靈菌紅素的研究進展

馮 苗，朱坤福，田延軍，劉建軍，張 辰，王珊珊，祝 蕾，徐 慧

（1.齊魯工業(yè)大學（山東省科學院）山東省食品發(fā)酵工業(yè)研究設計院，山東 濟南 250013；2.山東朱氏藥業(yè)集團有限公司，山東 菏澤 274300）

靈菌紅素是一種具有三吡咯環(huán)的線性環(huán)狀化合物，其三個吡咯環(huán)分別命名為A、B、C環(huán)，其中A環(huán)源于L-脯氨酸，B環(huán)源于L-絲氨酸，C環(huán)源于甘氨酸[1]。靈菌紅素是靈菌素大家族的一員，靈菌素中各種色素結(jié)構(gòu)如下[1-5]：

靈菌素還包括十一烷基靈菌紅素、環(huán)烷基靈菌紅素、間環(huán)靈菌紅素、鏈玉紅菌素B、靈菌紅素R1、壬基靈菌紅素、甲基環(huán)庚基靈菌紅素、類靈菌紅素以及鹽酸環(huán)狀靈菌紅素等，其中靈菌紅素、十一烷基靈菌紅素以及類靈菌紅素屬于線性三吡咯結(jié)構(gòu)，其他靈菌素屬于環(huán)狀三吡咯結(jié)構(gòu)[2-5]。靈菌紅素是由微生物的次級代謝產(chǎn)生的紅色色素，存在于微生物細胞的細胞壁內(nèi)，易溶于乙醇、甲醇、乙醚、丙酮、氯仿等有機溶劑，不易溶于水，對光敏感，并隨著溶液體系的氫離子濃度（hydrogen ion concentration，HIC）指數(shù)pH變化而變化，在酸性環(huán)境下呈紅色，在堿性環(huán)境下呈黃色，在酸性環(huán)境下更穩(wěn)定[6]。還有研究表明，靈菌紅素在溶液中以順式（β）和反式（α）旋轉(zhuǎn)體的混合物存在，其比例取決于溶液的pH值[7]。對靈菌紅素的鑒定通常采用紫外-可見光譜、紅外光譜、高效液相色譜、薄層色譜、核磁共振波譜等方法，此類方法都可以進行定性分析，而紫外-可見光譜和高效液相色譜還可以進行定量分析[8]。自然界中可以產(chǎn)生靈菌紅素的微生物種類眾多，包括沙雷氏菌屬（Serratia），河氏菌屬（Hahella）、弧菌屬（Vibrio）、鏈霉菌屬（Streptomyces）等，沙雷氏菌屬中的普城沙雷氏菌（Serratia plymuthica）、深紅沙雷氏菌（Serratia rubidaea）及粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens）均可以產(chǎn)生靈菌紅素[9]，其中研究最多的是粘質(zhì)沙雷氏菌，該菌也是最早發(fā)現(xiàn)產(chǎn)靈菌紅素的微生物[10]。粘質(zhì)沙雷氏菌屬于革蘭氏陰性桿菌，在自然界中生存性極強，在植物根部、水以及昆蟲和哺乳動物等均可以生存[11]，還有大量研究表明，粘質(zhì)沙雷氏菌的最佳生長溫度為37 ℃。有關(guān)靈菌紅素對其生產(chǎn)菌株的生理作用研究目前還沒有定論，有研究提出，微生物產(chǎn)生靈菌紅素是為了抵御外界的環(huán)境競爭，從而保證自身的生存[12]。據(jù)報道，靈菌紅素生產(chǎn)菌株的遺傳物質(zhì)中超過20個基因用于合成靈菌紅素，占其自身全部遺傳物質(zhì)的很大一部分[2]，足以證明靈菌紅素對其生產(chǎn)菌株的重要性。

靈菌紅素最初由于其抗癌、抗細菌、抗真菌、抗瘧疾、免疫抑制等生物活性而備受關(guān)注，近年來，靈菌紅素越來越多的潛在應用被發(fā)現(xiàn)，如靈菌紅素的光敏感性，使其成為染料敏化太陽能電池的化學光敏劑的潛在替代品[13]，以及作為防曬物質(zhì)應用于化妝品中。靈菌紅素獨特的紅色色澤以及易上色和上色穩(wěn)定等特點有望推動食品及紡織行業(yè)的發(fā)展進步[14]。靈菌紅素還可以抑制藻類生長、殺蟲、抗重金屬等，因此，具有減緩水環(huán)境污染、保護綠植的作用[2，15，16]。靈菌紅素的生產(chǎn)目前以微生物發(fā)酵法為主，對該方法的研究主要是針對發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化、發(fā)酵參數(shù)的優(yōu)化以及對菌種和基因的改造等。目前，靈菌紅素在沙雷氏菌體內(nèi)的合成途徑已經(jīng)明確，是由一條二分叉途徑合成的。本文對靈菌紅素的應用、發(fā)酵工藝、生物合成以及生產(chǎn)菌株的改造進行綜合闡述，以期為靈菌紅素的開發(fā)應用提供參考。

1 靈菌紅素的理化性質(zhì)

靈菌紅素是一種含有三吡咯環(huán)的紅色線性化合物，分子式為C20H25N3O，分子質(zhì)量為323.42 Da，全稱為4-甲氧基-2,2'-二吡咯-5-甲戊基吡咯，由含單吡咯的2-甲基-3-戊基吡咯（2-methyl-3-amyl pyrrole，MAP）和含雙吡咯的4-甲氧基-2,2'-二吡咯-5-甲醛（4-methoxy-2-2'-bipyrrole-5-carbaldehyde，MBC）組成[8]。靈菌紅素為非水溶性物質(zhì)，易溶于乙醇、甲醇、丙酮等有機物質(zhì)，不溶于水[3]。靈菌紅素的穩(wěn)定性受溫度、光照及金屬離子等的影響，高溫強光照射下靈菌紅素易分解，不同金屬離子對靈菌紅素的穩(wěn)定性具有不同作用，Ca2+使靈菌紅素穩(wěn)定性增強，Cu2+使靈菌紅素穩(wěn)定性減弱[6，14]。介質(zhì)溶液中氫離子濃度對靈菌紅素有顯著影響，在pH 2～5的酸性介質(zhì)中該色素呈現(xiàn)紅色，且在波長535 nm處有穩(wěn)定的吸收峰；而在堿性介質(zhì)中該色素呈現(xiàn)橙黃色，在波長470 nm呈現(xiàn)最大吸收峰，色素損失較大[6]。因此，利用酸性介質(zhì)中靈菌紅素在波長535 nm處穩(wěn)定的吸收峰對靈菌紅素進行定性及定量測定。質(zhì)譜檢測323 m/z（質(zhì)核比）處的吸收峰表明靈菌紅素的存在，而薄層色譜分析比移值及高效液相色譜分析保留值根據(jù)實驗條件的不同存在差異[8]。

