微生物法生產(chǎn)蝦青素的研究進(jìn)展

張 辰，徐 慧，朱坤福，姚明靜，劉建軍，馮 苗，王珊珊，祝 蕾，田延軍

（1.齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）山東省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計(jì)院，山東 濟(jì)南 250013；2.山東朱氏藥業(yè)集團(tuán)有限公司，山東 菏澤 274300）

蝦青素是目前經(jīng)濟(jì)價(jià)值和應(yīng)用價(jià)值較高的類胡蘿卜素物質(zhì)，由于其多方面的生理功能而引起人們極大重視。蝦青素具有比維生素E、β-胡蘿卜素更強(qiáng)的抗氧化活性[1]，可以有效抑制細(xì)胞的氧化損傷和癌變[2]，同時(shí)還具有抗高血壓、預(yù)防心血管疾病、增強(qiáng)免疫、防紫外線輻射等諸多功效。此外，由于其具有抗氧化特性以及其他生理生化活性，蝦青素還可以作為食品添加劑[3]。因此，蝦青素在醫(yī)藥、食品、飼料、保健品和化妝品等領(lǐng)域的應(yīng)用與日俱增。

本文介紹了蝦青素的結(jié)構(gòu)性質(zhì)、蝦青素來源和生產(chǎn)方法，著重講述紅法夫酵母（Phaffia rhodozyma）生產(chǎn)蝦青素的生物合成途徑、發(fā)酵培養(yǎng)條件以及蝦青素的破壁提取和純化方法，為蝦青素工業(yè)化生產(chǎn)提供一定理論基礎(chǔ)。

1 蝦青素的性質(zhì)與結(jié)構(gòu)

蝦青素是萜烯類不飽和化合物，化學(xué)名為3,3'-二羥基-β,β'-胡蘿卜素-4,4'-二酮，分子式為。在100 kPa條件下，熔點(diǎn)為216 ℃，沸點(diǎn)為774 ℃[5]。蝦青素具有疏水性，在室溫條件下易溶于苯、氯仿、丙酮和二甲亞砜等有機(jī)溶劑中[6]，微溶于甲醇、乙醇和石油醚等極性較大的有機(jī)溶劑中。蝦青素對(duì)光、氧、溫度等因素敏感，容易發(fā)生降解反應(yīng)從而失去生物活性。

天然蝦青素由4個(gè)異戊二烯結(jié)構(gòu)組成的長的共軛雙鍵碳鏈和兩端α-羥基酮的六元環(huán)構(gòu)成，分子結(jié)構(gòu)與β-胡蘿卜素類似。2個(gè)六元環(huán)上的羥基，構(gòu)成手性中心，形成了蝦青素3種不同的構(gòu)型：左旋（3S-3'S），右旋（3R-3'R）和內(nèi)消旋（3R-3'S）。

雨生紅球藻（Haematococcus pluvialis）中按干質(zhì)量計(jì)算含有1.5%～3.0%的（3S-3'S）蝦青素，主要以蝦青素雙酯和蝦青素單酯的形式[7]。1972年，PHAFF H J[8]研究發(fā)現(xiàn)，紅法夫酵母可以合成蝦青素，產(chǎn)生右旋構(gòu)型（3R-3'R）的蝦青素。目前，已知只有紅法夫酵母產(chǎn)生（3R-3'R）構(gòu)型的天然蝦青素，此種天然構(gòu)型的蝦青素在人體的生物利用率更高[9]。

