鈦酸鍶微/納米顆粒的體外炎癥反應(yīng)

劉文濤，吳宏，周吉祥

鈦酸鍶微/納米顆粒的體外炎癥反應(yīng)

劉文濤1，吳宏1，周吉祥2

(1. 中南大學 粉末冶金國家重點實驗室，長沙 410083；2. 中南大學 湘雅醫(yī)院，長沙 410083)

采用細胞與材料直接作用的方式研究鈦酸鍶微/納米顆粒刺激RAW 264.7細胞產(chǎn)生的生物學反應(yīng)。利用掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope, SEM)、激光粒度儀、X射線衍射儀及比表面積測定儀表征材料的理化性質(zhì)。采用CCK-8檢測和活/死細胞染色法評估鈦酸鍶微/納米顆粒對RAW 264.7細胞增殖活性的影響；采用SEM觀察細胞的形態(tài)變化；采用RT-qPCR技術(shù)檢測在鈦酸鍶微/納米顆粒刺激作用下RAW 264.7細胞炎性細胞因子基因的表達；采用免疫熒光染色技術(shù)檢測RAW 264.7細胞誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)的表達。結(jié)果表明，微米和納米鈦酸鍶顆粒成分組成均一，皆為不規(guī)則形狀，微米鈦酸鍶顆粒平均粒徑為1 085.0 nm，比表面積為1.72 m2/g，納米鈦酸鍶顆粒平均粒徑為505.2 nm，比表面積為2.94 m2/g。微米和納米鈦酸鍶顆粒對RAW 264.7細胞第24 h、72 h活性并無影響。在微/納米鈦酸鍶顆粒的刺激下RAW 264.7細胞向多邊形發(fā)展，并具有更大的貼附面積。微米鈦酸鍶顆粒刺激RAW 264.7細胞高表達iNOS、白細胞分化抗原(cluster of differentiation, CD)86、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)-α和白細胞介素(Interleukin，IL)-6基因。納米鈦酸鍶顆粒刺激RAW 264.7細胞高表達iNOS和TNF-α基因，而IL-10基因的表達顯著下調(diào)。微米和納米均刺激RAW 264.7細胞高表達iNOS，誘導RAW 264.7細胞向M1表型極化，產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，并且微米鈦酸鍶顆粒誘導的炎癥反應(yīng)更顯著。

鈦酸鍶；微/納米顆粒；RAW 264.7 細胞；細胞因子；炎癥反應(yīng)

隨著人口老齡化進程的加速，關(guān)節(jié)炎、脊椎病和骨腫瘤等骨缺損疾病在全世界的發(fā)病率逐年上漲。人工關(guān)節(jié)置換術(shù)對骨關(guān)節(jié)炎和類風濕性關(guān)節(jié)炎等終末期關(guān)節(jié)炎具有有效的手術(shù)干預作用[1?2]。但是，研究表明，人工關(guān)節(jié)置換的失敗率在植入后10～20年后會增 加[2?4]。其原因是骨溶解引起的人工關(guān)節(jié)松弛[5]。骨溶解與骨植入物材料在服役過程中產(chǎn)生的磨損碎屑在病變部位產(chǎn)生長期的慢性炎癥反應(yīng)，導致骨溶解的發(fā) 生[6?7]。BLOEBAUM等[8]通過對覆蓋有羥基磷灰石涂層的骨植入物相關(guān)回收組織的分析表明，羥基磷灰石磨損碎片可有效刺激免疫細胞并釋放多種細胞因子。這些細胞因子可能會導致肉芽腫性炎癥，以及骨骼重塑紊亂引發(fā)骨溶解過程[8]。骨植入物在服役過程中表面的涂層磨損、剝落產(chǎn)生的顆?？赡軙纬深愃频倪^程，誘導局部區(qū)域產(chǎn)生不良的炎癥反應(yīng)[9?10]。這可能對骨?植入物界面的完整性產(chǎn)生不利影響。

