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    抑制Notch1/Jagged1通路可促進(jìn)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞“歸巢”并改善哮喘

    2021-11-10 16:24:24朱慧志徐晴雯任馮春劉向國
    關(guān)鍵詞:歸巢充質(zhì)抑制劑

    王 坤,朱慧志,楊 磊,徐晴雯,任馮春,劉向國

    1 新安醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,安徽 合肥 230031;2 徽學(xué)研究中心安徽中醫(yī)藥大學(xué)分中心,安徽 合肥 230031;3 安徽中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院,安徽 合肥 230012;4 安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,安徽 合肥 230031;5安徽中醫(yī)藥大學(xué)研究生院,安徽 合肥 230012;6安徽中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院,安徽 合肥230012

    支氣管哮喘是由多種細(xì)胞及細(xì)胞組分參與的氣道免疫炎癥性疾?。?-2],其中輔助T細(xì)胞Th1/Th2“漂移”在哮喘炎癥的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[3-4]。Th1/Th2間維持動態(tài)平衡是機(jī)體應(yīng)對外界刺激的基本免疫調(diào)節(jié)方式[5]。哮喘作為一種免疫疾病,在過敏原刺激下其發(fā)病以Th1/Th2間平衡向Th2“漂移”,形成炎癥反應(yīng)為主要特征[6]。積極有效地調(diào)控Th1/Th2“漂移”是治療哮喘的重要手段。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)是骨髓中的成體干細(xì)胞[7]。既往研究發(fā)現(xiàn)[8-9],BMSCs驅(qū)動的免疫調(diào)節(jié)可重新調(diào)控Th1/Th2平衡,減少Th2細(xì)胞因子,抑制嗜酸性粒細(xì)胞在肺組織的聚集,降低哮喘炎癥損傷。這一過程的前提是“歸巢”:組織發(fā)生炎癥損傷時(shí),BMSCs向受損部位遷移。歸巢能在靶向部位發(fā)揮免疫效應(yīng)。BMSCs歸巢對哮喘中的免疫失衡雖有調(diào)節(jié)作用,但具體作用機(jī)制尚不明確。Notch信號通路廣泛參與細(xì)胞發(fā)育、分化及免疫調(diào)節(jié)等功能活動[10]。Notch 受體(Notch1等)和配體(Jagged1等)結(jié)合后,其胞內(nèi)段易位至細(xì)胞核,與DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄阻遏物結(jié)合并作用,將其轉(zhuǎn)化為誘導(dǎo)靶基因轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄激活復(fù)合物,活化下游靶基因的表達(dá)[11]。Notch 通路中的受體Notch1 和配 體Jagged1 是哮喘Th1/Th2 平衡向Th2“漂移”的關(guān)鍵因素。研究表明[12-13],Jagged1蛋白參與了Th2細(xì)胞的發(fā)育,而Notch1通過促進(jìn)Th2特異性轉(zhuǎn)錄因子GATA-3的表達(dá),誘導(dǎo)Th2細(xì)胞分化。BMSCs歸巢與Notch通路均與哮喘Th1/Th2“漂移”關(guān)系密切,其中可能存在更深入的關(guān)聯(lián)。為進(jìn)一步觀察Notch 通路是否參與哮喘BMSCs歸巢過程,本文擬通過阻斷Notch信號通路研究BMSCs歸巢對哮喘Th2型炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)及歸巢與Notch1/Jagged1通路的關(guān)聯(lián)性。旨在推測Notch信號通路可能參與了Th1/Th2“漂移”和BMSCs歸巢免疫調(diào)節(jié),從而改善哮喘炎癥反應(yīng)。

    1 材料和方法

    1.1 材料

    1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 清潔級雄性SD 大鼠(20 只,體質(zhì)量180~200 g),用于實(shí)驗(yàn)分組。4周齡清潔級雄性SD大鼠(10只,體質(zhì)量80~100 g)用于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及哮喘支氣管上皮細(xì)胞提取。以上大鼠均由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物管理中心提供。動物倫理由安徽中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)(批號:AHUCM-rats-2019005)。

