火龍果果皮總黃酮和多糖的提取工藝及抗氧化研究

吳冬凡, 龐杜賢， 林清盛

(1. 廣東藥科大學(xué)∥廣東省化妝品工程技術(shù)研究中心， 廣州 510006； 2. 國(guó)藥集團(tuán)馮了性(佛山)藥業(yè)有限公司， 佛山 528000)

火龍果(Hylocereusundatus‘Foo-Lon’)，仙人掌科量天尺植物的果實(shí). 原產(chǎn)中美洲熱帶沙漠地區(qū)，現(xiàn)普遍人工栽培，我國(guó)主要集中分布在海南、廣東、廣西和貴州. 已有的研究發(fā)現(xiàn)，火龍果果皮中含有豐富的天然色素[1]、黃酮類化合物[2]、多糖[3]、膳食纖維[4]和果膠[5]等功能性物質(zhì). 花青素、黃酮類化合物和多糖等天然抗氧化劑在抗炎癥、抑制腫瘤、保護(hù)血管等方面發(fā)揮著重要的作用[6]，有研究發(fā)現(xiàn)其果皮和果肉是能通過GABA系統(tǒng)介導(dǎo)的抗焦慮物質(zhì)[7]. 還有研究[8]報(bào)導(dǎo)使用火龍果果皮提取物作為豬肉片中天然抗氧化劑. AMID 等[9]在果皮中發(fā)現(xiàn)了一種堿性耐熱蛋白酶，其在氧化劑作用下十分穩(wěn)定，并且與抑制劑、表面活性劑、螯合劑共存時(shí)未有變化. ANAND-SWARUP等[10]研究火龍果(Hylocereusundatus)提取物對(duì)糖尿病心血管并發(fā)癥影響的結(jié)果表明，火龍果中的抗氧化性成分可顯著增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物機(jī)體的抗氧化防御能力，抑制其氧化應(yīng)激，避免由高血糖引發(fā)的主動(dòng)脈損傷，并降低其僵硬程度.國(guó)外在火龍果果皮甜菜素也多有研究，SREEKANTH等[11]的研究結(jié)果表明，甜菜苷可影響人類慢性骨髓性白血病細(xì)胞系K562的細(xì)胞周期，減弱其增殖，同時(shí)促進(jìn)線粒體釋放細(xì)胞色素C，使其進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)來誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡. LUO等[12]對(duì)果皮提取液(Hylocereus.undatus、Hylocereus.polyrhizus)的研究，發(fā)現(xiàn)其對(duì)人前列腺癌細(xì)胞系(PC3)、人胃癌細(xì)胞系(MGC-803) 和人乳腺癌細(xì)胞系(Bcap-37)同樣具有抑制作用. BAI等[13]的研究結(jié)果顯示，火龍果果皮多酚類物質(zhì)對(duì)肺癌 A549細(xì)胞有顯著的抑制作用.

火龍果果皮是火龍果的外果皮，約占整個(gè)火龍果質(zhì)量的1/4. 然而，在火龍果被食用和作為食品染色劑被加工的過程中，其果皮往往作為廢物被丟棄，若能回收利用，可有效提高火龍果的經(jīng)濟(jì)附加值. 目前，對(duì)火龍果果皮中黃酮和多糖的研究主要集中于其單一成分的提取和測(cè)定，未能綜合評(píng)價(jià)火龍果果皮活性成分含量. 本文利用水浴回流的提取方法，設(shè)計(jì)不同提取條件，對(duì)火龍果果皮中的黃酮和多糖進(jìn)行聯(lián)合提取，并對(duì)所提取得到的物質(zhì)進(jìn)行體外抗氧化性研究，為火龍果果皮進(jìn)一步加工成為天然抗氧化劑的開發(fā)提供理論依據(jù)，以提高火龍果的經(jīng)濟(jì)附加價(jià)值.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料和儀器

實(shí)驗(yàn)材料：火龍果果皮2020年11月購(gòu)于中山市果蔬市場(chǎng).

實(shí)驗(yàn)試劑：蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(成都埃法生物科技有限公司，批號(hào)：153.18.4)，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品(成都埃法生物科技有限公司，批號(hào)：50-99-7)，ATBS底物(上海伊卡生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：30931-67-0)，DPPH(上海如吉生物科技發(fā)展有限公司，批號(hào)：1898-66-4)，其余試劑均為分析純.