2 蝦青素的天然來源和生產(chǎn)方法

2.1 天然來源

蝦青素廣泛存在于動(dòng)物（如水生動(dòng)物、鳥類）、植物、真菌、藻類和細(xì)菌中。野生鮭魚從食物鏈中獲得蝦青素，但養(yǎng)殖鮭魚從含蝦青素的飼料中獲得鮭魚肉的特征顏色[10]?；鹆银B羽毛的艷麗顏色也是因?yàn)槲r青素的存在。蝦青素的含量和存在狀態(tài)在動(dòng)物體內(nèi)有所不相同，如三文魚的肌肉、內(nèi)臟器官和血漿的蝦青素以游離態(tài)為主，而皮、魚鱗和魚籽中所含蝦青素主要以酯化形式存在。動(dòng)物體均不能自行從頭開始合成蝦青素，需要攝入的藻類、酵母、植物來獲得蝦青素[11]。目前，蝦青素應(yīng)用廣泛，消費(fèi)需求不斷增加，僅依賴于食物鏈中存在的蝦青素含量不足以滿足各大行業(yè)需求?，F(xiàn)有蝦青素的生產(chǎn)方法主要包括化學(xué)合成法、天然提取法和生物合成法。

2.2 生產(chǎn)方法

2.2.1 化學(xué)合成方法

利用多步化學(xué)和生物催化反應(yīng)來生產(chǎn)蝦青素的方法稱為化學(xué)合成法。根據(jù)合成方法的差異，化學(xué)合成法又分為半合成法和全合成法。半合成法是以蝦青素代謝途徑中的前體物質(zhì)（如葉黃素、角黃質(zhì)）為原料來制備蝦青素的方法；全合成法即完全利用化學(xué)合成的方法來獲得蝦青素的方法[12]?；瘜W(xué)合成蝦青素具有生產(chǎn)成本較低、產(chǎn)量高、蝦青素純度可達(dá)96%以上等優(yōu)點(diǎn)[13]。但化學(xué)合成的蝦青素是多種構(gòu)型的混合物，并含有副產(chǎn)物，在生物體內(nèi)的吸收利用率較低[14]，穩(wěn)定性、安全性以及抗氧化活性低于天然提取的蝦青素[15]。

2.2.2 天然提取法

海洋生物中多存在天然蝦青素，采用粉碎蝦、蟹等富含蝦青素的加工副產(chǎn)品、去除石灰質(zhì)、利用有機(jī)溶劑等方式提取蝦青素的方法稱為天然提取法。這種制備方式能促進(jìn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，同時(shí)減少廢棄水產(chǎn)品副產(chǎn)物對(duì)環(huán)境的污染。但由于廢棄的蝦、蟹中甲殼中灰分、幾丁質(zhì)含量高，而蝦青素的含量低會(huì)造成提取過程復(fù)雜，存在提取費(fèi)用高的問題[16]。

2.2.3 微生物發(fā)酵法

利用酵母、藻類和細(xì)菌生產(chǎn)蝦青素的方法稱為微生物發(fā)酵法。主要菌種包括：單細(xì)胞綠藻雨生紅球藻、銅綠小球藻（Chlorella aeruginosa）[11]、紅法夫酵母[17]、粘紅酵母（Rhodotorula rubra）、膠紅酵母（Rhodotorula glutinosa）[18]和副球菌屬（Paracoccus）[19-20]。發(fā)酵法生產(chǎn)的蝦青素結(jié)構(gòu)明確、副產(chǎn)物少、對(duì)環(huán)境友好。但受到產(chǎn)量低、培養(yǎng)條件要求嚴(yán)格、培養(yǎng)成本高等因素的制約。使用廉價(jià)培養(yǎng)原料、選育優(yōu)質(zhì)的高產(chǎn)菌種使其可以應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)是微生物發(fā)酵法生產(chǎn)蝦青素的關(guān)鍵因素。

