熊果苷納米粒的制備及用于燒傷皮膚修復(fù)研究

林曉霞, 何應(yīng)暢， 尤 蓉

(華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 廣州 510631)

熊果苷是廣泛存在于薔薇花科、杜鵑花科等植物中的一種酚性葡萄糖苷, 熊果苷分子式為C12H1607，相對(duì)分子質(zhì)量為272.25，有α-熊果苷和β-熊果苷2種差向異構(gòu)體，外觀為無色至白色粉末，熔點(diǎn)約在195～198 ℃，20 ℃下溶解度為100～150 g/L，易溶于熱水、甲醇、乙醇等的水溶液，不溶于乙醚、氯仿和石油醚等[1]. 熊果苷分子中具有2種結(jié)構(gòu)性功能基團(tuán)，即葡萄糖殘基和酚基. 葡萄糖殘基有親水性，酚基有黑色素合成酶抑制作用，故其可以在一定程度上起到保濕美白的作用，可作為美白劑添加至美白類化妝品中起到美白功效[2-3]. 除此之外，熊果苷具有快速止痛、消炎力強(qiáng)等特點(diǎn)，可以作為新型燙傷藥[4]. 但熊果苷存在遇光不穩(wěn)定、對(duì) pH 值敏感、難以在皮膚滯留和吸收等問題而限制其應(yīng)用[5].

皮膚燒傷治療中，傳統(tǒng)方法往往采取早期切痂植皮或先用磺胺嘧啶銀治療，再進(jìn)行植皮治療，該方法存在皮源困難、愈合癱痕增生和功能障礙等缺陷[6]. 細(xì)菌纖維素膜(Bacterial Cellulose Membrane) 具有良好的力學(xué)性能、高持水性和組織相容性等優(yōu)點(diǎn)，在組織工程支架和人工皮膚等方面具有廣泛的應(yīng)用前景，是目前生物醫(yī)用材料研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域[7-8]. 本研究將熊果苷通過白蛋白納米粒負(fù)載于細(xì)菌纖維素膜上，用于嘗試燒傷皮膚的修復(fù)，旨在開發(fā)含熊果苷的新型高效皮膚組織修復(fù)材料，控制藥物釋放，用于燒傷皮膚修復(fù)，改善傳統(tǒng)治療皮膚燒傷的修復(fù)效果.

1 材料與方法

1.1 主要材料

熊果苷(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，牛血清白蛋白(北京索萊寶科技有限公司)，細(xì)菌纖維素膜(海南光宇生物科技有限公司)，HE染色試劑盒(上海碧云天生物科技有限公司)，納米粒度和Zeta電位儀(Nano Series，Malvern Instruments Ltd.)，石蠟包埋機(jī)(EG1150，LEICA)，切片機(jī)(RM2235，LEICA)，掃描電子顯微鏡(Quanta 200，F(xiàn)EI)SPF級(jí)成年健康3月齡SD大鼠，雌雄不限，體質(zhì)量200～250 g，購(gòu)于南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)SCXK(粵)2016-0041. 普通級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)，動(dòng)物處置參照《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》進(jìn)行.

1.2 方法

1.2.1 Arb-BSA-NP的制備及檢測(cè)分析 采用去溶劑法制備熊果苷納米粒子(Arb-BSA-NP)[9]，具體操作如下：熊果苷(Arbutin, Arb)和白蛋白(Bovine Serum Albumin, BSA)溶于純水，在磁力攪拌器上邊攪拌邊滴加乙醇至溶液乳化，然后添加戊二醛溶液進(jìn)行交聯(lián)，交聯(lián)完成后減壓蒸餾除去乙醇，即為Arb-BSA-NP. 對(duì)pH、交聯(lián)時(shí)間、熊果苷與白蛋白的比例等3個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化，取Arb-BSA-NP乳懸液適量，用納米粒度和Zeta電位儀分別測(cè)定其粒徑分布和電位，數(shù)據(jù)利用SPSS進(jìn)行分析.