2 靈菌紅素的應用

如表1所示，靈菌紅素在很多方面具有潛在的應用潛力，其中在醫(yī)學方面的作用最為突出，包括抗癌性、抗菌性、抗感染性等，靈菌紅素具有對癌細胞誘導凋亡作用而對正常人體細胞無毒副作用的特殊作用機制，此機制使其成為有潛力的抗癌藥物[4]。靈菌紅素在其他方面的作用也早有報道，如在紡織業(yè)可用做染料，在食品工業(yè)可用做食品著色劑，還可以治理海藻泛濫引起的赤潮現(xiàn)象以及在農(nóng)田中起到殺蟲劑的作用[2]。下面對靈菌紅素各方面的應用進行詳細闡述。

表1 靈菌紅素在各領域的應用Table 1 Application of prodigiosin in various fields

2.1 醫(yī)藥領域的應用

盡管目前靈菌紅素在產(chǎn)生菌的生長過程中的生理生化作用還沒有明確，但其具有的一系列的生物學活性，抗菌性、抗癌性、抗原生動物活性等已經(jīng)被大家熟知并且進行了大量研究，靈菌紅素具有靶細胞特異性，即只對特定細胞如癌細胞具有作用，而對正常細胞沒有作用，將該性質(zhì)應用于醫(yī)療行業(yè)對治療癌癥具有重大意義，然而，由于其主要產(chǎn)生菌粘質(zhì)沙雷氏菌的安全性問題，靈菌紅素還未進行大規(guī)模的商業(yè)生產(chǎn)應用[2]。下面分別對其各種生物學活性進行綜述。

2.1.1 抗菌性

據(jù)報道，靈菌紅素對大多數(shù)細菌具有抑制作用，靈菌紅素的抗菌作用機制目前還沒有明確的結(jié)論。對于由原生病原體引發(fā)的傳染病，一般采用抗生素等抗性藥物進行治療，如最早發(fā)現(xiàn)的抗生素青霉素[17]。然而，雖然含有抗生素的藥物可以降低發(fā)病率，但如果長期大量服用含有抗生素的藥物會讓體內(nèi)有害微生物的耐藥性變得更強，從而危害人體健康。所以，微生物產(chǎn)生的某些具有抗菌活性的次級代謝產(chǎn)物便成為有潛力的抗性藥物，其中靈菌紅素這種微生物次級代謝產(chǎn)物就被大量實驗證明具有抗菌性，包括抗原生動物、抗幼蟲等[18]，已有研究結(jié)果表明，靈菌紅素比現(xiàn)有抗生素對某些細菌具有更強的抑制作用[19]。GONDIL V S等[20]報道了由嗜線蟲沙雷氏菌（Serratia entomophila）RL2產(chǎn)生的靈菌紅素對單核細胞增多性李斯特菌屬（Listeria monocytogenes）、假單胞菌屬（Pseudoalteromonas）、耶爾森菌屬（Yersinia）和志賀氏菌屬（Shigella）等細菌均具有抗菌活性，而靈菌紅素生產(chǎn)菌可以在產(chǎn)生靈菌紅素的同時正常生存是由于其具有對靈菌紅素的抵抗性[21]。關(guān)于靈菌紅素的抑菌機理，有研究認為是通過影響細菌的生理生長過程從而對生長產(chǎn)生抑制作用[21]。YOU Z Y等[17]對靈菌紅素的抗菌機制進行了研究，推測靈菌紅素的抗菌機制包括細胞膜損傷、蛋白質(zhì)和核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）合成抑制、線粒體功能障礙、生物膜抑制、和酶活性抑制，其線粒體功能障礙表現(xiàn)為抑制細菌的正常呼吸進而影響細胞正常代謝。DANEVCˇICˇT等[22]也證實了靈菌紅素抑制蛋白質(zhì)及脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）的合成，在其實驗中對照組蛋白質(zhì)及DNA在增長，而經(jīng)靈菌紅素處理的大腸桿菌的蛋白質(zhì)以及DNA沒有變化，表明靈菌紅素可以抑制蛋白質(zhì)及DNA的合成。有研究發(fā)現(xiàn)，靈菌紅素對不同細菌有不同的抗菌作用方式。RAMINA M等[23]認為，靈菌紅素抗菌活性的作用機理是由于它能夠穿過細胞膜，并直接抑制靶酶，如控制細胞生長所必需的DNA旋轉(zhuǎn)酶和拓撲異構(gòu)酶IV，再進一步抑制細菌的生長。DANEVCˇICˇT等[21]在研究靈菌紅素對大腸桿菌（Escherichia coli）的作用機理時還發(fā)現(xiàn)，靈菌紅素對大腸桿菌的作用強度與濃度有關(guān)，當靈菌紅素濃度高于最低抑制濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）值，用其處理大腸桿菌，大腸桿菌細胞中細胞外膜發(fā)生破損，DNA幾乎沒有損傷，細胞質(zhì)膜也沒有解體，但細胞正常代謝受到嚴重影響，當稀釋靈菌紅素而降低其濃度時細菌細胞則會恢復生長。靈菌紅素的抗菌活性還可能與靈菌紅素和細菌細胞膜的相互作用有關(guān)，二者的相互作用會產(chǎn)生活性氧化物，從而導致細菌細胞死亡[24]。有報道認為，靈菌紅素對枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）的抗菌作用機制主要是自溶素的誘導，這種方式是一種有效的抗菌機制[22]。還有研究表明，沙雷氏菌（Serratia）產(chǎn)生的靈菌紅素是通過誘導細胞程序性死亡而對細菌起到抑制作用，包括使細菌內(nèi)的DNA片段化以及抑制細菌細胞中半胱氨酸蛋白酶的表達等[25]。