    1.1.2 主要設(shè)備和試劑 顯微鏡(OLYMPUS);超聲霧化器(上海魚躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司);熒光定量PCR儀(Thermo)。流式細(xì)胞儀(貝克曼)。卵清蛋白(OVA):V級(Sigma);酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)試劑盒(Invitrogen);角蛋白8(keratin 8)抗體(Abcam)。CD29-異硫氰基熒光素(FITC)、CD45-FITC、CD44-藻紅蛋白(PE)、CD11b/c-PE單克隆抗體(eBioscience)。PCR試劑盒(賽默飛);趨化因子受體4抗體(Proteintech);Cy3標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)(Beyotime);T-bet、GATA-3、Notch1、Jagged1抗體(Santa Cruz)。

    1.2 方法

    1.2.1 分組 將20只大鼠用隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對照組(NC)、模型對照組(MC)、BMSCs移植組(BMSCs)、BMSC+Notch抑制劑組,5只/組。

    1.2.2 間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、鑒定 4周齡大鼠斷頸處死后,取股骨并剪去兩端,吸取胎牛血清+雙抗溶液多次沖出骨髓細(xì)胞后吹打,1000 r/min離心5 min,棄上清,用PBS 重懸細(xì)胞,以2×106/cm2密度接種,置于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每3~4 d更換1次培養(yǎng)基。原代細(xì)胞融合至80%~90%左右開始傳代培養(yǎng),調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106/mL,倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。取融合達(dá)90%的第4代BMSCs,分別加入熒光標(biāo)記的抗體(Anti-CD29-FITC、Anti-CD44-PE、Anti-CD45-FITC、Anti-CD11b/c-PE),混勻,4 ℃避光孵育30 min,PBS漂洗2遍以去除未結(jié)合的抗體,流式細(xì)胞儀鑒定其表面標(biāo)志物。

    1.2.3 CFSE標(biāo)記BMSCs 將熒光染料羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺(CFSE)以DMSO溶解,配成使用液,貯存于4 ℃條件下,避免反復(fù)凍融。移植前將5×106BMSCs細(xì)胞懸浮于2 mL 0.1%BSA/PBS 內(nèi),加入2 μL CFSE工作液,置37 ℃10 min;4倍體積4 ℃的胎牛血清終止反應(yīng),室溫5 min;PBS室溫洗滌3次,第2次結(jié)束后37 ℃5 min;將1×106BMSCs細(xì)胞懸浮于1 mL PBS內(nèi),備用于移植。

    1.2.4 哮喘模型建立[14]及細(xì)胞移植 除正常對照組外的各組大鼠,在第0和7天腹腔注射致敏混合液(含1 mg 10%卵清蛋白和100 mg氫氧化鋁凝膠),第14天將大鼠置于密閉容器內(nèi),予1%卵清蛋白霧化激發(fā),30 min/次,1次/d,連續(xù)7 d。正常組予生理鹽水替代完成上述操作。BMSCs組及BMSCs+Notch抑制劑組在激發(fā)最后一天經(jīng)尾靜脈將CFSE標(biāo)記的1×106/mL BMSCs懸液植入體內(nèi),其余2組以PBS替代注射。BMSCs+Notch抑制劑組在激發(fā)前1 h按1 mg/kg體質(zhì)量腹腔注射抑制劑,隔日1次,連續(xù)7 d。