1.2.2 負(fù)載熊果苷納米粒(Arb-BSA-BC)的SEM分析 所制備的Arb-BSA-NP溶于緩沖溶液中，將纖維素膜浸漬其中過夜, 收集負(fù)載Arb-BSA-NP納米粒的細(xì)菌纖維素膜，該膜命名為Arb-BSA-BC，對(duì)Arb-BSA-BC進(jìn)行掃描電鏡分析.

1.2.3 Arb-BSA-BC用于治療大鼠燒傷實(shí)驗(yàn)

(1)燒傷模型的建立. 采用膏狀固體酒精灼燒法[10]制備燒傷模型，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物12只，體質(zhì)量200～250 g，1.4%戊巴比妥鈉(注射劑量105 mg/kg，按體質(zhì)量計(jì))腹腔注射麻醉后，于背部脊柱涂抹膏狀固體酒精2 cm×2 cm，灼燒30 s，生理鹽水擦拭干凈創(chuàng)面. 手術(shù)過程如圖1所示.

圖1 燒傷實(shí)驗(yàn)手術(shù)過程示意圖

(2)燒傷修復(fù)實(shí)驗(yàn). 隨機(jī)各取燒傷大鼠3只，創(chuàng)面分別覆蓋熊果苷納米纖維素膜Arb-BSA-BC、細(xì)菌纖維素膜(BC)、凡士林油紗(傳統(tǒng)敷料組)和無處理(模型對(duì)照組)，均以無菌紗布覆蓋透氣膠布固定包扎，隔天換藥，觀察其創(chuàng)面愈合情況.

(3)病理切片. 大鼠在燒傷16 d后處死，取燒傷區(qū)域皮膚做石蠟病理切片. 切片于4%PBS-多聚甲醛固定24 h. 經(jīng)70%乙醇2.0 h、80%乙醇2.0 h、90%乙醇1.5 h、95%乙醇(2次，每次1.0 h)、無水乙醇1.0 h脫水、無水乙醇0.5 h脫水、二甲苯(2次，每次45 min)，透明后，石蠟(2次，每次1.0 h)后包埋. 轉(zhuǎn)換不同種試劑之間，按V(前置試劑)比V(后置試劑)2∶1、1∶1、1∶2分別浸泡15 min逐步過渡. 病理切片蘇木素伊紅染色后鏡檢.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 Arb-BSA-NP制備的優(yōu)化

2.1.1 不同投料比對(duì)熊果苷納米粒粒徑及Zeta電位的影響 投料比對(duì)納米粒子的粒徑及穩(wěn)定性有較大的影響，在其他條件相同的情況下，以投料比(m(熊果苷)∶m(牛血清白蛋白))為1∶8、1∶10、1∶12分別制備熊果苷納米粒，其粒徑分布及Zeta電位見圖2. 從圖2中可以看出：投料比1∶10組的平均Zeta電位與其余2組的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，平均粒徑均一，主要集中在200 nm附近，Zeta電位顯示其穩(wěn)定性也明顯優(yōu)于其他組，能減少粒子之間的凝聚，形成穩(wěn)定的混懸液.

圖2 不同投料比對(duì)熊果苷納米粒粒徑及Zeta電位分布的影響

2.1.2 不同pH對(duì)熊果苷納米粒粒徑及Zeta電位的影響 熊果苷在酸性條件下易分解，在中性和弱堿性下穩(wěn)定性較好，因而分別在pH 7.0和pH 8.0制備Arb-BSA-NP，其粒徑分布及Zeta電位見圖3. 在pH為7.0、8.0時(shí)(圖3)，制備的Arb-BSA-NP的平均粒徑分別為200.48±4.43、730.38±16.49 nm，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；Zeta電位分別為-26.132±1.473、-37.13±1.79 mV，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01). 這可能與牛血清蛋白的性質(zhì)有關(guān)，天然牛血清白蛋白的等電點(diǎn)為4.6～5.8，在本實(shí)驗(yàn)制備條件下蛋白質(zhì)帶負(fù)電, pH增加可能引起液滴絮凝或聯(lián)合[11]，并且戊二醛的反應(yīng)速度隨pH增加交聯(lián)效果加強(qiáng)[12]，引起粒子之間相互結(jié)合，形成大小不一的粒子，因而pH 8.0粒子粒徑較大，均一性較差；pH升高導(dǎo)致粒子攜帶更多負(fù)電荷，從而其Zeta電位更低，穩(wěn)定性提高. 綜合粒徑與Zeta電位兩方面考慮pH為7.0.