2.1.2 抗癌性

關(guān)于靈菌紅素的抗癌活性已經(jīng)進行了大量的實驗研究，有研究對60多個癌細胞株進行了靈菌紅素的抗癌活性實驗，并且已經(jīng)證實靈菌紅素對幾種人類癌細胞都具有細胞毒性，這種細胞毒性是特異性靶向作用，只誘導癌細胞凋亡[7，26]。MONTANER B等[27]之前的研究也證實了靈菌紅素只對癌細胞具有誘導凋亡作用，而對正常細胞無影響。靈菌紅素的抗癌特性表現(xiàn)為誘導腫瘤壞死和癌細胞凋亡[28]，如靈菌紅素可以有效抑制T淋巴細胞的增殖[2]。關(guān)于靈菌紅素的抗癌機制，主要是對癌細胞生長的重要途徑起干擾作用，并且這種作用與靈菌紅素的濃度有關(guān)。靈菌紅素的濃度對癌細胞的作用強度有很大的影響，在非細胞毒性濃度時，靈菌紅素可擾亂癌細胞內(nèi)的pH，從而抑制癌細胞的增長。在細胞毒性濃度時，靈菌紅素通過干擾其生長的重要途徑如原激活蛋白激酶信號通路以及線粒體細胞死亡通路等起到對癌細胞的誘導凋亡作用[2]。DAVIS J T[29]認為，靈菌紅素的抗癌機制是由于靈菌紅素作為陰離子載體可以與細胞膜上的陰離子結(jié)合，形成靈菌紅素陰離子復合物，該復合物可以抑制液泡三磷酸腺苷酶（vacuolar adenosine triphosphate，V-ATP），使癌細胞的細胞器pH升高，細胞質(zhì)基質(zhì)pH降低，癌細胞內(nèi)的環(huán)境變酸無法正常代謝而凋亡。KAVITHA R等[30]研究發(fā)現(xiàn)，靈菌紅素對HeLa細胞的半數(shù)抑制濃度（half inhibitory concentration，IC50）值為700 nmol/L，因此靈菌紅素對癌細胞的作用強度與濃度直接相關(guān)，靈菌紅素的濃度決定了是否對癌細胞起作用[30]。還有研究發(fā)現(xiàn)，靈菌素可以與癌細胞DNA結(jié)合，從而促進編碼細胞毒性的DNA氧化裂解，也就是靈菌紅素可以插入癌細胞的DNA促進DNA的氧化并且片段化，進而導致癌細胞的凋亡[7]。

2.1.3 抗原生動物活性

瘧疾是一種由原生動物瘧原蟲引發(fā)的傳染病，目前，已有可用于治療瘧疾的藥物有青蒿素、奎寧、氯喹、甲氟喹以及蒿甲醚等。據(jù)報道，靈菌紅素具有抗瘧疾的作用，眾多研究對其抗瘧疾作用進行了闡述。早期的一項研究表明，在40 mg/kg體質(zhì)量的靈菌紅素劑量下延長了感染瘧疾小鼠的平均壽命[31]。靈菌素的其他色素也對不同的瘧原蟲具有抗性作用，如十一烷基靈菌紅素、間環(huán)丙菌素等，在體內(nèi)研究中分別就靈菌紅素、十一烷基靈菌紅素、間環(huán)丙菌素以及鏈玉紅菌素B等對惡性瘧原蟲進行了抗感染性實驗，結(jié)果分別得到8 nmol/L、7.7 nmol/L、1.7 nmol/L、7.8 nmol/L的IC50值，從實驗結(jié)果得知，間環(huán)丙菌素的抗感染活性最強[32]。在該研究中還對被感染小鼠進行了口服給藥以評估其作用，在每種靈菌紅素類似物25 mg/（kg·d）的口服劑量下抑制了超過90%的寄生蟲血癥[32]。CLEMENTS T等[33]研究表明，靈菌紅素具有廣泛的抗原生動物活性，在其試驗中對痢疾內(nèi)變形蟲進行了研究，發(fā)現(xiàn)茴香霉素、靈菌紅素、甲磺酸鹽和醋酸硝唑四種化合物都對痢疾內(nèi)變形蟲有抗性，并且茴香霉素、靈菌紅素以及甲磺酸鹽三種抗性物質(zhì)具有廣泛的抗寄生蟲活性，包括對血吸蟲、毛滴蟲等寄生蟲也具有抗性。其他研究表明，靈菌紅素對其他多種原生動物也具有抗性，如裂殖吸蟲、克氏錐蟲和布氏錐蟲等，證明靈菌紅素具有多種抗原生動物活性[17]。

2.2 新能源領域的應用

最近，靈菌紅素的光敏性受到越來越多的關(guān)注，其光敏性可應用于太陽能電池中，代替其中的化學敏化劑來開發(fā)染料敏化太陽能電池（dye sensitized solar cell，DSSC）。研究表明，粘質(zhì)沙雷氏菌E11產(chǎn)生的靈菌紅素具有很強的光穩(wěn)定性，并且對其進行了光電性測試，靈菌紅素作為光敏劑的太陽能電池的開路電壓為560mV，電流密度為0.096mA/cm2，轉(zhuǎn)化效率為0.032%，是一種潛在的染料敏化太陽能電池敏化劑[34]。另一項研究也證實了靈菌紅素作為太陽能電池的光敏劑的潛能，其開路電壓為336.1 mV，最大短路電流為0.098 mV/cm2，靈菌紅素表現(xiàn)出與DSSC化學敏化劑相當?shù)墓怆娦阅躘13]。