3 產(chǎn)蝦青素的微生物

3.1 藻類生產(chǎn)蝦青素

許多藻類都可以產(chǎn)生蝦青素，如雨生紅球藻、衣藻（Chlamydomonas）、傘藻（Acetabularia）、裸藻（Euglena）等。雨生紅球藻是一種淡水單細(xì)胞綠藻，屬于綠藻門，團(tuán)藻目，紅球藻科，紅球藻屬，是蝦青素生產(chǎn)的主要藻類。雨生紅球藻胞內(nèi)蝦青素主要以雙酯化蝦青素和單酯化蝦青素存在，少量以游離態(tài)形式存在。但雨生紅球藻的生長時(shí)間長，培養(yǎng)條件要求嚴(yán)苛，需要光照，生產(chǎn)場所受限，并且蝦青素存在于厚壁孢子中，提取率低、連續(xù)性較差[21-23]。衛(wèi)生部在2010年批準(zhǔn)雨生紅球藻為新資源食品；自此，多種富含雨生紅球藻蝦青素的保健食品陸續(xù)得到國家食品藥品監(jiān)督管理局的批準(zhǔn)，這些舉措對(duì)推動(dòng)蝦青素產(chǎn)品的研究開發(fā)及產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展具有積極意義[24]。

銅綠小球藻是另一種產(chǎn)生天然蝦青素的綠藻。銅綠小球藻的蝦青素含量低于雨生紅球菌，但這種藻類具有特殊的培養(yǎng)優(yōu)勢(shì)。銅綠小球藻是一種好氧的異養(yǎng)生物，可以使用葡萄糖作為唯一的碳源，生長快，可達(dá)到超高細(xì)胞密度，對(duì)不利的環(huán)境條件敏感性低以及易于在室內(nèi)和室外進(jìn)行培養(yǎng)。

3.2 細(xì)菌生產(chǎn)蝦青素

蝦青素存在于短桿菌（Brevibacterium）、副球菌屬、乳酸分支桿菌（Mycobacterium lacticola）等多種細(xì)菌中。盡管大多數(shù)細(xì)菌的蝦青素含量遠(yuǎn)低于藻類和紅法夫酵母[25-27]，但通過在細(xì)菌中導(dǎo)入蝦青素合成相關(guān)基因，可改善細(xì)菌產(chǎn)蝦青素低的問題。尤其是革蘭氏陰性菌[28]的細(xì)胞壁薄易破碎，色素易提取，適合進(jìn)行大規(guī)模高密度發(fā)酵培養(yǎng)[11]。通過細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)蝦青素，可大幅度降低天然蝦青素的生產(chǎn)成本，對(duì)未來蝦青素的工業(yè)生產(chǎn)具有重要意義。

3.3 酵母生產(chǎn)蝦青素

酵母發(fā)酵生產(chǎn)蝦青素，主要用到的菌種包括紅法夫酵母、粘紅酵母[29]、海洋紅酵母（Rhodotorula benthica）[30-31]以及深紅酵母（Rhodotrula glutinis）。

紅法夫酵母是真菌界、真菌門、半知菌亞門、隱球酵母科、紅法夫酵母屬的唯一種，繁殖方式為無性繁殖中的芽殖，代謝方式為有氧呼吸和無氧呼吸兩種，是目前國內(nèi)外微生物發(fā)酵生產(chǎn)蝦青素普遍采用的真菌[32-34]。紅法夫酵母野生株系中蝦青素達(dá)細(xì)胞干質(zhì)量的0.05%，一些突變株系中達(dá)1.0%，約占總類胡蘿卜素含量的80%。紅法夫酵母生產(chǎn)蝦青素具有如下優(yōu)勢(shì)：可利用多種碳源和氮源生產(chǎn)蝦青素，細(xì)胞生長繁殖速度快，可實(shí)現(xiàn)高密度培養(yǎng)；生產(chǎn)周期短，成本低；細(xì)胞壁容易破碎，生產(chǎn)的蝦青素為右旋構(gòu)型（3R-3'R），且是游離態(tài)，易于人體吸收，提取后酵母菌體可直接作為飼料添加劑[4，35]。