實(shí)驗(yàn)儀器：721 型分光光度計(jì)(株式會(huì)社日立制作所，U-3900)，電子天平 (上海恒平科學(xué)儀器有限公司，JA2003)，多功能高速中藥粉碎機(jī)(溫州頂歷醫(yī)療器械有限公司，DFT-150).

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 火龍果果皮的預(yù)處理 火龍果皮洗凈熱水殺酶，瀝干水分后于烘箱中60 ℃烘干，粉碎過0.25 mm(60目)篩備用.

1.2.2 供試品的制備 稱取2.00 g火龍果果皮粉末置于圓底燒瓶中，料液比(料、液的單位分別是g、mL，下同)為1∶30、乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、提取溫度70 ℃水浴回流提取3 h，抽濾得到抽濾液，定容至100 mL，得到總黃酮樣品待測(cè)液. 從中取出5 mL再定容至100 mL，即得多糖樣品待測(cè)液.

1.2.3 對(duì)照品的制備 精密稱取10 mg的蘆丁對(duì)照品，70%乙醇溶解并定容至50 mL，即得蘆丁對(duì)照品溶液. 精密稱取10 mg葡萄糖對(duì)照品，蒸餾水溶解后定容至100 mL，即得葡萄糖對(duì)照品溶液.

1.2.4 黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線制備及質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定 借鑒王曉波[2]等方法，總黃酮測(cè)定采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法. 分別移取0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL蘆丁對(duì)照品溶液于25 mL的容量瓶中，加入1 mL 5%亞硝酸鈉溶液，搖勻后靜置6 min；接著加入1 mL 10%硝酸鋁溶液，搖勻后放置6 min；最后加入10 mL 4%氫氧化鈉溶液，隨后加入70%乙醇定容，放置15 min顯色，以試劑空白管調(diào)零，510 nm處測(cè)定吸光值. 以蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，擬得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.014x+0.001，R2=0.999 8. 在測(cè)定的質(zhì)量濃度范圍8～40 μg/mL之內(nèi)，線性關(guān)系良好. 按上述方法測(cè)定待測(cè)樣品.

式中，C為待測(cè)液的質(zhì)量濃度，K為稀釋倍數(shù)，V為樣品溶液體積，M為稱取火龍果果皮粉末的質(zhì)量.

1.2.5 多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制備及質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定 參考但德苗[14]等方法，采用苯酚-硫酸比色法進(jìn)行測(cè)定. 取0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL的標(biāo)準(zhǔn)液定容至10 mL. 分別移取2 mL稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)液至帶刻度試管，加入1 mL 5%的苯酚溶液，搖勻，快速垂直注入濃硫酸5 mL，搖勻后置沸水水浴20 min后取出冷卻，以試劑空白管調(diào)零， 490 nm處測(cè)定吸光值. 以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，得到多糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.018 6x+0.001 2，R2=0.999 3. 在測(cè)定的質(zhì)量濃度10～50 μg/mL之內(nèi)，線性關(guān)系良好，按上述方法測(cè)定待測(cè)樣品.

式中，C為待測(cè)液的質(zhì)量濃度，K為稀釋倍數(shù)，V為樣品溶液體積，M為稱取火龍果果皮粉末的質(zhì)量.

1.2.6 單因素實(shí)驗(yàn)

(1)提取時(shí)間對(duì)總黃酮和多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響. 分別稱取2.00 g的火龍果果皮粉末，設(shè)計(jì)不同梯度提取時(shí)間(1、2、3、4、5 h)，其他3個(gè)因子分別為：料液為1∶30、提取溫度60 ℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，水浴回流提取，每組平行提取3次，測(cè)定總黃酮和多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù).

(2)料液比對(duì)總黃酮和多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響. 分別稱取2.00 g的火龍果果皮粉末，設(shè)計(jì)不同梯度料液比(1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60)，其他3個(gè)因子分別為：提取時(shí)間1 h、提取溫度60 ℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，水浴回流提取，每組平行提取3次，測(cè)定總黃酮和多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù).