2.3 環(huán)境領域的應用

大自然是人類賴以生存的環(huán)境，各種生物長時間的共生給大自然造成了各種污染以及破壞，環(huán)境污染是目前的一個全球性問題，因此，減緩環(huán)境污染及加強對環(huán)境的保護具有重要意義。殺蟲劑、重金屬及藻類造成的赤潮及水華等都對環(huán)境造成嚴重污染。有研究表明，由粘質(zhì)沙雷氏菌產(chǎn)生的靈菌紅素可以作為殺蟲劑使用[2]，病蟲害不僅導致農(nóng)作物的生長不良，還會破壞環(huán)境，用普通的殺蟲劑處理會帶給環(huán)境新的污染，用靈菌紅素這種生物制劑消除病蟲害不會給環(huán)境帶來殘留問題。還有報道稱，粘質(zhì)沙雷菌KMR-3 產(chǎn)的靈菌紅素具有抗重金屬作用，可以用來去除對環(huán)境造成重大污染的銅[15]。藻類造成的水華污染及赤潮現(xiàn)象對環(huán)境的影響不容樂觀，不僅直接影響生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定，還間接危害公眾健康，人類通過飲用水、游泳等活動也會受到藻類的危害[35]。據(jù)報道，由某些微生物產(chǎn)生的靈菌紅素可以用來除掉藻類[16，35-36]，F(xiàn)ENG J R等[16]對Hahellasp.KA22的全基因組進行了測序，研究其產(chǎn)生的靈菌紅素對赤潮藻的滅藻活性，發(fā)現(xiàn)該菌產(chǎn)生的靈菌紅素具有很強的滅藻性。ZHANG S等[36]的研究也證明了靈菌紅素的抗藻類作用，其結(jié)果表明，當靈菌紅素的質(zhì)量濃度為3 μg/mL時表現(xiàn)出最好的殺藻效果。在WEI J等[35]的實驗中首次提出靈菌紅素不僅具有滅藻功能，還對微囊藻產(chǎn)生的毒素有抑制作用，并同時提出靈菌紅素的殺藻機理可能是引起氧化應激反應，提高藻類細胞內(nèi)的丙二醛含量，改變超氧化物歧化酶的活性，抑制微囊藻毒素合酶的表達，進一步抑制微囊藻毒素的合成。ZHANG S等[36]還提出靈菌紅素可能是通過破壞藻類的細胞結(jié)構(gòu)，抑制基因及蛋白質(zhì)的表達，抑制藻類的光合作用及呼吸促使活性氧的積累，進而對藻類細胞造成氧化損傷甚至死亡。因此，微生物產(chǎn)生的靈菌紅素是很有潛力的除藻治理環(huán)境物質(zhì)。

2.4 化妝品領域的應用

人體皮膚長期暴露于太陽紫外線下會導致許多皮膚疾病，市場上也出現(xiàn)了各種各樣的防曬產(chǎn)品，然而，由于目前的防曬霜成分大部分還是合成的，有些會造成粉刺、灼燒等不良反應，因此，人們的需求轉(zhuǎn)向天然防曬物質(zhì)[37]。據(jù)報道，某些生存在高紫外線場所的細菌為防止自身免受外界環(huán)境的惡劣影響而產(chǎn)生的色素具有抗紫外線輻射作用，先前有研究從土壤中分離出來的產(chǎn)色素細菌，有些色素的防曬系數(shù)高達7～8[37]。由眾多細菌產(chǎn)生的靈菌紅素也具有很好的抗紫外作用，SURYAWANSHI R K等[38]向蘆薈葉和黃瓜的提取物以及防曬霜中添加靈菌紅素，與未添加靈菌紅素的三種原始物質(zhì)進行對比，研究靈菌紅素是否具有增加防曬效果的作用，結(jié)果表明，靈菌紅素的添加極大地提高了這3種物質(zhì)的防曬作用，其中靈菌紅素對防曬霜的防曬系數(shù)提高了10%以上。極強的抗菌活性增加了靈菌紅素作為化妝品中添加物質(zhì)的合理性[38]。因此，天然產(chǎn)物靈菌紅素可作為市面上的防曬霜的添加物質(zhì)來增強其防曬系數(shù)。

2.5 食品領域的應用

目前，食品著色劑所使用的色素絕大多數(shù)為合成色素，而合成色素由于其不安全性等隱患問題越來越不受到人們的歡迎。眾所周知，天然色素是環(huán)境友好型色素，某些色素不僅具有視覺吸引力，還有增強體內(nèi)益生菌活性，對人體起到保健作用，因此，將天然色素開發(fā)為食品級的安全色素具有重大意義[39]。靈菌紅素這種微生物天然色素顏色鮮艷、著色能力強、方便易得，將其開發(fā)成為食品級的著色劑將極大地推進食品行業(yè)的發(fā)展。作為著色劑，色素的穩(wěn)定性是關(guān)鍵，有研究就溫度、pH、光照等對靈菌紅素色素穩(wěn)定性的影響進行了測定，結(jié)果表明，隨著溫度、pH、光照強度的增強靈菌紅素的穩(wěn)定性降低，原因是各種影響因素的變化破壞了靈菌紅素的化學結(jié)構(gòu)，并且提出在0～20 ℃和pH 2～7范圍內(nèi)，靈菌紅素更適合作為食品著色劑，還闡明了靈菌紅素在食品中作為著色劑的應用可行性[40]。還有研究提出，可以通過包埋法將靈菌紅素包埋作為著色劑應用于食品中，以提高靈菌紅素的溶解性及穩(wěn)定性。在其研究中用卡拉膠和麥芽糊精作為包埋劑，用噴霧干燥法將靈菌紅素包埋，制成可溶于水的靈菌紅素微膠囊，該靈菌紅素微膠囊可以應用于酸奶、牛奶和碳酸飲料等[2，41]。

3 靈菌紅素的發(fā)酵生產(chǎn)