圖3 不同pH對(duì)熊果苷納米粒粒徑及Zeta電位分布的影響

2.1.3 不同交聯(lián)時(shí)間對(duì)熊果苷納米粒粒徑及Zeta電位的影響 在最佳投料比1∶10及pH為7.0條件下，分別利用25%戊二醛交聯(lián)6、12、16 h制備熊果苷納米粒，其粒徑分布及Zeta電位見圖4. 從圖4中可以看出：交聯(lián)時(shí)間為6、12、16 h，納米粒平均粒徑分別為200.48±4.43、175.26±11.04、532.46±79.95 nm，平均Zeta電位分別為-26.13±1.47、-29.12±0.80、-25.07±1.70 mV；交聯(lián)時(shí)間為12 h與16 h的平均粒徑與Zeta電位的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，6 h與12 h之間的差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義. 可見交聯(lián)時(shí)間為12 h所制備的Arb-BSA-NP粒徑小，穩(wěn)定性高.

圖4 不同交聯(lián)時(shí)間對(duì)熊果苷納米粒粒徑及Zeta電位分布的影響

綜合上述優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定熊果苷納米粒制備條件為：投料比1∶10，pH為7.0，交聯(lián)時(shí)間為12 h，在該條件下制備所得的熊果苷納米粒平均粒徑為175.26 nm，Zeta點(diǎn)位為-29.12 mV.

2.2 Arb-BSA-BC掃描分析

所制備的Arb-BSA-BC的電鏡掃描分析結(jié)果見圖5，可見膜表面有顆粒聚集，而在空白纖維素膜表面無顆粒聚集，而加入粒子后，在纖維膜表面就有Arb-BSA-NP納米粒沉降.

圖5 負(fù)載Arb-BSA-NP的細(xì)菌纖維素和無負(fù)載納米粒細(xì)菌纖維素的SEM分析

2.3 大鼠燒傷修復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 燒傷創(chuàng)面愈合情況 對(duì)所制備的Arb-BSA-BC用于燒傷大鼠的創(chuàng)面治療，其結(jié)果如圖6所示.

圖6 SD大鼠燒傷創(chuàng)面的愈合情況

燒傷4 d后，4組創(chuàng)面均由滲出物干燥形成干痂，開始覆蓋創(chuàng)面治療，進(jìn)行痂下愈合；燒傷后8 d，部分痂皮開始出現(xiàn)松動(dòng)，剪去部分松動(dòng)的干痂后，可見創(chuàng)面仍在愈合之中，基底呈白色、紅色，傷口持續(xù)向外分泌滲出物；燒傷后12 d，模型對(duì)照組的干痂開始出現(xiàn)松動(dòng)，傳統(tǒng)敷料組痂皮掉落，但傷口未完全愈合，新的滲出物干燥形成新的干痂，Arb-BSA-BC組的干痂已脫落，創(chuàng)面逐步愈合，滲出明顯減少；燒傷后16 d，各組創(chuàng)面基本愈合，新生上皮組織呈粉紅色. 空白組、傳統(tǒng)敷料組、BC組有輕微紅腫. 但Arb-BSA-BC組已完全愈合，表面已有新生毛皮覆蓋，表明Arb-BSA-BC對(duì)該燒傷創(chuàng)面治愈效果良好. Arb-BSA-BC組相比其他組，其脫痂時(shí)間更早，且創(chuàng)面紅腫較輕. 這可能與熊果苷具有抗炎作用，能抑制燒傷過程中炎癥因子有關(guān)[13].