骨溶解的機制主要涉及巨噬細胞，巨噬細胞是一種吞噬性白細胞。吞噬磨損碎片后，巨噬細胞釋放促炎性細胞因子白細胞介素(interleukin，IL)-1β、IL-6和腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α等，導致破骨細胞的激活[11?12]。被激活的破骨細胞繼而引起骨溶解[2?13]。因此，巨噬細胞對吞噬物的吞噬作用在骨溶解中起著重要的作用。INGRAM等[14]報道了大小為0.1～10 μm的聚乙烯顆粒激活了巨噬細胞的炎癥反應(yīng)。相類似的，ABU-AMER等[15]報告了大小為0.2～10 μm的聚甲基丙烯酸甲酯顆粒會影響巨噬細胞炎性細胞因子的表達。而KOSEKI等[16]和SABOKBAR 等[17]研究發(fā)現(xiàn)，小于1 μm的顆粒也會引起這些免疫細胞的生物學反應(yīng)。

在目前的研究中，已證實顆粒粒徑對巨噬細胞的生物學反應(yīng)具有重要的影響。然而，化學成分同樣是影響巨噬細胞生物學反應(yīng)的重要因素之一[15, 17]。Sr2+可以促進干細胞的成骨分化以及抑制炎癥反應(yīng)[18?20]。JIANG等[21]通過磁控濺射技術(shù)在噴丸酸蝕處理的純鈦表面構(gòu)建了鈦酸鍶涂層，顯著提高了MC3T3-E1細胞的增殖分化活性。而目前關(guān)于具有不同粒徑、表面積等參數(shù)的鈦酸鍶顆粒對巨噬細胞生物學反應(yīng)的報道較少。因此，有必要研究不同粒徑的鈦酸鍶顆粒對巨噬細胞行為的影響機制，以助抑制不良的炎癥反應(yīng)。

在本工作中，通過研究巨噬細胞的活性、形態(tài)變化以及促炎性細胞因子基因的表達，研究了兩種不同粒徑和比表面積的鈦酸鍶顆粒對巨噬細胞生物學反應(yīng)的影響。

1 實驗

在細胞實驗部分，為了確定培養(yǎng)基中添加的粉末質(zhì)量，本工作參考了GONZáLEZ等[22]的研究工作，他們證實了聚甲基丙烯酸甲酯顆粒的表面積會影響單核細胞的活性。SHANBHAG等[23]證明了單核細胞對培養(yǎng)基中材料暴露出來的表面積極其敏感，并且表面積比(SAR=細胞表面積/材料表面積)=10時，細胞未被激活，在SAR = 0.1時，細胞被高度激活，當SAR = 1時細胞分泌了最多的細胞因子。因此，本工作中選擇SAR=1。其中，細胞被假定為球形，1×106個細胞的總表面積為1.52 ×103mm2。

1.1 材料

所使用的納米鈦酸鍶(99.5% metalsbasis，<100 nm)和微米鈦酸鍶(99.5% metalsbasis，5 μm)均購自上海麥克林生化科技有限公司，將納米鈦酸鍶命名為NS，微米鈦酸鍶命名為MS。

1.2 理化性能測試

采用配備有能量色散X射線光譜儀(Energy Dispersive X-ray Spectroscopy，EDS)的掃描電子顯微鏡(Scanning Electron Microscope，SEM；Quanta 250 FEG，F(xiàn)EI，捷克)觀察樣品形貌。通過激光粒度儀測量樣品粒徑分布，通過比表面儀(Quadrasorb SI-3MP，康塔公司，美國)根據(jù)BET法測定樣品比表面積。通過X射線衍射儀(X-ray Diffraction，XRD；Advance D8，Bruker，德國)檢測樣品物相組成。

1.3 細胞培養(yǎng)