4 酵母蝦青素的生物合成

許多研究表明，甲羥戊酸（mevalonate，MVA）、異戊烯焦磷酸（isopentenyl pyrophosphate，IPP）、法呢基焦磷酸（farnesyl pyrophosphate，F(xiàn)PP）、二甲基烯丙基焦磷酸（dimethylallylpyrophosphate，DMAPP）、牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸（geranylgeranyl pyrophosphate，GGPP）、八氫番茄紅素、四氫番茄紅素、β-胡蘿卜素等是蝦青素的生物合成代謝途徑中的重要中間產(chǎn)物。酵母生物合成蝦青素的途徑分為兩個(gè)階段：第一階段為β-胡蘿卜素的合成；第二階段為β-胡蘿卜素通過氧化及羥基化生成蝦青素[36]。酵母中類胡蘿卜素來源于甲羥戊酸途徑，由葡萄糖出發(fā)，經(jīng)糖酵解途徑（embden-meyerhof pathway，EMP）生成丙酮酸，再氧化脫羧得到乙酰輔酶A（Acetyl-CoA），三分子Acetyl-CoA縮合形成MVA，MVA再經(jīng)磷酸化脫羧轉(zhuǎn)化成異戊二烯焦磷酸（C5），IPP是所有異戊二烯類化合物（如蝦青素、胡蘿卜素和麥角固醇）的合成前體。IPP經(jīng)縮合形成GGPP（C20），兩分子GGPP經(jīng)過二聚作用生成無色的八氫番茄紅素被認(rèn)為是類胡蘿卜素合成的第一個(gè)特異步驟。后續(xù)經(jīng)多步脫氫和一步環(huán)化合成β-胡蘿卜素[37]。最終經(jīng)過兩步酶促反應(yīng)，利用酮化酶催化β-胡蘿卜素分子上引入2個(gè)4位的酮基，羥化酶催化引入2個(gè)3位的羥基，將β-胡蘿卜素催化生成蝦青素，酵母蝦青素的合成途徑[4]如下：

5 酵母發(fā)酵過程的控制與優(yōu)化

產(chǎn)蝦青素的酵母具有很強(qiáng)的代謝能力，可以利用單糖[38]、二糖和多糖、有機(jī)酸和醇類物質(zhì)。它還可以迅速利用簡單氮源（如銨、硝酸鹽、尿素或氨基酸）以及復(fù)雜混合物（如酵母膏、牛肉膏、麥芽提取物或蛋白胨）。還可以利用工業(yè)廢料，可有效降低生產(chǎn)成本，如制糖工藝、玉米濕磨工藝的廢料[39]或木材的酶水解溶液[40]。STOKLOSA R J等[41]利用甜高粱蔗渣（sweet sorghumbagasse，SSB）在2 L發(fā)酵罐中培養(yǎng)法夫酵母發(fā)酵產(chǎn)生蝦青素65.4 mg/L，占總干細(xì)胞蝦青素含量為2.49 mg/g。但是，低成本的培養(yǎng)基可能含有未知的胡蘿卜素生成抑制劑，使其不適用于生產(chǎn)過程[42]。在上述實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上添加SSB水解液發(fā)酵蝦青素含量反而降低至53.3mg/L，這可能是SSB中的酚類化合物起了抑制作用[27，41]。在大多數(shù)情況下，培養(yǎng)基必須補(bǔ)充必要的營養(yǎng)成分，還可能包括胡蘿卜素生成的誘導(dǎo)劑或前體[43]。添加一些成分會(huì)提高的蝦青素產(chǎn)量，如添加新鮮番茄汁[44]、胡蘿卜汁[45]。

營養(yǎng)物質(zhì)（碳源、氮源、金屬離子、維生素等）和物理因素（溫度、pH、供氧等）都會(huì)影響細(xì)胞生長和蝦青素生成。文獻(xiàn)中采用的菌種或蝦青素高產(chǎn)突變菌株的不同，造成培養(yǎng)基組成和發(fā)酵工藝條件不盡相同（見表1）。同時(shí)，其中的突變菌株含有隨機(jī)插入的基因片段，數(shù)量或位置以及插入基因的確切功能性質(zhì)在大多數(shù)情況下仍不清楚，從而可能影響文獻(xiàn)之間的可比性。對(duì)于營養(yǎng)物質(zhì)和培養(yǎng)方式對(duì)細(xì)胞生長和蝦青素產(chǎn)量的影響可以做以下總結(jié)。