    1.2.5 哮喘支氣管上皮細(xì)胞的分離及鑒定 大鼠麻醉后在無菌環(huán)境下取出氣管,清除肺組織及表面其他軟組織后,灌入1%鏈酶蛋白酶,結(jié)扎上端,4 ℃過夜,置于90 mm培養(yǎng)皿中,剪開氣管,予培養(yǎng)基沖洗,細(xì)胞刷充分刷洗,收集培養(yǎng)皿中的刷洗液,離心洗滌收集細(xì)胞。1000 r/min離心5 min,棄上清,用原代細(xì)胞培養(yǎng)液吹打細(xì)胞后置于無菌培養(yǎng)瓶,置于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),備用于實(shí)驗(yàn)。各組分離培養(yǎng)獲得的支氣管上皮細(xì)胞與角蛋白單克隆抗體作用后,經(jīng)細(xì)胞核熒光染料4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色,磷酸緩沖鹽溶液(PBS)漂洗,置于熒光顯微鏡下觀察。

    1.3 觀察指標(biāo)

    1.3.1 間充質(zhì)干細(xì)胞歸巢至肺組織觀察 在BMSCs移植后24、72、144 h取大鼠肺組織,將組織剪成1~2 mm3小塊,用消化酶消化,不銹鋼過濾網(wǎng)過濾消化液,調(diào)整各組全肺單個(gè)細(xì)胞懸液濃度,采用流式細(xì)胞術(shù)和熒光顯微鏡分析CFSE-BMSCs(綠色)熒光強(qiáng)度。

    1.3.2 支氣管上皮細(xì)胞CXCR4表達(dá)檢測 采用免疫熒光檢測支氣管上皮細(xì)胞CXCR4表達(dá)。將分離培養(yǎng)獲得的支氣管上皮細(xì)胞傳代,待長至80%~90%經(jīng)PBS洗滌、胰酶消化,充分吹打成單細(xì)胞懸液,接種于已置玻片的6孔板。爬片以4%多聚甲醛避光固定,滴加5%BSA均勻覆蓋。經(jīng)CXCR4抗體(1∶100),Cy3標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)(1∶500)作用后,予以DAPI染色,封片,置于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。(DAPI紫外激發(fā)波長330~380 nm,發(fā)射波長420 nm,發(fā)藍(lán)光;CY3激發(fā)波長510~560 nm,發(fā)射波長590 nm,發(fā)紅光)。

    1.3.3 肺組織病理形態(tài)學(xué)觀察 取大鼠右下肺組織,石蠟包埋,HE染色,光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織病理形態(tài)學(xué)變化。

    1.3.4 哮喘大鼠肺組織Th1/Th2細(xì)胞表達(dá) 檢測各組大鼠肺組織IFN-γ、IL-5、IL-13的蛋白水平,操作方法按照美國Invitrogen的ELISA試劑盒操作步驟,用酶標(biāo)儀測定并計(jì)算各組蛋白含量。

    1.3.5 肺組織Notch1/Jagged1通路相關(guān)基因表達(dá) 提取大鼠肺組織總mRNA,Notch1、Jagged1引物設(shè)計(jì)由上海生工合成(Notch1、Jagged1引物序列見表1)。反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄第一鏈互補(bǔ)DNA(cDNA),PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖電泳,UVP凝膠顯像儀掃描,圖像分析。以β-actin作為內(nèi)源參照,使用2-ΔΔCT方法計(jì)算Notch1、Jagged1 mRNA的相對表達(dá)量。

    表1 Notch1、Jagged1引物序列Tab.1 Primer sequences of Notch1 and Jagged1

    1.3.6 肺組織T-bet、GATA-3、Notch1、Jagged1蛋白表達(dá)將肺組織在冷的組織裂解緩沖液中均勻化、溶解,提取肺組織總蛋白。將樣品放入標(biāo)準(zhǔn)蛋白樣品緩沖液中煮沸,用10%三甘氨酸凝膠進(jìn)行蛋白電泳,然后轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜膜。將膜依次加入T-bet、GATA-3、Notch1、Jagged1一抗(稀釋濃度分別為1∶1000、1∶1000,1∶800、1∶1000)、二抗(山羊抗兔IgG,上海碧云天生物技術(shù)有限公司,A0516)孵育,稀釋濃度為1∶5000,按照標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程對膜進(jìn)行顯影。使用發(fā)光試劑盒檢測試劑對這些條帶進(jìn)行曝光、顯影。Image J量化各個(gè)條帶的強(qiáng)度,并以相對于內(nèi)參β-actin的百分比表示T-bet、GATA-3、Notch1、Jagged1蛋白表達(dá)量。