選擇小鼠單核巨噬細胞白血病細胞(RAW 264.7細胞)作為巨噬細胞的模型。RAW 264.7細胞使用DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，該培養(yǎng)基由89%HG-DMEM培養(yǎng)基(Gibco，美國)、10%胎牛血清(Fetal Bovine Serum，F(xiàn)BS；Gibco，美國)和1%青霉素?鏈霉素(Penicillin-Streptomycin Solution，PS；Gibco，美國)組成，將培養(yǎng)的細胞置于37 ℃、5%CO2和95%濕度的培養(yǎng)箱中，每48 h更換一次培養(yǎng)基。

1.4 巨噬細胞活性

將RAW 264.7細胞按每孔內(nèi)30 000個種植在48孔板中，每孔加入0.5 mL含有NS/MS的DMEM完全培養(yǎng)基對細胞進行培養(yǎng)，培養(yǎng)基中NS/MS的含量按照SAR=1的原則添加，每48 h更換一次培養(yǎng)基。使用細胞計數(shù)試劑盒-8(Cell Counting Kit-8，CCK-8；Dojindo，日本)來定量的測定巨噬細胞的增殖活性。培養(yǎng)24 h和72 h后，將0.27 mLDMEM完全培養(yǎng)基與0.03 mLCCK-8混合，并添加到每個孔中孵育30 min。隨后，從每個孔中吸取0.1 mL孵育溶液轉(zhuǎn)移到96孔板中。用多模式讀板儀(thermo fisher scientific，美國)在450 nm下測量光密度(optical density，OD)值。采用活死染色法定性檢測細胞活性。活死染色法步驟如下：吸棄孔板中的舊培養(yǎng)基，并用磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer solution，PBS；Gibco，美國)洗滌兩次，每次1～2 min。隨后，在每孔中加入0.3 mL使用PBS溶液配制的鈣黃綠素-AM(2 mg/L)(Dojindo，日本)和典化丙啶(3 mg/L)(Dojindo，日本)混合溶液，于閉光條件下37 ℃孵育15 min，吸棄廢液然后使用PBS溶液洗去殘留的染色液，使用倒置熒光顯微鏡拍照(DSY-L140，北京長恒榮創(chuàng)科技有限公司，中國)。

1.5 巨噬細胞形貌

將RAW 264.7細胞按每孔內(nèi)300 000個種植在放有硅片的6孔板中，每孔加入2.5 mL含有NS/MS的DMEM完全培養(yǎng)基對細胞進行培養(yǎng)，培養(yǎng)基中NS/ MS的含量按照SAR=1的原則添加，每48 h更換一次培養(yǎng)基。培養(yǎng)48 h后，吸棄舊培養(yǎng)基，并用PBS洗滌兩次，每次5 min。然后將0.3 mL的2.5%戊二醛溶液(Sigma，美國)添加到每個孔中，并置于4 ℃的冰箱中保持3 h。吸棄戊二醛溶液，然后用PBS洗滌兩次，每次5 min。用PBS和乙醇(濃度梯度為30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%)的混合溶液以及乙醇和叔丁醇(濃度梯度為25%、50%、75%、100%)的混合溶液使細胞脫水，每種溶液浸泡5 min。將脫水后的樣品置于50 ℃真空干燥箱中干燥。使用SEM拍攝細胞的貼附形態(tài)。

1.6 巨噬細胞基因表達

將RAW 264.7細胞按每孔內(nèi)300 000個種植在6孔板中，每孔加入2.5 mL含有NS/MS的DMEM完全培養(yǎng)基對細胞進行培養(yǎng)，培養(yǎng)基中NS/MS的含量按照SAR=1的原則添加，每48 h更換一次培養(yǎng)基。培養(yǎng)48 h后，通過向每個孔中加入1 mL MZ緩沖液(天根，中國)裂解細胞。隨后，按照試劑說明書的規(guī)程，使用miRNA分離試劑盒(天根，中國)提取總RNA，并通過NanoDrop分光光度計(NanoDrop2000，Thermo Fisher Scientific，美國)對RNA的含量進行定量檢測。使用QuantScript RT試劑盒(天根，中國)將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR；CFX96 Touch，Bio-Rad，美國)測量被SYBR Green Supermix (Bio-Rad，美國)標記的相關(guān)基因的表達水平。實驗中所使用的各引物基因序列如表1所列。