紅法夫酵母是一種中等嗜冷性酵母、其生長溫度范圍為0～27 ℃。根據(jù)所使用的（突變）菌株、蝦青素生產(chǎn)和酵母細(xì)胞生長的最佳溫度通常位于18～22 ℃。蝦青素合成和酵母細(xì)胞生長的最佳pH值通常介于5～6之間。酵母細(xì)胞生長最佳溫度或pH值等培養(yǎng)條件一般情況下與蝦青素合成以及積累的最佳溫度或pH值不同。因此，在發(fā)酵過程中改變pH值或溫度均可在發(fā)酵培養(yǎng)過程中提高蝦青素產(chǎn)量。無論是突變株還是野生株，培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)基pH值對(duì)細(xì)胞內(nèi)蝦青素含量、類胡蘿卜素組成都有很強(qiáng)的影響[52-53]。

氧在蝦青素生物合成中起著關(guān)鍵作用、蝦青素的積累量與氧的轉(zhuǎn)移速率有關(guān)。氧氣供應(yīng)不足導(dǎo)致β-胡蘿卜素積累、降低β-胡蘿卜素向蝦青素氧化的效率。因此，充分的氧氣有助于蝦青素的積累[54]。在10%～20%的空氣飽和度下有一個(gè)臨界溶解氧濃度，低于此值的溶解氧濃度會(huì)抑制細(xì)胞生長和類胡蘿卜素的形成。然而，氧氣含量過多會(huì)抑制酵母細(xì)胞生長。因此，為紅法夫酵母細(xì)胞提供適量的氧氣有助于提高蝦青素的合成。所以，在培養(yǎng)不同菌株時(shí)需要對(duì)菌體耗氧量進(jìn)行確定從而調(diào)節(jié)發(fā)酵設(shè)備的轉(zhuǎn)速。除了調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速、改變空氣流速提高通氧量、向培養(yǎng)基中添加具有高氧溶解度的生物相容性有機(jī)溶劑作為氧載體，比如油酸、正十二烷、豆油、Tween-80、乙酸乙酯等、也可以改善細(xì)胞的氧轉(zhuǎn)移速率。

在細(xì)胞生長指數(shù)期，高糖將會(huì)抑制番茄紅素合成β-胡蘿卜素及β-胡蘿卜素合成蝦青素的兩個(gè)過程。因此，不宜采用高碳源濃度[54]。但在細(xì)胞生長的后期，高碳源濃度可促進(jìn)胡蘿卜素的積累[55]。因此，可以通過采用分批補(bǔ)料工藝來消除高糖濃度的拮抗作用，同時(shí)實(shí)現(xiàn)高生物量和高細(xì)胞內(nèi)蝦青素濃度。工業(yè)上，紅法夫酵母發(fā)酵過程分為兩個(gè)階段：細(xì)胞生長階段和成熟階段。通過提供一個(gè)低的C/N比率（碳源與氮源濃度的比率），細(xì)胞最初表現(xiàn)為快速的生長，當(dāng)接近高的細(xì)胞濃度時(shí)生長速率逐漸變慢。在這一階段，細(xì)胞的生長速度高于蝦青素的形成速度。當(dāng)細(xì)胞接近生長穩(wěn)定期時(shí)，轉(zhuǎn)換到高碳氮比，蝦青素的合成速率高于細(xì)胞的生長速度。在相同發(fā)酵時(shí)間內(nèi)，通過對(duì)不同菌體發(fā)酵階段的碳源濃度和碳氮比進(jìn)行調(diào)控，可同時(shí)實(shí)現(xiàn)高細(xì)胞產(chǎn)量和高蝦青素產(chǎn)量。

