萄糖添加量的增大，菌株YSJ-5的活菌數呈先升高后降低的趨勢，當葡萄糖添加量為2.5%時，活菌數達到最高，為0.74×109CFU/mL。因此，確定葡萄糖最適添加量為2.5%。

圖8 碳源種類（a）及葡萄糖添加量（b）對嗜鹽四聯球菌YSJ-5生長的影響Fig.8 Effects of carbon source type (a) and glucose addition (b) on the growth of Tetragenococcus halophilus YSJ-5

2.6.2 氮源種類及添加量對菌株YSJ-5生長的影響

不同氮源及蛋白胨添加量對優(yōu)良嗜鹽四聯球菌菌株YSJ-5生長的影響見圖9。

圖9 氮源種類（a）及蛋白胨添加量（b）對嗜鹽四聯球菌YSJ-5生長的影響Fig.9 Effects of nitrogen source type(a)and peptone addition(b)on the growth of Tetragenococcus halophilus YSJ-5

由圖9a可知，當氮源為蛋白胨時，菌株YSJ-5的活菌數最高，達到0.90×109CFU/mL。因此，確定最優(yōu)氮源為蛋白胨。由圖9b可知，隨著蛋白胨添加量的增大，菌株YSJ-5的活菌數呈先升高后降低的趨勢，當蛋白胨添加量為2.5%時，活菌數達到最高，為0.90×109CFU/mL。因此，確定蛋白胨最適添加量為2.5%。

2.6.3 生長因子種類及添加量對菌株YSJ-5生長的影響

生長因子種類及添加量對嗜鹽四聯球菌YSJ-5生長的影響見圖10。由圖10a可知，各生長因子對嗜鹽四聯球菌YSJ-5均有增菌效果，黃豆?jié){的增菌效果最為明顯，培養(yǎng)18 h后，活菌數達到1.61×109CFU/mL。因此確定最優(yōu)生長因子為黃豆?jié){。由圖10b可知，隨著黃豆?jié){添加量的增加，嗜鹽四聯球菌YSJ-5的活菌數呈先升高后降低的趨勢，當黃豆?jié){添加量增至4%時，活菌數達到最高，為1.62×109CFU/mL。因此，確定黃豆?jié){的最優(yōu)添加量為4%。

圖10 生長因子種類（a）及黃豆?jié){添加量（b）對嗜鹽四聯球菌YSJ-5生長的影響Fig.10 Effects of growth factor type (a) and soybean milk addition (b)on the growth of Tetraphylococcus halophilus YSJ-5

2.6.4 響應面優(yōu)化試驗

依據Box-Benhnken中心組合試驗設計原理，以前期培養(yǎng)條件優(yōu)化及培養(yǎng)基優(yōu)化單因素試驗結果為基礎，選取葡萄糖（A）、蛋白胨（B）和黃豆?jié){（C）添加量為考察因素，嗜鹽四聯球菌YSJ-5活菌數（Y）為響應值，利用響應面分析法優(yōu)化嗜鹽四聯球菌YSJ-5的增殖培養(yǎng)基組分，試驗設計及結果見表2，方差分析見表3。

采用Design Expert 8.0.6軟件對表2試驗結果進行二次多項回歸擬合，得到自變量的回歸模型方程為Y=219.20+44.75A-27.38B+11.13C+4.75AB+33.25AC+7.50BC-67.85A2-46.10B2-65.60C2。由表3可知，模型極顯著（P＜0.01），失擬項不顯著（P＞0.05），表明方程與實際數據能夠良好擬合，此試驗設計結果較為可靠，可用于優(yōu)化嗜鹽四聯球菌YSJ-5的增殖培養(yǎng)基組分。由表3亦可知，一次項A、B、交互項AC及二次項A2、B2、C2對結果影響極顯著（P＜0.01），一次項C對結果影響顯著（P＜0.05），其他項對結果影響不顯著（P＞0.05）。其中交互項AC對結果影響的響應面及等高線見圖11。

表2 響應面試驗設計與結果Table 2 Design and results of the response surface tests

表3 響應面試驗結果的方差分析Table 3 Variance analysis of response surface tests

由圖11可知，響應面呈曲凸面，等高線呈橢圓形，說明葡萄糖添加量與黃豆?jié){添加量間的交互作用對嗜鹽四聯球菌YSJ-5活菌數的影響顯著（P＜0.05），與方差分析結果一致。

應用Design Expert 8.0.6軟件對回歸模型方程進行分析，得出最優(yōu)增殖培養(yǎng)基組成為：葡萄糖添加量2.70%，蛋白胨添加量2.36%，黃豆?jié){添加量4.41%，嗜鹽四聯球菌YSJ-5活菌數的預測值為2.31×109CFU/mL。在最優(yōu)條件下進行驗證試驗，嗜鹽四聯球菌YSJ-5培養(yǎng)18 h后的活菌數實際值為2.20×109CFU/mL，與理論預測值相近，是優(yōu)化前活菌數（3.50×108CFU/mL）的6.31倍。因此，應用響應面法優(yōu)化所得到的增殖培養(yǎng)基組成參數準確可靠，同時也具有一定實用價值。

3 結論

本研究采用傳統培養(yǎng)分離方法，從遼寧地區(qū)14份傳統自然發(fā)酵豆醬樣品中初步分離出68株耐鹽乳酸菌株，通過形態(tài)學觀察、生理生化試驗，初步篩選出15株嗜鹽四聯球菌疑似菌株。采用分子生物學技術鑒定，其中10株為嗜鹽四聯球菌。由耐受性試驗可知，菌株YSJ-3、YSJ-4、YSJ-5、YSJ-10對酸溶液耐受性較好，菌株YSJ-1、YSJ-3、YSJ-4、YSJ-5、YSJ-10、YSJ-15對膽鹽的耐受性較好，說明菌株YSJ-3、YSJ-4、YSJ-5、YSJ-10的益生性較好。由抑菌性試驗可知，菌株YSJ-5、YSJ-11對致病菌的抑菌性較好，其中YSJ-5的抑菌性較YSJ-11更好。因此，確定菌株YSJ-5菌株為優(yōu)良菌株。該菌株的最適培養(yǎng)條件為接種量3%（V/V）、培養(yǎng)溫度33 ℃、NaCl含量5%、初始pH值8.0，在此條件下，其培養(yǎng)16 h時達到穩(wěn)定期，OD600nm值達到最高為1.822。在最適培養(yǎng)條件下，通過單因素及響應面試驗確定菌株YSJ-5的最優(yōu)增殖培養(yǎng)基組成為葡萄糖2.70%、蛋白胨2.36%、黃豆?jié){4.41%，其他成分及添加量與基礎MRS液體培養(yǎng)基一致，在此最優(yōu)培養(yǎng)基組成下，菌株YSJ-5的活菌數達到2.20×109CFU/mL。