1.7 免疫熒光染色

選擇誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)作為巨噬細胞M1表型的表面標記物，使用免疫熒光染色技術(shù)對iNOS進行標記以進一步確定RAW 264.7細胞的表型。將細胞用4%多聚甲醛固定30 min，用1%Triton X-100溶液處理5 min，然后用10%山羊血清封閉2 h。隨后使用iNOS一抗(1：500 PBS，Abcam，美國)將細胞在37 ℃孵育12 h，然后使用包含Alexa Fluor 594(1:200 PBS，Abcam，美國)的二抗溶液孵育30min。細胞核用2 μg/mL的4′,6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽(C16H17Cl2N5，DPAI；Sigma，美國)溶液染色30 s。使用倒置熒光顯微鏡記錄熒光圖像。

表1 引物的基因序列

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

從至少3次平行實驗中得出結(jié)果，并表示為平均值±標準差。使用最小顯著差異(least significant difference，LSD)方法對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。*p、#p< 0.05和**p、##p< 0.01被認為具有顯著性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 鈦酸鍶微/納米顆粒的理化性質(zhì)

如圖1所示，NS和MS均為無規(guī)則顆粒狀，其中NS的顆粒平均尺寸約為0.436 3 μm，MS的顆粒平均尺寸約為1.745 5 μm。通過EDS分析，在NS和MS上均探測到Ti、Sr、O、C四種元素，兩組中Ti跟Sr的比例均接近1:1，表明試樣較純。而C元素的存在可能是由于樣品較小導致導電膠中的C被檢測到，這可能也是NS上檢測到更多C含量的原因。

圖2所示為通過激光粒度分析NS和MS的粒徑分布。由圖可知，可見NS的粒徑在300～800 nm之間，而MS的粒徑在600～2 100 nm之間，這與SEM所觀察的結(jié)果一致。

通過BET法測定了NS和MS的比表面積，NS的比表面積為2.94 m2/g，MS的比表面積為1.72 m2/g。NS和MS的形狀、粒徑分布、平均粒徑和比表面積信息如表2所列。

圖3所示為NS和MS的XRD圖譜。由圖可知，NS和MS的XRD圖譜與鈦酸鍶的標準PDF卡片PDF#84-443相一致，表明NS及MS的物相組成為鈦酸鍶，這與EDS結(jié)果一致。

2.2 鈦酸鍶微/納米顆粒對RAW 264.7細胞的影響

圖4所示為通過活/死細胞染色及CCK-8測試評估的NS及MS對RAW 264.7細胞的細胞活性的影響。結(jié)果表明，將RAW 264.7細胞暴露在具有NS及MS的環(huán)境中培養(yǎng)24 h和72 h后，與空白組相比，各組均未表現(xiàn)出細胞毒性，展現(xiàn)出良好的細胞相容性。

圖5所示為RAW 264.7細胞與NS或MS共培養(yǎng)4 h后的形態(tài)。由圖可知，將RAW 264.7細胞與NS/MS共培養(yǎng)48 h后，RAW 264.7細胞有向多邊形發(fā)展的趨勢，且相對空白組，NS和MS組RAW 264.7細胞具有更大的鋪展面積。