(3)乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮和多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響. 分別稱取2.00 g的火龍果果皮粉末，設(shè)計(jì)不同體積分?jǐn)?shù)(40%、50%、60%、70%、80%)的乙醇為提取溶劑，其他3個(gè)因子分別為：料液比為1∶30、提取時(shí)間1 h、溫度60 ℃，水浴回流提取，每組平行提取3次，測(cè)定總黃酮和多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù).

(4)提取溫度對(duì)總黃酮和多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響. 分別稱取2.00 g的火龍果果皮粉末，設(shè)計(jì)不同梯度溫度(50、60、70、80、90 ℃)，其他3個(gè)因子分別為：提取時(shí)間1 h、料液比1∶30、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，水浴回流提取，每組平行提取3次，測(cè)定總黃酮和多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù).

1.2.7 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 綜合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提取時(shí)間選擇1、2、3 h，料液比選擇1∶30、1∶40、1∶50，乙醇體積分?jǐn)?shù)選擇50%、60%、70%，提取溫度選擇60、70、80 ℃，設(shè)計(jì)四因素三水平的正交實(shí)驗(yàn),考察4個(gè)因子對(duì)總黃酮和多糖得率的影響. 正交表設(shè)計(jì)見表1.

表1 正交設(shè)計(jì)表Table 1 The orthogonal table

1.2.8 抗氧化研究

(1)不同質(zhì)量濃度樣品溶液和對(duì)照品溶液的制備. 稱取20.00 g火龍果果皮粉按1.2.2的方法提取得到抽濾液，濃縮至25 mL，移取1 mL定容至100 mL，從中取5 mL定容到50 mL多糖待測(cè)液，測(cè)得多糖的質(zhì)量濃度為62.24 mg/mL(因?yàn)闇y(cè)得多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)是總黃酮的15倍，所以抗氧化實(shí)驗(yàn)選取多糖為指標(biāo)). 從多糖待測(cè)液取1 mL定容至100 mL，再?gòu)闹蟹謩e取2.5、5.0、10、15、20、25、30 mL定容到50 mL，得到不同質(zhì)量濃度的樣品溶液(31.12、62.24、124.48、186.72、248.96、311.20、373.44 μg/mL).

精密稱取62.24 mg的抗壞血酸定容到100 mL，分別取2.5、5.0、10、15、20、25、30 mL定容到50 mL，得到抗壞血酸不同質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液(31.12、62.24、124.48、186.72、248.96、311.20、373.44 μg/mL).

(2) DPPH·清除能力的測(cè)定. 精密稱取5 mg的DPPH，加入無水乙醇溶解并定容至100 mL，置暗處儲(chǔ)存?zhèn)溆? 取7支刻度試管進(jìn)行編號(hào)后，分別加入2 mL DPPH乙醇溶液，再分別加入2 mL不同質(zhì)量濃度的樣品溶液，放置暗處反應(yīng)30 min. 以無水乙醇調(diào)零，517 nm處測(cè)得的吸光值記為A1，另取7支刻度試管編號(hào)，以無水乙醇替代DPPH乙醇溶液，測(cè)得的吸光值記為A2；另取一支刻度管，加入 2 mL DPPH乙醇溶液和2 mL無水乙醇溶液，測(cè)定的吸光值記為A0. 以抗壞血酸作陽性對(duì)照. 計(jì)算公式如下：

(3)ABTS自由基清除能力的測(cè)定.

配制濃度7.0 mmol/L的ABTS儲(chǔ)備液及2.5 mmol/L的過硫酸鉀儲(chǔ)備液，然后按比例1∶1混合均勻，放置12～16 h. ABTS工作液的制備：用無水乙醇稀釋，于734 nm處測(cè)得吸光值為0.70±0.02.