所使用的（突變）菌株和培養(yǎng)基決定了實(shí)現(xiàn)最大加工生產(chǎn)率的進(jìn)料控制，并且可以通過幾種方法建立。如基于Monod指數(shù)進(jìn)料、pH-stat控制[40]、DO-stat培養(yǎng)控制或測定碳源的濃度后的脈沖進(jìn)料（參見表1）。作為補(bǔ)料分批工藝的一種替代方法，可以考慮半連續(xù)和連續(xù)兩種工藝。評(píng)估表1中的數(shù)據(jù)，脈沖進(jìn)料和指數(shù)進(jìn)料似乎是較好的進(jìn)料方法。另一種通過在最初代謝的碳源耗盡后添加緩慢代謝的碳源，如甘油或乙酸來增加成熟階段蝦青素。

表1 產(chǎn)蝦青素酵母的培養(yǎng)基及蝦青素產(chǎn)量Table 1 Medium and astaxanthin yield of astaxanthin-producing yeast

6 不同來源蝦青素的提純方法

6.1 蝦青素的破壁處理方法

蝦青素為胞內(nèi)產(chǎn)物，一般需經(jīng)過破壁、提取和純化等步驟才可從酵母菌體中提取。常用的破壁方法有機(jī)械法、化學(xué)法[56]、酶解法和熱處理等[57]。

機(jī)械法是利用機(jī)械設(shè)備將細(xì)胞壁撕裂、通過細(xì)胞內(nèi)滲透壓釋放內(nèi)含物。主要方式有超聲波破碎法、珠式研磨法、噴霧撞擊破碎法以及高壓均漿法。機(jī)械法操作簡便而被廣泛使用、但易引起部分位置溶液溫度過高造成蝦青素?fù)p失。

化學(xué)法主要有二甲基亞砜法、酸堿加熱法和有機(jī)溶劑滲透等。堿提法和酸解法破壁需要消耗大量堿和有機(jī)酸、使污水排放量增加、造成環(huán)境污染、并且較強(qiáng)的酸堿會(huì)對(duì)蝦青素造成傷害。采用5.55 mol/L乳酸濃度、30 ℃破碎溫度進(jìn)行破壁提取可減小對(duì)蝦青素的損害，最終提取出的蝦青素和總類胡蘿卜素含量分別為1 294.7 μg/g 和1 516.0 μg/g、蝦青素占總提取物的85.4%[56]。

β-葡聚糖酶、蝸牛酶等能水解細(xì)胞壁骨架成分β-葡聚糖、與其它方法相比可更加有效地破壁、且避免蝦青素溢出菌體減少損失。酶法處理?xiàng)l件溫和、對(duì)設(shè)備的要求低、處理過程對(duì)環(huán)境造成的污染也較小、提取的蝦青素比其他方法獲得的蝦青素更加穩(wěn)定。