圖1 (a) NS和(b) MS的形貌及元素組成

圖2 (a) NS和(b) MS粉末的粒徑分布

表2 NS和MS粉末的形貌、粒徑分布、平均粒徑和比表面積

圖3 NS和MS粉末的XRD圖譜

圖4 暴露在含有NS或MS環(huán)境中的RAW 264.7細胞的細胞活性

(a) Live (green)/dead (red) cell staining; (b) CCK8 test

圖6所示為RAW264.7細胞與NS或MS共培養(yǎng)48 h后炎癥基因的表達水平。由圖可知，NS和MS組RAW 264.7細胞高表達巨噬細胞M1表型表面標記物基因iNOS，而白細胞分化抗原(cluster of differentiation，CD)86基因的表達僅在MS組顯著提升，各組之間巨噬細胞M2表型表面標記物基因甘露糖受體(CD206)的表達在統(tǒng)計學上沒有顯著性差異，表明納米和微米鈦酸鍶顆粒都將誘導巨噬細胞向M1表型極化，且微米鈦酸鍶的誘導作用更顯著。促炎性細胞因子基因TNF-α在NS和MS組均上調(diào)，而IL-6僅在MS組上調(diào)且顯著高于NS組，抗炎性細胞因子IL-10在NS組下調(diào)，表明納米和微米鈦酸鍶顆粒將激活RAW 264.7細胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，相對納米鈦酸鍶顆粒，微米鈦酸鍶顆粒具有更強烈的刺激作用。

圖5 RAW 264.7細胞與NS或MS共培養(yǎng)48 h后的形態(tài)

圖6 RAW 264.7細胞與NS或MS共培養(yǎng)48 h后炎癥基因的表達水平(與NS相比*p <0.05和**p <0.01，與NS相比##p<0.01)

(a) iNOS; (b) CD86; (c) CD206; (d) TNF-α; (e) IL-6; (f) IL-10

為了進一步評估RAW 264.7細胞在各環(huán)境中的極化狀態(tài)，采用了免疫熒光染色來評估RAW 264.7細胞M1表型表面標記物iNOS的表達水平，結(jié)果如圖7所示。藍紫色熒光表示細胞核，紅色熒光表示iNOS，紅色熒光的強弱代表了iNOS的表達量。iNOS在各組的表達水平如下：MS>NS>空白組，表明與空白組相比，微米、納米鈦酸鍶顆粒均傾向于誘導RAW 264.7細胞向M1表型極化，其中微米鈦酸鍶顆粒的誘導作用更顯著。

此前的研究已經(jīng)表明，0.1～10 μm顆粒會影響巨噬細胞的活性和炎癥反應(yīng)[14?17]。然而，成分、顆粒數(shù)量、形狀和表面積也會對巨噬細胞的行為產(chǎn)生影響，并且各種因素之間會相互影響。截止目前，尚未有定論確定什么是決定巨噬細胞命運的最主要因素。在本工作中，采用SAR=1來使材料暴露于細胞的面積一致，研究了RAW 264.7細胞暴露于納米和微米鈦酸鍶顆粒的活性、形態(tài)變化以及炎癥反應(yīng)。并且，由于采用的兩種鈦酸鍶都是無規(guī)則顆粒狀(圖1)，因此可以排除掉由于顆粒形貌差異造成的影響。

圖7 Nuclei(藍紫色)和iNOS(紅色)的免疫熒光染色

YOSHIOKA等[24]研究發(fā)現(xiàn)大于5.6 μm的聚甲基丙烯酸甲酯顆粒會顯著抑制巨噬細胞的活性。在本研究中發(fā)現(xiàn)納米和微米鈦酸鍶顆粒都不會影響RAW 264.7細胞的活性，這可能是由于采用的鈦酸鍶顆粒尺寸(<2.1 μm)遠小于5.6 μm。此外，也可能與鈦酸鍶良好的細胞相容性有關(guān)[21]。RAW 264.7細胞在納米和微米鈦酸鍶顆粒的刺激下有向更大面積的多邊形形態(tài)發(fā)展的趨勢(圖5)，盡管目前現(xiàn)有的研究對于巨噬細胞形態(tài)與表型之間的關(guān)系尚存在爭議，但是M1表型表面標記物基因iNOS和CD86的高表達證明了納米和微米鈦酸鍶顆粒誘導RAW 264.7細胞激活為M1表型。多項研究表明，顆粒尺寸的增大激活巨噬細胞產(chǎn)生更顯著的炎癥反應(yīng)[15?16, 24]，這與本工作中的結(jié)果一致，微米鈦酸鍶顆粒誘導RAW 264.7細胞上調(diào)促炎性細胞因子基因TNF-α和IL-6的表達。盡管許多研究結(jié)果 表明，Sr2+具有誘導巨噬細胞向M2表型極化，并下調(diào)TNF-α、IL6等促炎性細胞因子表達的作用，但是可能顆粒本身對巨噬細胞的刺激作用更顯著[25?26]?；谝陨系慕Y(jié)果，可以認為，在設(shè)計骨植入材料時，應(yīng)盡量避免產(chǎn)生大尺寸的磨損顆粒。