取7支刻度管編號(hào)且移取4 mL的ABTS工作液，分別加入0.4 mL不同濃度的樣品溶液，搖勻，暗處反應(yīng)6 min，隨后以無水乙醇調(diào)零，在734 nm處測(cè)定吸光值，記為A1;另取7支刻度管編號(hào)，無水乙醇替代ABTS工作液,測(cè)定的吸光值記為A2；另取一支刻度試管，加入4 mL的ABTS工作液和0.4 mL的無水乙醇溶液，測(cè)定吸光值并記為A0. 以相同質(zhì)量濃度的抗壞血酸作陽性對(duì)照[15]. 計(jì)算公式如下：

(4)羥基自由基清除能力的測(cè)定. 取7支刻度管編號(hào)，準(zhǔn)確移取1 mL不同質(zhì)量濃度的樣品溶液于刻度管中，然后分別加入1 mL 7.5 mmol/L FeSO4溶液和 1 mL 7.5 mmol/L H2O2溶液，震蕩搖勻，反應(yīng) 10 min 后，加入1 mL 7.5 mmol/L 水楊酸-無水乙醇溶液?jiǎn)?dòng)反應(yīng)，37 ℃水浴30 min后取出，蒸餾水調(diào)零，510 nm處測(cè)定吸光值，記為A1. 另取7支刻度試管，用蒸餾水替代 H2O2作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照組，測(cè)定的吸光值并記為A2. 另取一支刻度試管，以蒸餾水代替樣品溶液，測(cè)定的吸光值并記為A0. 以相同質(zhì)量濃度的抗壞血酸作陽性對(duì)照[16]. 計(jì)算公式如下：

2 結(jié)果與分析

2.1 火龍果中總黃酮和多糖提取的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 提取時(shí)間對(duì)總黃酮和多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響 從表2看出，在提取時(shí)間1～5 h內(nèi)，總黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨著提取時(shí)間增加而降低，而多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)恰恰相反，其出現(xiàn)的可能原因是受熱時(shí)間越長(zhǎng)，黃酮類化合物本身是抗氧化劑，容易被氧化. 加熱條件下，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，其含量減少的原因，可能是火龍果果皮中黃酮物質(zhì)被破壞[17]. 綜合總黃酮和多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)兩者因素來考量，在提取時(shí)間為3 h，多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)基本不再增加，而總黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)相對(duì)較大，故而從時(shí)間、經(jīng)濟(jì)等成本來說，提取時(shí)間為3 h較適宜.

表2 提取時(shí)間對(duì)總黃酮和多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

2.1.2 料液比對(duì)總黃酮和多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響 隨著料液比增大(表3)，總黃酮和多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均表現(xiàn)出先快速增加，后趨于平緩再下降的趨勢(shì)；當(dāng)料液比增大至1∶40時(shí)達(dá)到最大值，繼續(xù)增大料液比則總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)會(huì)降低；多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)則在料液比為1∶50達(dá)到最大值，但此時(shí)的值與料液比為1∶40時(shí)差異不大，故可認(rèn)為在料液比為1∶40時(shí)總黃酮和多糖已經(jīng)基本完全提取，因而選取料液比為1∶40為其最佳料液比.

表3 料液比對(duì)總黃酮和多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

2.1.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮和多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮和多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響較大(表4)，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)增加時(shí)，多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)先增加后降低，出現(xiàn)的可能原因?yàn)椋阂掖俭w積分?jǐn)?shù)為40%時(shí)，提取過程出現(xiàn)較多的凝膠狀物質(zhì)，粘附在濾渣上，導(dǎo)致抽濾過程收集得到的濾液不完全，故而總黃酮和多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)會(huì)偏低；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)>60%時(shí)，多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)也較低. 其出現(xiàn)的原因是總黃酮和多糖的極性相差較大，多糖多為水溶性物質(zhì)，乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，多糖提取量自然降低. 對(duì)于黃酮類成分而言，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)有最大提取量，而隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的繼續(xù)增加，黃酮類成分的提取不再增加，此時(shí)提取得到的物質(zhì)多為有機(jī)酸、樹脂、葉綠素等物質(zhì). 因此，同時(shí)考慮總黃酮和多糖的極性差異，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%比較適宜.

表4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮和多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

2.1.4 提取溫度對(duì)總黃酮和多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響 在提取溫度<70 ℃時(shí)(表5)，總黃酮的提取率隨溫度的升高而增大，之后隨著溫度的升高而減小，在一定溫度范圍內(nèi)，溫度的增加有利于黃酮的溶出，但超過一定范圍之后，溫度繼續(xù)升高的情況下，容易導(dǎo)致黃酮被破壞[18]；多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)則無此現(xiàn)象，溫度越高，多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)越高. 其出現(xiàn)的可能原因是隨著溫度的增加，當(dāng)提取溫度為70 ℃時(shí)，此時(shí)總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)有最大值，多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)雖未達(dá)到最大值，但綜合能源損耗、總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)等因素影響，選取提取溫度70 ℃較為適宜.