    1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,各組間比較采用單因素方差分析,兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、支氣管上皮細(xì)胞鑒定骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞觀察及鑒定

    初次接種2 h后開始貼壁,細(xì)胞呈類圓形,密集分布,排列無序。原代培養(yǎng)7 d后,細(xì)胞開始增殖,形態(tài)呈錘形或梭形。第3代未分化間充質(zhì)干細(xì)胞,形態(tài)均一呈成纖維細(xì)胞樣,漩渦狀分布,排列整齊有序。流式細(xì)胞儀分析發(fā)現(xiàn),BMSCs表面標(biāo)志物CD29、CD44呈陽性,表達(dá)量分別為97.4%、96.5%。CD45、CD11b呈陰性,表達(dá)量分別為1.62%、1.08%(圖1)。支氣管上皮細(xì)胞鑒定:經(jīng)DAPI染色后細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光,支氣管上皮細(xì)胞特異性目的蛋白keratin 8的抗體表達(dá)于胞漿,呈紅色熒光,鑒定為支氣管上皮細(xì)胞(圖2)。

    圖1 BMSCs表面標(biāo)志物CD29、CD44、CD45、CD11b表達(dá)Fig.1 Expression of BMSC surface markers CD29,CD44,CD45 and CD11b.

    圖2 支氣管上皮細(xì)胞鑒定Fig.2 Identification of bronchial epithelial cells (Immunofluorescence staining,original magnification:×200).A:The nuclei of bronchial epithelial cells were blue after DAPI staining;B:The cytoplasm showed red fluorescence;C:Merged image.

    2.2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞歸巢至肺組織觀察

    通過將CFSE標(biāo)記BMSCs移植至哮喘大鼠體內(nèi),追蹤C(jī)FSE表達(dá)量來反映BMSCs在肺組織中的歸巢程度。流式細(xì)胞術(shù)觀察肺組織CFSE表達(dá)量發(fā)現(xiàn),BMSCs體內(nèi)移植后,24 h CFSE表達(dá)量為(4.89±1.65)%,72 h CFSE表達(dá)量為(14.78±4.65)%,144 h CFSE表達(dá)量為(3.07±1.06)%,CFSE在肺組織表達(dá)量隨著時(shí)間推移逐漸升高,在72 h 達(dá)到高峰,后逐漸降低,證明移植后BMSCs可向肺組織歸巢,表明同源異體BMSCs經(jīng)尾靜脈注射入哮喘大鼠體內(nèi)后可向肺組織遷移(圖3)。

    圖3 CFSE標(biāo)記的BMSCs在哮喘大鼠肺組織中表達(dá)Fig.3 Expression of CFSE-labeled BMSCs in lung tissues of asthmatic rats.A:Homing amount of CFSE+cells at 24 h.B:Homing amount of CFSE+cells at 72 h.C:Homing amount of CFSE+cells at 144 h.D:Comparison of CFSE expression across the time points.**P<0.01 vs 24 h;▲▲P<0.01 vs 72 h.

