擬南芥mapkkk15突變體的鑒定及非生物脅迫下的功能分析

梁群 鄧治 雷柯煜 黃華孫 安澤偉 程漢

摘? 要：低溫寒害是制約我國(guó)天然橡膠種植的最主要的環(huán)境限制因子，闡明橡膠樹抗逆機(jī)制有助于保障天然橡膠的種植安全。前期研究發(fā)現(xiàn)1個(gè)低溫誘導(dǎo)的橡膠樹MAPKKK基因參與橡膠樹抗寒能力調(diào)控，序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)該基因與擬南芥MAPKKK15基因同源，但AtMAPKKK15的功能仍不清楚。通過對(duì)擬南芥MAPKKK15基因功能的研究，揭示該類基因在植物逆境脅迫應(yīng)答中的作用，將有助于進(jìn)一步解析橡膠樹MAPKKK基因的功能。本研究從DNA和轉(zhuǎn)錄水平鑒定擬南芥mapkkk15純合突變體植株，評(píng)價(jià)mapkkk15突變體低溫和干旱脅迫抗性。結(jié)果顯示：低溫抑制AtMAPKKK15基因表達(dá)。對(duì)2個(gè)mapkkk15純合缺失突變體進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)與野生型植株相比，mapkkk15突變體植株的抗凍存活率提高，電解質(zhì)滲漏率下降。脫水實(shí)驗(yàn)表明，突變體葉片脫水率要高于野生型。上述結(jié)果表明，AtMAPKKK15基因在擬南芥中可能反向調(diào)控抗寒性，正向調(diào)控抗旱性。

關(guān)鍵詞：mapkkk15突變體;擬南芥;非生物脅迫;功能鑒定;橡膠樹

中圖分類號(hào)：S961.6?? ???文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Identification of mapkkk15 Mutant from Arabidopsis and Function Analysis to Abiotic Stress

LIANG Qun1，2， DENG Zhi2， LEI Keyi1，2， HUANG Huasun2， AN Zewei2， CHENG Han2*

1. College of Tropical Crops， Hainan Unviersity， Haikou， Hainan 570228， China; 2. Rubber Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou， Hainan 571101， China

Abstract： Abiotic stress severely affects the natural rubber yield in China， so it is necessary to clarify the resistant mechanism of rubber tree to improve natural rubber yield. In previous studies， we found that a MAPPKKK was induced by low temperature in rubber tree. Sequence alignment showed that HbMAPKKK was homologous with MAPKKK15 from Arabidopsis. However， the function of AtMAPKKK15 is unclear. Function of AtMAPKKK15 was identified in responding to stress and provide theoretical basis for further elucidating the function of MAPKKK in rubber tree. The homozygous T-DNA insertion mutants of AtMAPKKK15 were identified at DNA and transcription level， and evaluated resistance under low temperature and drought treatments. The results showed that the expression of AtMAPKKK15 was inhibited by low temperature. Two homozygous null mutants of MAPKKK15 were obtained from Arabidopsis. The mapkkk15 mutant improved low temperature tolerance by increasing survival and decreasing electrolyte leakage compared with the wild-type. However， the dehydration ration of mutant leaves increased with the extension of in vitro time. The results indicate that MAPKKK15 negatively regulated tolerance to low temperature and postively regulated resisitance to drought.

Keywords： mapkkk15 mutant; Arabidopsis thaliana; abiotic stress; function identification; Hevea brasiliensis

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.09.008

植物在整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過程中不可避免的會(huì)遭受低溫、干旱和高鹽等非生物脅迫危害，導(dǎo)致作物品質(zhì)及產(chǎn)量下降。植物為保證自身正常的生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)化出一套完整的抗逆機(jī)制，其中包括對(duì)脅迫信號(hào)的感知和傳導(dǎo)。蛋白質(zhì)的磷酸化和去磷酸化在植物細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。磷酸化反應(yīng)中的蛋白激酶可將ATP或GTP提供的磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到特定底物蛋白上，起到調(diào)節(jié)蛋白活性和逐級(jí)放大信號(hào)的作用。真核生物中普遍存在的絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activa?ted protein kinase，MAPK）級(jí)聯(lián)途徑是一種重要的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)模式。MAPK級(jí)聯(lián)途徑包括絲裂原活化蛋白激酶激酶激酶（MAPKKK/MAP3K/ MEKK/MKKK）、絲裂原活化蛋白激酶激酶（MAPKK/MEK/MKK）和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK/MPK）[1-2]。MAPKKK是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，位于MAPK級(jí)聯(lián)途徑最上游。一旦被信號(hào)傳導(dǎo)組分觸發(fā)，MAPKKK可選擇性地磷酸化下游保守的絲氨酸/蘇氨酸-X3-5-絲氨酸/蘇氨酸（S/T-X3-5-S/T）基序中Ser/Thr殘基[3]，從而激活MAPKK?；罨蟮腗APKK同樣可通過磷酸化的方式激活下游的MAPK?；罨腗APK能磷酸化轉(zhuǎn)錄因子、激酶和其他功能性蛋白質(zhì)等多種底物，最終啟動(dòng)植物細(xì)胞對(duì)逆境脅迫的一系列應(yīng)答反應(yīng)[4-6]。植物體內(nèi)MAPK級(jí)聯(lián)途徑在非生物脅迫響應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用[7-8]。