3.1 傳統(tǒng)的靈菌紅素發(fā)酵工藝

發(fā)酵法生產(chǎn)靈菌紅素的工藝優(yōu)化有培養(yǎng)基優(yōu)化及培養(yǎng)條件優(yōu)化，影響靈菌紅素產(chǎn)量的因素很多，所采用的方法以及所使用的營養(yǎng)物質(zhì)均會影響靈菌紅素的產(chǎn)量。到目前為止，文獻報道的靈菌紅素最大生產(chǎn)率為49.50 g/L，該實驗采用了甘露醇培養(yǎng)基、玉米漿培養(yǎng)基、玉米漿甘露醇培養(yǎng)基、木薯廢液培養(yǎng)基、木薯廢液甘露醇培養(yǎng)基以及LB葡萄糖培養(yǎng)基進行對比試驗，最終粘質(zhì)沙雷氏菌UCP 1549用60 g/L的木薯廢液和20 g/L的甘露醇（在pH 7和28 ℃條件下）培養(yǎng)48 h，發(fā)酵液中靈菌紅素產(chǎn)量最高為49.50 g/L，并推斷細菌生長增強和色素生成降低的最可能原因與碳源和培養(yǎng)基的最終pH值有關(guān)[9]。GIRI A V等[42]使用花生粉培養(yǎng)基作為粘質(zhì)沙雷氏菌的營養(yǎng)物質(zhì)來生產(chǎn)靈菌紅素，得到了高達38.75 g/L的靈菌紅素產(chǎn)率?；ㄉ叟囵B(yǎng)基中靈菌紅素含量較高是因為培養(yǎng)基中脂肪酸含量高，脂肪酸對細胞生長有促進作用，從而提高靈菌紅素產(chǎn)量。培養(yǎng)基中脂肪酸的存在會促進2-辛烯醛的產(chǎn)生[43]，而2-辛烯醛是MAP生物合成途徑的前體物質(zhì)[44]。倪亮[45]用中藥廢棄物生產(chǎn)靈菌紅素的實驗研究中發(fā)現(xiàn)，中藥廢棄物中的飽和脂肪酸含量與靈菌紅素的產(chǎn)量呈正相關(guān)關(guān)系，而不飽和脂肪酸含量與靈菌紅素產(chǎn)量呈負相關(guān)關(guān)系，飽和脂肪酸含量越高的中藥廢棄物粘質(zhì)沙雷氏菌L9對其利用率越高。該培養(yǎng)基在42 ℃時還可以產(chǎn)生靈菌紅素（一般靈菌紅素的生產(chǎn)溫度為28 ℃），可能是由于溫度對不同培養(yǎng)基中靈菌紅素的產(chǎn)生影響不同[43]。還有研究發(fā)現(xiàn)，向花生粉培養(yǎng)基中添加葡萄糖或麥芽糖時反而會使靈菌紅素較少，可能原因是分解代謝抑制作用[42]，所以用脂肪酸作為碳源有利于靈菌紅素的產(chǎn)生。CHEN Q L等[46]分別以大豆蛋白胨、牛肉膏和花生粉為粘質(zhì)沙雷氏菌FZSF02發(fā)酵生產(chǎn)靈菌紅素的唯一氮源時，花生粉作為氮源時靈菌紅素產(chǎn)量最高約3.76 g/L，表明花生粉為最佳氮源，并且，當牛肉膏和花生粉共同作為氮源時靈菌紅素產(chǎn)量比二者分別作為單一氮源時高了很多。在該實驗中也發(fā)現(xiàn)，添加橄欖油作為促進產(chǎn)生靈菌紅素的油脂，獲得了較好的靈菌紅素含量，約為11.40 g/L，比不加橄欖油時提高很多[46]。GONDIL V S等[20]用10 g/L酵母提取物、蛋白胨、色氨酸、牛肉提取物、甘氨酸和硫酸銨等分別作為嗜線蟲沙雷氏菌RL2產(chǎn)靈菌紅素的氮源，當?shù)礊榻湍柑崛∥飼r靈菌紅素的產(chǎn)量相對最高，為0.46 g/L，并發(fā)現(xiàn)金屬離子可以促進靈菌紅素的產(chǎn)生。CHEN W C等[47]使用淀粉和蛋白胨作為粘質(zhì)沙雷氏菌C3的能源物質(zhì)，并將淀粉與蛋白胨比率定為6∶4，靈菌紅素的產(chǎn)量從2.30 g/L增加至6.70 g/L。在Fe2+和Mn2+的促進作用以及30 g/L海藻酸鈣球體的固定作用下，靈菌紅素產(chǎn)量分別提高到7.07 g/L和15.60 g/L。TAO J L等[48]利用分批給料的方法來增加粘質(zhì)沙雷氏菌突變菌株B6的靈菌紅素產(chǎn)量，葡萄糖有利于菌體的生長，所以先供給葡萄糖促進菌體的生長，當細胞濃度達到最大，停止葡萄糖的添加，當葡萄糖耗盡后再供給甘油以利于靈菌紅素的產(chǎn)生。30 h內(nèi)其產(chǎn)量為0.58 g/L，很大程度提高了靈菌紅素的產(chǎn)量。SURYAWANSHI R K等[19]以馬鈴薯粉以及酪蛋白水解液為營養(yǎng)物質(zhì)使粘質(zhì)沙雷氏菌產(chǎn)生靈菌紅素，其最大產(chǎn)量為4.80 g/L。還有研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)糊精可以促進粘質(zhì)沙雷氏菌產(chǎn)生靈菌紅素[49]。