    2.3 支氣管上皮細(xì)胞中CXCR4表達(dá)

    NC組與MC組之間比較,MC組CXCR4表達(dá)量較NC 組升高(t=2.8271、P=0.0222)。BMSCs 移植及Notch 抑制劑干預(yù)后發(fā)現(xiàn),與NC 組、MC 組比較,BMSCs組、BMSCs+Notch抑制劑組CXCR4表達(dá)量均顯著升高(t=2.6021、P=0.0315,t=5.8649、P=0.0004)。與BMSCs組比較,BMSCs+Notch抑制劑組CXCR4表達(dá)量升高(t=3.254、P=0.0116,圖4)。

    圖4 支氣管上皮細(xì)胞中CXCR4表達(dá)Fig.4 CXCR4 expression in bronchial epithelial cells (immunofluorescence staining,×200).A:NC group;B:MC group;C:BMSCs group;D:BMSCs+Notch inhibitor group;E:Comparison of relative expression of CXCR4 among the groups.*P<0.05,**P<0.01 vs NC group;ΔP<0.05,ΔΔP<0.01 vs MC group;▲P<0.05 vs BMSCs.

    2.4 肺組織病理形態(tài)學(xué)觀察

    NC組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整,支氣管管腔無狹窄,管腔壁無增厚紊亂,周圍無明顯炎癥細(xì)胞浸潤。MC組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)受損明顯,支氣管管腔狹窄,平滑肌增生明顯,周圍大量炎癥細(xì)胞浸潤,以嗜酸性粒細(xì)胞為主,成團(tuán)聚集。BMSCs組及BMSCs+Notch抑制劑組肺組織受損、管腔狹窄及炎癥細(xì)胞浸潤情況均較模型組有不同程度減輕(圖5)。

    圖5 各組大鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)觀察Fig.5 Observation of pathologies of rat lung tissue in each group (HE staining,×200).A:NC group;B:MC group;C:BMSCs group;D:BMSCs+Notch inhibitor group.

    2.5 肺組織Th1、Th2細(xì)胞因子表達(dá)

    ELISA結(jié)果顯示,與NC組比較,MC組IFN-γ表達(dá)降低(t=5.2001、P=0.0008),IL-5、IL-13表達(dá)升高(t=4.2173、P=0.0029,t=3.7989、P=0.0052)。

    與MC組比較,BMSCs組、BMSCs+Notch抑制劑組IFN-γ表達(dá)升高(t=2.653、P=0.0291,t=5.4014、P=0.0006);BMSCs+Notch抑制劑組IL-5、IL-13降低(t=2.5386、P=0.0348,t=3.7295、P=0.0058)。BMSCs組IL-5(t=1.8189、P=0.1064)、IL-13(t=1.1298、P=0.2913)表達(dá)降低,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

    與BMSCs組比較,BMSCs+Notch抑制劑組IFN-γ表達(dá)升高(t=2.7269、P=0.0260),IL-13降低(t=2.9032、P=0.0198,表2)。

    表2 肺組織Th1/Th2細(xì)胞表達(dá)Tab.2 IFN-γ,IL-5 and IL-3 expressions in the lung tissue(Mean±SD,pg/mL,n=5)

    表3 肺組織Th1、Th2細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子蛋白表達(dá)Tab.3 Expression of Th1 and Th2 cell-specific transcription factor proteins in the lung(Mean±SD,n=5)

    2.6 肺組織Th1、Th2細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子蛋白表達(dá)

    免疫印跡結(jié)果顯示,與NC組比較,MC組肺組織Th1 細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子T-bet 蛋白表達(dá)降低(t=5.3118、P=0.0007),Th2細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子GATA-3蛋白表達(dá)升高(t=5.9062、P=0.0004)。經(jīng)BMSCs移植及Notch1 通路阻滯劑后,與MC 組比較,BMSCs 組、BMSCs+N抑制劑組T-bet蛋白表達(dá)升高(t=4.2132、P=0.0029,t=5.9316、P=0.0003),BMSCs組、BMSCs+N抑制劑組GATA-3 蛋白表達(dá)降低,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,表4,圖6)。

    圖6 肺組織Th1、Th2細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子蛋白表達(dá)Fig.6 Th1 and Th2 cell specific transcription factor protein expression in lung tissue.