目前，已經(jīng)開發(fā)出用于提取活性組分的多種現(xiàn)代提取方法、例如脈沖電場（pulsed electric field，PEF）[58]、高壓微流化（high-pressure microfluidisation，HPMF）、離子液體（ionic liquids，ILs）[59]等新興技術(shù)。PEF的應(yīng)用可能通過細(xì)胞膜的瞬時(shí)透化和細(xì)胞區(qū)室之間帶電物質(zhì)的電泳運(yùn)動(dòng)而對(duì)細(xì)胞造成致命性損傷或誘導(dǎo)亞致死應(yīng)激。已有一些學(xué)者研究利用PEF從微藻中提取不同有價(jià)值化合物。HPMF是一種新興技術(shù)，用于乳狀液的高速?zèng)_擊、強(qiáng)剪切、瞬時(shí)壓降、高頻振動(dòng)、氣蝕和超高壓（高達(dá)200 MPa）、大分子的改性和生物活性成分的提取。與傳統(tǒng)的高壓均質(zhì)相比、HPMF具有不同的閥、腔室設(shè)計(jì)和更高的工作壓力。ILs由松散保持的陽離子和陰離子組成，其特征在于可忽略的蒸氣壓、低熔融溫度、優(yōu)異的熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性。此外，其溶解纖維素的容量高、離子液體混合物對(duì)小球藻脂質(zhì)提取的影響小。因此，ILs是一種可用于回收小球藻中脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的新型細(xì)胞破碎技術(shù)。比較從雨生紅球藻中提取蝦青素的細(xì)胞壁破壞效率的各種技術(shù)如PEF、超聲（ultrasound、US）、HPMF、HCl和ILs。結(jié)果表明，ILs、HCl和HPMF處理對(duì)細(xì)胞破壞最有效、蝦青素提取率超過80%、PEF和US對(duì)細(xì)胞壁的破壞效率較低[60]。與傳統(tǒng)破壁技術(shù)相比、PEF、HPMF和ILs等新興破壁技術(shù)對(duì)蝦青素影響較小，實(shí)驗(yàn)過程中所用溶劑較少、耗時(shí)短、節(jié)能環(huán)保。

6.2 蝦青素的提取方法

蝦青素是脂溶性物質(zhì)，溶于有機(jī)溶劑不溶于水，可利用丙酮、乙醇、甲醇、石油醚等極性有機(jī)溶劑進(jìn)行提取。不同溶劑對(duì)南極磷蝦中總類胡蘿卜素提取率影響的結(jié)果表明，無水乙醇的提取效果最好，總類胡蘿卜素的提取率達(dá)到了73.3%[61]。然而，蝦青素雖溶于有機(jī)溶劑但溶解度較低，因此，單一溶劑提取效果有限。黃開森等[62]利用乙酸乙酯和乙醇2∶1混合溶液作為浸提液的酸熱法提取的蝦青素含量顯著高于單一溶液的提取效果。

6.3 蝦青素的純化及檢測方法

在蝦青素的純化方面，主要用到薄層層析法（thin layer chromatography，TLC）和柱層析法，薄層層析法可用于粗提物成分的簡單確定，該方法分離度不高、結(jié)果重現(xiàn)性差、易受外界因素干擾、對(duì)操作人員的操作過程要求極高、不便于純化后期實(shí)驗(yàn)操作。與其他純化方法相比，柱層析設(shè)備低廉、更換固定相和流動(dòng)相方便，是最常用的純化方法。利用不同固定相和流動(dòng)相的組合能夠?qū)崿F(xiàn)一些相對(duì)簡單樣品的分離與純化、應(yīng)用范圍很廣。薄層層析法和柱層析適用于前期的純化過程，后期純化利用制備型高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法可使純化效果達(dá)98%以上、但制備成本較高。HPLC法不僅可以得到高純度蝦青素，還可以選擇合適的流動(dòng)相利用C18、C30高效液相色譜柱準(zhǔn)確測定蝦青素的含量。在實(shí)驗(yàn)中為了快速測定蝦青素的產(chǎn)生量，通常采用紫外可見分光光度法。

7 結(jié)語與展望

蝦青素具有廣闊的開發(fā)潛力，在醫(yī)藥、化妝品、保健品、飼料添加劑等方面均具有很大的利用價(jià)值和發(fā)展空間。天然蝦青素和化學(xué)合成蝦青素的制備過程都各具有一定缺點(diǎn)。今后，蝦青素微生物法合成研究仍將以開發(fā)遺傳性狀穩(wěn)定的高產(chǎn)菌株、使用低成本的培養(yǎng)原料、探索操作簡便的生產(chǎn)工藝、利用先進(jìn)、快速、精準(zhǔn)的提取純化技術(shù)來降低生產(chǎn)成本、提高蝦青素產(chǎn)量及純度為主要內(nèi)容。