3.2 利用工業(yè)副產(chǎn)物生產(chǎn)靈菌紅素

最近基于環(huán)保的利用工業(yè)副產(chǎn)物來生產(chǎn)靈菌紅素掀起了風潮，如魷魚骨粉、螃蟹廢棄物、工業(yè)廢蛋白、中藥廢棄物以及造紙污泥等含有營養(yǎng)物質(zhì)的副產(chǎn)物等。利用工業(yè)副產(chǎn)物生產(chǎn)具有優(yōu)良性質(zhì)的靈菌紅素的同時還可以減輕工業(yè)副產(chǎn)物帶來的環(huán)境及資源問題，不僅對靈菌紅素的生產(chǎn)具有促進作用，還提高了資源的有效利用率。BHAGWAT A等[50]利用提取油脂剩余的殘渣—花生油籽餅、芝麻油籽餅等作為脂肪酸底物供粘質(zhì)沙雷氏菌生產(chǎn)靈菌紅素，篩選獲得高產(chǎn)量靈菌紅素的含油底物，結(jié)果以花生油籽餅作為底物得到更高的靈菌紅素產(chǎn)量，經(jīng)優(yōu)化后得到的培養(yǎng)條件為40 g/L花生油籽餅、20 g/L蔗糖、pH 7.5，28 ℃培養(yǎng)72 h后靈菌紅素產(chǎn)量達到0.90 g/L。在WANG S L等[51]的研究中，粘質(zhì)沙雷氏菌TKU011只利用海洋廢棄物——魷魚骨粉作為單一的碳氮源生產(chǎn)靈菌紅素，最后得出，在僅含有1.5%的魷魚骨粉的培養(yǎng)基中，靈菌紅素的產(chǎn)量為0.98 g/L，其培養(yǎng)條件為30 ℃培養(yǎng)1 d，25 ℃培養(yǎng)2 d，發(fā)現(xiàn)與避光條件相比，光照條件下得到的靈菌紅素產(chǎn)量更高。在其另一項研究中，粘質(zhì)沙雷氏菌TKU011利用海洋甲殼素作為底物生產(chǎn)靈菌紅素，最終的優(yōu)化條件為10g/Lα-甲殼素、6g/L酪蛋白、0.5 g/L K2HPO4和1 g/L CaSO4、初始pH值5.65～6.15，最終的靈菌紅素產(chǎn)量為4.62 g/L[52]。他們還對之前的魷魚骨粉實驗進行了改進，在對比螃蟹殼、蝦殼以及魷魚骨粉三種含甲殼素和蛋白質(zhì)的海洋副產(chǎn)物對生產(chǎn)靈菌紅素的作用后，發(fā)現(xiàn)魷魚骨粉作為碳氮源時靈菌紅素的產(chǎn)量最高，還發(fā)現(xiàn)不同的甲殼素/蛋白質(zhì)比率對靈菌紅素的產(chǎn)量有明顯的影響，當甲殼素/蛋白質(zhì)的比率控制在3/7～4/6的范圍內(nèi)時靈菌紅素產(chǎn)量較好，因此，魷魚骨粉中的甲殼素/蛋白質(zhì)的比率接近4/6時對靈菌紅素的產(chǎn)生具有明顯的促進作用。該實驗在17.5 g/L魷魚骨粉、0.3 g/L K2HPO4和0.5 g/L MgSO4的培養(yǎng)基中25 ℃避光培養(yǎng)12 h，得到3.45 g/L的靈菌紅素產(chǎn)量[53]，又以脫礦蟹殼粉為底物生產(chǎn)靈菌紅素，最終在16 g/L的C/N源（蛋白質(zhì)/脫礦蟹殼粉=3/7）、0.2 g/L的（NH4）2SO4、1 g/L的K2HPO4培養(yǎng)基，27 ℃培養(yǎng)8 h，靈菌紅素產(chǎn)量為5.10 g/L[54]。MAJUMDAR S等[55]將造紙產(chǎn)生的廢棄物作為固態(tài)培養(yǎng)基供粘質(zhì)沙雷氏菌利用，得到0.5 g/L的靈菌紅素。工業(yè)廢蛋白是工業(yè)生產(chǎn)中常見的副產(chǎn)物，用工廢蛋白代替蛋白胨生產(chǎn)靈菌紅素很大程度上提高了靈菌紅素的產(chǎn)量（5.91 g/L），還降低了靈菌紅素的生產(chǎn)成本（相比代替前降低44%），在此基礎上可以極大的推進靈菌紅素的發(fā)展進程[56]。倪亮[45]探究了苦參種子油、僵蠶藥渣、杏仁兒藥渣等中藥廢棄物對靈菌紅素生產(chǎn)的促進作用，得出全中藥廢棄物培養(yǎng)基（僵蠶藥渣22.00 g/L、杏仁藥渣油14.13 g/L和硫酸鎂0.35 g/L）比苦參種子油培養(yǎng)基（苦參種子油12.93 g/L、牛肉膏9.47 g/L和氯化鈣0.30 g/L）的靈菌紅素產(chǎn)量提高了8.7倍，前者為2.76 g/L，后者為0.32 g/L。靈菌紅素的產(chǎn)量及生產(chǎn)菌株總結(jié)見表2。

表2 不同條件下靈菌紅素的產(chǎn)量Table 2 Yield of prodigiosin under different conditions

4 靈菌紅素的提取純化

基于靈菌紅素不溶于水易溶于有機溶劑的性質(zhì)，尋找安全高效的提取純化方法至關(guān)重要。截至目前為止，文獻報道的提取純化靈菌紅素的方法包括溶劑萃取法、薄層色譜法、柱層析色譜法及高效液相萃取法等，有文獻報道用制備型高效液相儀制備高純度靈菌紅素[57]。通常靈菌紅素的提取純化流程如下：發(fā)酵液經(jīng)離心得到的含色素沉淀用酸性乙醇或者甲醇充分溶解，色素層上清液通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮去除有機溶劑，得到色素粗提物。利用薄層色譜法篩選適合用于柱層析色譜的溶劑，以純化靈菌紅素粗提物（直接用薄層色譜法也可得到少量純化的靈菌紅素），得到純化的靈菌紅素[9，20，42]。CHEN Q L等[46]將50 mL發(fā)酵液中的含色素沉淀用50 mL酸化甲醇（4 mL 1 mol/L HCl/96 mL甲醇）溶解，靜置1 h后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)將上清液濃縮的色素粗提物；去除含色素沉淀的剩余發(fā)酵液與等量的乙酸乙酯充分混合，分層后的乙酸乙酯相旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到色素粗提物。用于純化粗提物的硅膠柱先用石油醚充分洗脫，色素粗提物用乙醚∶乙酸乙酯（1∶1，V/V）的混合溶液溶解后注入硅膠柱上層，然后用石油醚洗脫色素層，收集洗脫出來的含色素溶劑，此部分溶劑經(jīng)過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到純化的靈菌紅素。有研究表明乙醇作為提取靈菌紅素的有機溶劑相較于其他溶劑具有顯著優(yōu)勢，靈菌紅素的提取率明顯較高，可能原因是乙醇通過非共價相互作用與色素發(fā)生反應，從而有助于色素迅速擴散到溶液中[58]。乙醇較其他有機溶劑具有毒性小、污染小、更容易回收利用等優(yōu)勢，因此更適合作為提取靈菌紅素的有機溶劑。