3 結(jié)論

1) 微/納米鈦酸鍶顆粒(<2.1 μm)對RAW 264.7細胞第24 h、72 h的增殖活性沒有顯著性影響，具有良好的細胞相容性。

2) 微/納米鈦酸鍶顆粒刺激RAW 264.7細胞形態(tài)向多邊形發(fā)展，并且貼附面積變大。

3) 微米鈦酸鍶顆粒刺激RAW 264.7細胞高表達iNOS、CD86、TNF-α和IL-6基因，并且iNOS、TNF-α和IL-6基因的表達顯著高于納米鈦酸鍶顆粒。納米鈦酸鍶顆粒刺激RAW 264.7細胞高表達iNOS和TNF-α基因，而IL-10基因的表達顯著下調(diào)。

4) 微米和納米鈦酸鍶顆粒誘導RAW 264.7細胞向M1表型極化，產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，并且微米鈦酸鍶顆粒誘導的炎癥反應(yīng)更顯著。

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Inflammatory response of strontium titanate micro/nanoparticles in vitro

LIU Wentao1, WU Hong1, ZHOU Jixiang2

(1. State Key Laboratory of Powder Metallurgy, Central South University, Changsha 410083, China;2. Xiangya Hospital, Central South University, Changsha 410083, China)

The biological response of RAW 264.7 cells stimulated by strontium titanate micro/nanoparticles was studied by the direct interaction between cells and materials. Scanning electron microscope (SEM), laser particle size analyzer, X-ray diffractometer and specific surface area tester were used to characterize the physical and chemical properties of the materials. The effects of strontium titanate micro/nanoparticles on the proliferation activity of RAW 264.7 cells were evaluated by CCK-8 test and live/dead cell staining; the morphological changes of cells were observed by SEM; The expression of inflammatory cytokine genes in RAW 264.7 cells stimulated by strontium acid micro/nanoparticles. The results show that the compositions of the micron and nano strontium titanate particles are uniform and both have irregular shapes. The average particle size of the micron strontium titanate particles is 1 085.0 nm, the specific surface area is 1.72 m2/g, and the particle size of the nano strontium titanate particles is 505.2 nm. The specific surface area is 2.94 m2/g. The micron and nano strontium titanate particles have no effect on the proliferation activity of RAW 264.7 cells on the 24h and 72h. Under the stimulation of micro/nano strontium titanate particles, the RAW 264.7 cell morphology develops into a polygonal shape and has a larger attachment area. Micron strontium titanate particles stimulated high expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS), cluster of differentiation (CD) 86, TNF-α and interleukin (IL)-6 genes in RAW 264.7 cells, and the expression of iNOS, tumor necrosis factor (TNF)-α and IL-6 genes is significantly higher than that of nano strontium titanate particles. nano strontium titanate particles stimulated RAW 264.7 cells to highly express iNOS and TNF-α genes, while IL-10 gene expression is significantly down-regulated. Both micron and nano strontium titanate particles stimulate RAW 264.7 cells to highly express iNOS, induce RAW 264.7 cells to polarize to the M1 phenotype, and produce an inflammatory response. The inflammatory response induced by micron strontium titanate particles is more significant.

strontium titanate; micro/nanoparticles; RAW 264.7 cells; cytokine; inflammatory response

TB32

A

1673-0224(2021)05-475-08

國家自然科學基金資助項目(52071346)；長沙市自然科學基金資助項目(kq2014293)

2021?04?26；

2021?06?02

吳宏，教授，博士。電話：0731-88836296；E-mail: wuhong927@126.com

(編輯 高海燕)