    2.7 肺組織Notch1/Jagged1表達(dá)

    RT-PCR 檢測結(jié)果顯示,與NC 組比較,MC 組Notch1、Jagged1 mRNA和蛋白表達(dá)升高(P<0.01)。與MC組比較,BMSCs組Notch1、Jagged1 蛋白表達(dá)降低,BMSCs+Notch抑制劑組Notch1、Jagged1mRNA和蛋白表達(dá)降低(P<0.05或P<0.01)。與BMSCs組比較,BMSCs+Notch抑制劑組Notch1mRNA表達(dá)降低(P<0.05,表5,圖7)。

    圖7 肺組織Notch1、Jagged1蛋白表達(dá)Fig.7 Expression of Notch1 and Jagged1 protein in lung tissue.

    表5 肺組織Notch1/Jagged1表達(dá)Tab.5 Expression of Notch1/Jagged1 in lung tissue(Mean±SD,n=5)

    3 討論

    哮喘作為免疫相關(guān)的疾病,是以Th1/Th2失衡誘發(fā)的Th2型免疫炎癥占主導(dǎo)[15]。骨髓反應(yīng)機(jī)制參與了哮喘炎癥的發(fā)生發(fā)展。在過敏原刺激下,Eos/B祖細(xì)胞自骨髓釋放量增多,經(jīng)外周循環(huán)周轉(zhuǎn)至肺,在Th2細(xì)胞因子IL-4、IL-5等調(diào)控下分化成熟,出現(xiàn)以嗜酸性粒細(xì)胞氣道浸潤為主的哮喘病理變化[16-17]。哮喘氣道炎癥反應(yīng)是多種炎癥細(xì)胞及細(xì)胞組分相互作用的結(jié)果[18]。過敏原刺激下,細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)功能下降,導(dǎo)致Th1/Th2平衡向Th2“漂移”,Th1細(xì)胞因子(IFN-γ等)分化受抑制,Th2炎癥因子(IL-5、IL-13等)大量產(chǎn)生,通過促進(jìn)肥大細(xì)胞募集,IgE合成,嗜酸性粒細(xì)胞浸潤等方式,促進(jìn)哮喘炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展[19-20]。本研究結(jié)果顯示,與NC組比較,MC組IFN-γ表達(dá)降低,IL-5、IL-13表達(dá)升高。而Th1、Th2轉(zhuǎn)錄因子亦隨之變化,同時(shí)大量Th2型炎性因子分化并對相關(guān)炎癥介質(zhì)的調(diào)控作用,致使慢性氣道炎癥發(fā)生及加劇。此研究結(jié)果與Abdolreza等[21]的研究結(jié)果相似。

    源于骨髓的間充質(zhì)干細(xì)胞具有多向分化能力,增殖性高且具有良好的免疫調(diào)節(jié)性和免疫相容性。BMSCs通過調(diào)節(jié)免疫炎癥可有效改善哮喘[22]。哮喘發(fā)作時(shí),BMSCs通過調(diào)節(jié)樹突狀細(xì)胞和T細(xì)胞功能,抑制相關(guān)炎癥細(xì)胞的分泌,發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)劑的作用[23]。本次研究發(fā)現(xiàn),將間充質(zhì)干細(xì)胞注射入哮喘大鼠體內(nèi)后,支氣管上皮細(xì)胞中CXCR4表達(dá)隨之升高,且肺組織病理形態(tài)學(xué)改善。說明BMSCs可有效緩解哮喘炎癥損傷。而改善的前提是“歸巢”,“歸巢”使得骨髓中休眠的BMSCs被炎癥損傷部位分泌的趨化因子“喚醒”,遷移至受傷的肺組織,免疫調(diào)節(jié)炎癥環(huán)境和修復(fù)受損肺組織,從而改善哮喘癥狀。Th1/Th2“漂移”即Th2型反應(yīng)模式是哮喘氣道炎癥的重要特征,也是哮喘炎癥形成的始動和維持因素。BMSCs具有免疫相容性和免疫調(diào)節(jié)的特征[24]。免疫相容性使得BMSCs不易被機(jī)體的免疫細(xì)胞識別,有效逃脫免疫系統(tǒng)的攻擊排斥,為異體應(yīng)用提供可能[25]。本研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)BMSCs 干預(yù)后,BMSCs 組、BMSCs+Notch抑制劑組IFN-γ表達(dá)升高,IL-5、IL-13表達(dá)降低。提示在機(jī)體出現(xiàn)炎癥反應(yīng)時(shí),受損部位釋放趨化因子與