5 靈菌紅素的合成途徑

靈菌紅素的合成方法主要有化學合成和生物合成，化學合成即運用化學方法人工合成靈菌紅素，生物合成方法即利用微生物進行靈菌紅素的合成。目前，生物合成方法研究的較多[6]。靈菌紅素的生物合成過程中受眾多因素的影響，有研究表明，很多微生物的次級代謝產(chǎn)物的生成都會受到葡萄糖的抑制，即在富含葡萄糖的培養(yǎng)基中生長受到抑制，也就是所說的葡萄糖效應，靈菌紅素也不例外[59]。盡管葡萄糖有利于粘質(zhì)沙雷氏菌生長，卻對靈菌紅素的合成具有抑制作用（1949年發(fā)現(xiàn)D-葡萄糖可以抑制靈菌紅素的合成）[60]。而且這種抑制作用只與pH有關(guān)，沒有環(huán)腺苷酸（cAMP）的參與，有多個基因參與了葡萄糖對靈菌紅素的抑制作用[11]。FENDER J E等[11]通過實驗得出了D-葡萄糖通過影響微生物的代謝進而引起pH值降低，通過轉(zhuǎn)錄控制靈菌紅素生物合成操縱子，共同抑制靈菌紅素的產(chǎn)生。因此，未來可以從微生物體內(nèi)分步合成途徑上進一步分析各種影響因素的調(diào)控機制。下面對靈菌紅素的合成路徑進行闡述。

靈菌紅素在粘質(zhì)沙雷氏菌體內(nèi)的生物合成是由兩條分支途徑共同完成的，MAP合成途徑和MBC合成途徑，最后MAP和MBC經(jīng)過縮合反應形成靈菌紅素。不同種類的微生物控制合成靈菌紅素的基因簇不同，鏈霉菌、河氏菌屬、囊狀假單胞菌（Pseudoalteromonas tunicate）、灰綠鏈霉菌（Streptomyces griseoviridis）、沙雷氏菌中控制靈菌紅素合成的基因簇分別為red、hap、tam、rph、pig基因簇[8]。粘質(zhì)沙雷氏菌中靈菌紅素的生物合成途徑中的pig基因簇包括pigD、pigE、pigB、pigA、pigF、pigG、pigH、pigI、pigK、pigJ、pigL、pigM和pigN、pigC共14個基因，對應基因編碼的酶分別命名為PigD、PigE、PigB、PigA、PigF、PigG、PigH、PigI、PigK、PigJ、PigL、PigM和PigN、PigC。在眾多基因中最終催化MAP和MBC的縮合反應的基因pigC被稱為關(guān)鍵基因[4]。14種基因及對應的酶在靈菌紅素合成途徑中的作用見表3。靈菌紅素在粘質(zhì)沙雷氏菌中的合成途徑[4，6，8]如下：

表3 靈菌紅素合成過程中各個基因的作用[4,64]Table 3 Role of various genes in the synthesis of prodigiosin[4,64]

5.1 MAP合成途徑

MAP途徑中主要有pigD、pigE和pigB三個基因參與。該合成途徑從有機物代謝的中間產(chǎn)物2-辛烯酸和丙酮酸開始，2-辛烯酸和丙酮酸在PigD和焦磷酸硫胺素（thiamine pyrophosphate，TPP）的共同催化作用下釋放CO2并生成3-乙酰膽堿[10]，3-乙酰膽堿上的氨基在PigE的催化作用下與乙醛反應生成氨基酮，然后通過氨基酮自動環(huán)化生成的環(huán)亞胺在PigB的作用下氧化脫氫生成MAP[61]。

5.2 MBC合成途徑

MBC途徑是大多數(shù)微生物中靈菌紅素合成的共同途徑，該途徑最終產(chǎn)物MBC的合成經(jīng)由10個基因（pigA、pigF、pigG、pigH、pigI、pigK、pigJ、pigL、pigM和pigN）的共同作用而完成[10]。其中pigK編碼PigK酶，并不直接參與靈菌紅素的合成，但可能在靈菌紅素的合成過程中起到協(xié)助其他基因的輔助作用，是整個合成途徑中不可或缺的一部分[10]。該途徑又分為兩條支路，一條是丙二酰輔酶A（malonyl coenzyme A，Malonyl-CoA）與PigH反應生成丙二?；?S-PigH。另一條是從L-脯氨酸開始，據(jù)報道，PigL起到激活PigG的作用，然后，激活的PigG與L-脯氨酸在ATP供能的條件下結(jié)合，生成L-脯氨酰-S-PigG[1]。ZHANG F等[62]對PigG的晶體結(jié)構(gòu)及在合成途徑中的作用進行了研究，發(fā)現(xiàn)PigG的缺失會抑制靈菌紅素的產(chǎn)生，證實了PigG及PigG絲氨酸殘基對靈菌紅素合成途徑的重要性。L-脯氨酰-S-PigG在FAD供氫以及PigA的催化下發(fā)生氧化脫氫反應，生成吡咯-2-羧基-S-PigG，吡咯-2-羧基-S-PigG的吡咯-2-羧基發(fā)生轉(zhuǎn)移生成吡咯-2-羧基-S-PigJ[61]。兩條路徑的產(chǎn)物丙二?；?S-PigH與吡咯-2-羧基-S-PigJ進一步反應生成吡咯-β-酮硫酯，再依次經(jīng)過PigH、PigM的作用發(fā)生脫羧及氧化得到中間產(chǎn)物4-羥基-2,2'-二吡咯-5-甲醇（4-hydroxy-2,2'-bipyrrole-5-methanol，HBM）以及4-羥基-2,2'-雙吡咯-5-甲醛（4-hydroxy-2,2'-bipyrrole-5-carbaldehyde，HBC），最后，HBC在PigF（氧甲基轉(zhuǎn)移酶）、PigN（氧化還原酶）共同作用下進行甲基化，生成終產(chǎn)物4-甲氧基-2,2'-二吡咯-5-甲醛（MBC）[63]。