表5 提取溫度對(duì)總黃酮和多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

2.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

從表6可以看出，無論以總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)還是多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為指標(biāo)，4個(gè)因子對(duì)總黃酮和多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響由大到小的排序均為C、D、B、A，從單一指標(biāo)來考量：若以總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為指標(biāo)，得到的最優(yōu)條件應(yīng)為A3B1C3D3，即：提取時(shí)間3 h，料液比1∶30，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，提取溫度80 ℃；若以多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為指標(biāo)，得到的最優(yōu)條件應(yīng)為A3B1C3D2，而本次研究需同時(shí)考察2個(gè)指標(biāo)，對(duì)總黃酮和多糖同時(shí)進(jìn)行考量，以尋求兩者的質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到最大化.

表6 L9(34)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 6 The L9 (34) orthogonal experimental results

從方差分析表(表7、8)可見：不管是總黃酮還是多糖，乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響都是最大的，尤其是對(duì)于多糖的影響更大. 當(dāng)同時(shí)考量總黃酮和多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)時(shí),提取時(shí)間在3 h時(shí)，多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)最大，而黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)與提取時(shí)間為2 h的質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異不大，故而選取3 h作為其最佳提取時(shí)間；料液比為1∶30時(shí)兩者的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均有最大值，故選取料液比1∶30較適合；當(dāng)提取溫度為70 ℃的時(shí)候，多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)有最大值，而總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)則在80 ℃最大，但此時(shí)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)與70 ℃時(shí)相差不大，故綜合考慮后選取提取溫度70 ℃作為其最佳提取溫度；乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響顯著，而對(duì)多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響不顯著. 但乙醇體積分?jǐn)?shù)在60%和70%時(shí)，多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)極差也較大，無法直觀判斷哪個(gè)條件更為適合，因而進(jìn)行2組實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，選取最佳的提取條件. 即分別以乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%和70%，其他3個(gè)因子保持一致(提取時(shí)間3 h、料液比1∶30、提取溫度70 ℃)，分別進(jìn)行3次的平行實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證. 即選取工藝組合為A3B1C2D2和A3B1C3D2進(jìn)行結(jié)果驗(yàn)證.

表7 總黃酮方差分析表Table 7 The variance analysis of total flavonoids

按照上述所示條件分別進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如下：在提取條件為A3B1C2D2時(shí)，總黃酮平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7.06 mg/g，RSD為7.43%，多糖的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)122.75 mg/g，RSD為6.71%. 若在提取條件為A3B1C3D2時(shí)，總黃酮平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7.87 mg/g，RSD為4.53%，多糖的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為114.05 mg/g，RSD為4.54%. 后者相比較于前者，其RSD值更小，即表明其提取總黃酮和多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)誤差范圍更小、穩(wěn)定性更好. 綜上所述，本次實(shí)驗(yàn)研究最終確定的火龍果果皮總黃酮和多糖最佳提取條件為：A3B1C3D2，即提取時(shí)間3 h，料液比1∶30，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，提取溫度70 ℃.

表8 多糖方差分析表Table 8 The variance analysis of polysaccharide

2.3 抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

2.3.1 不同質(zhì)量濃度樣品對(duì)DPPH·的清除效果 抗壞血酸和多糖質(zhì)量濃度在31.12～373.44 μg/mL時(shí)(圖1)，抗壞血酸和火龍果果皮提取物均對(duì)DPPH·表現(xiàn)很強(qiáng)的清除效果. 兩者對(duì)DPPH· 清除能力均隨著質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)，當(dāng)火龍果果皮提取物中多糖的質(zhì)量濃度增大到373.44 μg/mL時(shí)，清除率達(dá)到88.64%，此時(shí)清除能力與抗壞血酸最大清除率接近.