    BMSCs表面的趨化因子受體(CXCR4)結(jié)合,沿著趨化軸,BMSCs歸巢至炎癥損傷部位,調(diào)節(jié)免疫內(nèi)環(huán)境,發(fā)揮抑制炎癥和組織修復(fù)作用,從而改善哮喘大鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)變化。研究表明[26],在哮喘的炎癥反應(yīng)中,BMSCs可通過分泌和調(diào)節(jié)生長因子、細(xì)胞因子、抗纖維化因子等實(shí)現(xiàn)旁分泌效應(yīng),抑制T細(xì)胞的過度活化,改變Th1/Th2平衡,緩解哮喘氣道炎癥。

    Notch信號通路廣泛參與多種組織細(xì)胞的信號識別、增殖、分化和凋亡等功能活動[27]。在哺乳動物中,Notch通路由Notch配體和Notch受體組成,它們都是I型跨膜蛋白[28]。受體與配體結(jié)合,在受體Jagged1觸發(fā)后由γ-分泌酶介導(dǎo)的蛋白水解機(jī)制釋放Notch胞內(nèi)域(NICD),通過與DNA 結(jié)合蛋白(DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄阻遏物)關(guān)聯(lián)介導(dǎo)了Notch信號的傳導(dǎo)[29]。這種蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間的相互作用可激活下游的基因[30]。Notch信號通路參與了對BMSCs的調(diào)控。有研究發(fā)現(xiàn)[31],Notch信號通路可抑制間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化。用Jagged1處理BMSCs后,BMSCs中下游的基因mRNA水平顯著增加,BMSCs中的白蛋白表達(dá)被阻斷。研究還發(fā)現(xiàn)[32],通過γ-促分泌酶抑制劑阻斷Notch 信號傳導(dǎo)或敲除BMSCs 中Notch 信號的轉(zhuǎn)錄因子RBP-J 可導(dǎo)致CXCR4表達(dá)上調(diào),并促進(jìn)BMSCs在體外和小鼠肝臟缺血/再灌注模型體內(nèi)肝臟組織中對SDF-1的反應(yīng),說明通過阻斷Notch信號傳導(dǎo)可上調(diào)BMSCs中的CXCR4表達(dá)以達(dá)到增強(qiáng)BMSCs歸巢能力的目的。本次研究結(jié)果顯示,與NC組比較,MC組Notch1mRNA、Jagged1mRNA表達(dá)升高,Notch1、Jagged1蛋白表達(dá)升高。說明哮喘發(fā)生時(shí)存在Notch信號通路受體和配體表達(dá)的變化。而通過BMSCs 植入歸巢后發(fā)現(xiàn),BMSCs 組、BMSCs+Notch抑制劑組Notch1mRNA、Jagged1mRNA表達(dá)降低,且BMSCs+Notch抑制劑組Jagged1蛋白降低更明顯,說明抑制Notch通路過激活可促進(jìn)BMSCs歸巢,從而影響哮喘的進(jìn)展。

    綜上所述,哮喘存在Th1/Th2平衡向Th2“漂移”,且BMSCs向哮喘肺組織歸巢對Th1/Th2“漂移”產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用,而Notch1/Jagged1通路可能參與其過程,通過抑制Notch1/Jagged1通路過激活可改善哮喘炎癥的發(fā)作。

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