5.3 MAP與MBC的縮合反應

兩個前體物質(zhì)MAP與MBC的縮合反應是靈菌紅素合成途徑的最后一步，也是最關(guān)鍵一步，因此，催化該步驟的酶PigC被稱為靈菌紅素合成的關(guān)鍵酶。前人對該反應進行了反應機理的研究，PigC的兩個末端序列分別與ATP的結(jié)合域和轉(zhuǎn)移域序列呈現(xiàn)相似性[10]，MBC與催化該反應的酶PigC的催化中心結(jié)合，ATP與PigC的ATP結(jié)合域結(jié)合，PigC奪取ATP的磷酸基團進攻MBC的醛基使其活化，然后，進入ATP催化中心的MAP與MBC進行縮合，生成靈菌紅素[61]。

6 利用基因重組技術(shù)生產(chǎn)靈菌紅素的發(fā)酵工藝

微生物體內(nèi)靈菌紅素的合成受到多種基因及復雜蛋白的調(diào)控，導致其產(chǎn)量比較低，加上靈菌紅素對粘質(zhì)沙雷氏菌具有細胞毒性，若對其進行大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)靈菌紅素存在大量問題[65]。因此，近年來基因重組技術(shù)發(fā)展起來，即利用寄宿細胞進行基因重組來大規(guī)模生產(chǎn)靈菌紅素，不僅經(jīng)濟安全而且更有效地合成靈菌紅素。此生物學方法是將基因從原宿主細胞通過相關(guān)途徑轉(zhuǎn)移到寄宿細胞中繼續(xù)進行表達，從DNA分子水平進行蛋白質(zhì)和代謝物的大規(guī)模生產(chǎn)技術(shù)[4]。生物學方法已經(jīng)成功地應用于很多有利于治療疾病的生物大分子的合成，如青蒿素和萜類等物質(zhì)[4]。靈菌紅素是受眾多基因的控制而合成的，基因重組可以通過提高靈菌紅素合成過程中關(guān)鍵酶的活性及量，從而進一步提高靈菌紅素的產(chǎn)量。為提高靈菌紅素產(chǎn)量，在宿主中提高合成靈菌紅素生物合成過程中需要的關(guān)鍵酶的表達是很關(guān)鍵的。YOU ZY等[66]優(yōu)化了靈菌紅素合成途徑中關(guān)鍵酶PigC在大腸桿菌中的表達，他們通過優(yōu)化誘導策略和培養(yǎng)基組分，提高了大腸桿菌產(chǎn)靈菌紅素合成酶PigC的產(chǎn)率。在他們的試驗中證明，自誘導是PigC生產(chǎn)的最佳方式，其自誘導參數(shù)為葡萄糖0.73 g/L、酵母提取物13.17 g/L和乳糖5.86 g/L，乳糖同時作為誘導劑和碳源，甘油同時作為碳源和能量來源，很大程度提高了PigC活性，達到179.3 U/mL。將粘質(zhì)沙雷氏菌的pig基因群插入到假單胞菌KT2440中，得到（14±1）mg/g細胞干質(zhì)量的靈菌紅素產(chǎn)量[67]。LIU P P等[68]誘導培養(yǎng)了一株高產(chǎn)靈菌紅素的天藍色鏈霉菌，其最高靈菌紅素產(chǎn)量為96.8 mg/g細胞干質(zhì)量，是野生型菌株M145靈菌紅素產(chǎn)量的12倍。還有研究在大腸桿菌中用生物學合成方法生產(chǎn)了5種沙雷氏菌ATCC 39006生物合成靈菌紅素所需的酶（分別為PigA、PigG、PigH、PigI、PigJ）來深入研究靈菌紅素合成機制[1]。KLEIN A S等[69]利用靈菌紅素合成過程中PigC對MAP和MBC及兩者的類似物的特異性識別特點，改變或者代替MAP及MBC的某些結(jié)構(gòu)，觀察PigC是否能夠繼續(xù)合成靈菌紅素或者其衍生物，以確定PigC的底物特異性，利用菌株P(guān)seudomonas putidaKT2440合成了13種不同的具有很強的調(diào)節(jié)自噬作用的靈菌紅素衍生物，進一步提高了靈菌紅素類色素的應用可能性。因此，利用基因工程技術(shù)敲除或者改變抑制靈菌紅素產(chǎn)生的基因，優(yōu)化促進靈菌紅素合成的基因，對靈菌紅素的深入研究具有重大意義。

7 展望

靈菌紅素在醫(yī)學領域、食品領域、環(huán)境領域、化妝品領域以及新能源領域等各方面的應用潛能，推動著從實際應用為目的出發(fā)對靈菌紅素的深入研究。而靈菌紅素在實際應用首先要確保其應用的安全性，特別是食品和醫(yī)學方面安全性是重中之重。靈菌紅素作為食品著色劑開發(fā)還要考慮到色素的脫臭、純化等關(guān)鍵問題，以保證不影響食品本來的風味。靈菌紅素在其他方面的開發(fā)應用也應該考慮到相應的關(guān)鍵影響因素。目前，對于靈菌紅素各方面的研究大多數(shù)還處在實驗室研究階段，其合成產(chǎn)量較低，實際應用還不夠深入透徹，因此，還有很大的挖掘空間。未來可從兩方面來提高靈菌紅素的產(chǎn)量，一是結(jié)合傳統(tǒng)的靈菌紅素培養(yǎng)條件的優(yōu)化策略以及生物學方法來生產(chǎn)靈菌紅素，二是著重探究靈菌紅素的提取純化方法，以便為靈菌紅素在更多方面的應用研究提供足夠的原料，推動各行業(yè)的發(fā)展進步。