圖1 不同質(zhì)量濃度樣品對(duì)DPPH·的清除效果

2.3.2 不同質(zhì)量濃度樣品對(duì)ABTS自由基的清除效果 多糖質(zhì)量濃度為31.12～373.44 μg/mL時(shí)(圖2)，火龍果果皮提取物表現(xiàn)較強(qiáng)清除能力. 當(dāng)樣品溶液中多糖為62.24 μg/mL時(shí)，清除率僅為16.12%，隨著樣品溶液中多糖質(zhì)量濃度的增加，清除率逐漸增強(qiáng)，增加至373.44 μg/mL，最大清除率可達(dá)61.77%，清除效果也不錯(cuò).

圖2 不同質(zhì)量濃度樣品對(duì)ABTS自由基的清除效果

2.3.3 不同質(zhì)量濃度樣品對(duì)·OH的清除效果 在質(zhì)量濃度31.12～373.44 μg/mL之內(nèi)(圖3)，抗壞血酸和火龍果果皮提取物均對(duì)·OH表現(xiàn)有較強(qiáng)的清除效果，兩者清除率與質(zhì)量濃度呈正比關(guān)系. 當(dāng)質(zhì)量濃度增大至373.44 μg/mL時(shí)，抗壞血酸對(duì)羥基的清除率可達(dá)89.99%；而樣品對(duì)羥基的清除率為60.84%，達(dá)到了抗壞血酸的三分之二，由此可見，火龍果果皮提取物對(duì)·OH也有較好的清除效果.

圖3 不同質(zhì)量濃度樣品對(duì)·OH的清除效果

3 討論

本實(shí)驗(yàn)所選用的材料為火龍果果皮，果皮中含有較多的果膠酶，在多糖的提取過程中會(huì)分解一定量的果膠，造成提取得到的多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)減少，故將原材料鮮皮先進(jìn)行沸水殺酶，沸水殺酶階段也可溶出一部分的色素，降低樣品自身溶液對(duì)顯色結(jié)果的影響. 此次研究的提取方法選用水浴回流的方法，而不選用超聲提取，是考慮到目前超聲提取局限于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模，主要針對(duì)某些具體提取對(duì)象進(jìn)行簡(jiǎn)單的工藝條件篩選，推廣應(yīng)用有一定的限制；水浴回流提取則設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便、更適合工業(yè)生產(chǎn). 單因素各設(shè)計(jì)的5個(gè)水平進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以確定較適合的每個(gè)水平，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)確定最佳工藝. 從正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看到，乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取溫度是影響總黃酮和多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的主要因素，提取溫度越高，多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)就越高，總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)則降低，因此需把控好提取溫度；此外，在對(duì)乙醇體積分?jǐn)?shù)的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)時(shí)，乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%的時(shí)候，總黃酮的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)會(huì)比乙醇體積分?jǐn)?shù)60%時(shí)高，多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)則相對(duì)低一些，可能是由于兩者的極性引起的，根據(jù)相似相容的原則，總黃酮在70%的乙醇條件下可溶出更多，多糖則在60%乙醇條件下溶出更多. 在兩者多次實(shí)驗(yàn)后，發(fā)現(xiàn)在70%乙醇時(shí)RSD值更小，每次提取得到的總黃酮和多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)值誤差相對(duì)較低，故而選取該條件.

4 結(jié)論

本次研究通過正交實(shí)驗(yàn)篩選得到的火龍果果皮總黃酮和多糖的最佳提取工藝是：提取時(shí)間3 h，料液比為1∶30，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，提取溫度70 ℃. 此條件下提取到的火龍果果皮總黃酮和多糖的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為7.87 mg/g和114.05 mg/g. 此外，對(duì)火龍果果皮的提取物進(jìn)行一系列的體外抗氧化結(jié)果顯示：火龍果果皮提取物對(duì)DPPH·有明顯的清除效果，最大清除率達(dá)到88.64% ；對(duì)·OH及ABTS自由基有良好的清除效果，最大清除率分別達(dá)到60.84%和61.77%. 本研究?jī)?yōu)化了火龍果果皮總黃酮和多糖的提取工藝，探討了火龍果果皮提取物的體外抗氧化活性能力，對(duì)后續(xù)火龍果果皮資源的利用具有參考價(jià)值.