2.3.2 愈合創(chuàng)面組織切片觀察 對(duì)愈合創(chuàng)面進(jìn)行組織切片和HE染色，其結(jié)果如圖7所示. 根據(jù)創(chuàng)面的外表觀察以及病理組織切片顯示，皮膚附屬物被完全破壞，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)少見，真皮結(jié)締組織增生加厚. 其中模型對(duì)照組表皮凹凸不平，角化不完全；傳統(tǒng)敷料組創(chuàng)面周圍恢復(fù)較好，但創(chuàng)傷中心區(qū)仍有少量表皮尚未修復(fù)，表皮組織持續(xù)向創(chuàng)面中央生長(zhǎng)；BC及Arb-BSA-BC較傳統(tǒng)敷料能加速傷口干痂脫落，BC組及Arb-BSA-BC組創(chuàng)面已經(jīng)填平，傷口中央?yún)^(qū)表皮連續(xù)，周圍表皮再生完全. Arb-BSA-BC組較普通BC組，脫痂速度更快，12 d時(shí)就已完成脫痂，且傷口基本恢復(fù)，創(chuàng)面的紅腫較少. 表明細(xì)菌纖維素的纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)具備了負(fù)載藥物增強(qiáng)治療效果的能力，由此可見，本研究合成的負(fù)載熊果苷納米粒的細(xì)菌纖維素敷料具有促進(jìn)燒傷創(chuàng)面愈合的功效.

圖7 SD大鼠燒傷創(chuàng)面的病理切片(HE染色，×100)

3 討論

熊果苷是一種天然存在的糖苷類物質(zhì), 隨著近年來研究的不斷深入, 證實(shí)熊果苷有多種藥理作用，如抗菌、鎮(zhèn)咳、平喘、祛痰、抗氧化、利尿、抗?jié)?、抗腫瘤、抑制胰島素降解、增強(qiáng)免疫等效用[14]. 細(xì)菌纖維素具有高純度和高結(jié)晶度、很強(qiáng)的持水能力、較高的生物相容性和生物可降解性而在材料行業(yè)備受關(guān)注[15]. 本研究以細(xì)菌纖維素為材料，負(fù)載具有抗炎性能的熊果苷納米粒，開發(fā)一種新型的燒傷創(chuàng)面修復(fù)材料Arb-BSA-BC. 燒傷動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，纖維素膜疏松多孔的結(jié)構(gòu)以及纖維素中的羥基等親水基團(tuán)能吸附大量的水分，保水率高達(dá)88%以上，其含有的大量水分能夠營(yíng)造濕潤(rùn)的環(huán)境，能加速傷口干痂的脫落速度，促進(jìn)愈合. 相對(duì)于傳統(tǒng)敷料組來說，Arb-BSA-BC材料和細(xì)菌纖維素處理后，干痂脫落早，創(chuàng)面愈合快，滲出明顯減少，但Arb-BSA-BC組相比細(xì)菌纖維素組來說，其脫痂時(shí)間更早，且創(chuàng)面紅腫較輕. 這可能與熊果苷具有抗炎作用，能抑制燒傷過程中炎癥因子有關(guān). 可見，通過纖維素膜負(fù)載熊果苷納米粒進(jìn)行燒傷治療，可改善傳統(tǒng)敷料治療皮膚燒傷治療中的修復(fù)效果，可以解決皮膚修復(fù)過程中的感染問題，為解決皮膚燒傷問題提供新的皮膚組織工程材料和治療新思路總之，目前研究取得初步成果，還需針對(duì)以下問題做深入研究，以完善該材料的使用：(1)熊果苷納米粒的包封率及載藥量；(2)細(xì)菌纖維素膜負(fù)載納米粒的效率和機(jī)制；(3)負(fù)載熊果苷納米粒的纖維膜在燒傷治療中的最佳濃度、在創(chuàng)面的釋放效果、釋放方式，以及藥物吸收率、安全性等問題仍未完全明晰.