巴西橡膠樹（Hevea brasiliensis Muell. Arg）原產(chǎn)于巴西亞馬遜河流域，為多年生高大落葉喬木。因其具有產(chǎn)膠量高、性能優(yōu)、易栽培、易采膠、種植成本低和經(jīng)濟(jì)壽命長(zhǎng)等優(yōu)勢(shì)，巴西橡膠樹已成為熱帶地區(qū)重要的產(chǎn)膠經(jīng)濟(jì)作物。我國(guó)植膠區(qū)為非傳統(tǒng)植膠區(qū)，植膠區(qū)域緯度偏高，熱量和降水量不足。低溫和干旱等非生物脅迫嚴(yán)重影響我國(guó)天然橡膠的產(chǎn)量[9]。因此，闡明橡膠樹抗逆機(jī)制能有效促進(jìn)我國(guó)天然橡膠產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，冷脅迫下橡膠樹抗寒品種93-114和不抗寒品種熱墾501中MAPKKK基因均上調(diào)表達(dá)，但隨著冷脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，抗寒品種CATAS93-114中MAPKKK基因的表達(dá)量高于不抗寒品種熱墾50 說明MAPK級(jí)聯(lián)途徑可能參與橡膠樹低溫脅迫響應(yīng)[10]。植物MAPKKK是MAPK級(jí)聯(lián)途徑中成員最多的一類，如擬南芥中有80個(gè)[1]、水稻中有75個(gè)[11]、黃瓜中有59個(gè)[12]、麻風(fēng)樹有65個(gè)[13]，其中大部分MAPKKK基因功能未被鑒定。鑒于目前橡膠樹轉(zhuǎn)基因體系仍不成熟，目前借鑒模式植物擬南芥同源基因的功能來解析橡膠樹基因的功能為一種行之有效的研究手段。序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)擬南芥MAPKKK15基因與橡膠樹MAPKKK基因同源，但AtMAPKKK15功能仍不清楚。鑒于此，本項(xiàng)目篩選和鑒定了擬南芥mapkkk15純合突變體植株，并對(duì)在低溫和干旱脅迫下純合突變體的功能進(jìn)行分析。通過對(duì)擬南芥MAPKKK15基因功能的研究，旨在揭示該類基因在植物逆境脅迫應(yīng)答中的作用，為進(jìn)一步解析橡膠樹MAPKKK基因的功能提供理論依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

本研究所用擬南芥（Arabidopsis thaliana）生態(tài)型為Columbia（Col）。MAPKKK15基因的T- DNA插入突變體SALK_084817、SALK_102722和SALK_102721c（分別簡(jiǎn)稱為mk3-15-1、mk3- 15-2和mk3-15-3）種子購(gòu)于TAIR庫(kù)（http：//www. arabi?do-psis.org）。

1.2? 方法

1.2.1? 橡膠樹MAPKKK基因與擬南芥MAPK?KK15序列比對(duì)? 利用DNAMAN軟件對(duì)橡膠樹基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//hevea.catas.cn/home/index）中scaffold0552_396232蛋白序列和擬南芥MAPKKK15蛋白序列進(jìn)行比對(duì)分析。

1.2.2? 擬南芥的培養(yǎng)? 擬南芥種子用75%乙醇表面消毒5 min，加入50%次氯酸鈉（含0.05%吐溫?20）溶液消毒10 min，無菌蒸餾水洗5～6次，置于滅菌濾紙上吹干，播種于1/2 MS培養(yǎng)基上。4 ℃放置2～3 d后轉(zhuǎn)移至16 h光照/8 h黑暗，22 ℃條件下生長(zhǎng)。7 d后將擬南芥幼苗移植到混合基質(zhì)（營(yíng)養(yǎng)土∶蛭石=3∶1）中繼續(xù)培養(yǎng)1～5周。

1.2.3? mapkkk15純合突變體的篩選? 將擬南芥突變體幼苗培養(yǎng)2周左右，參考陳相等[14]方法快速提取擬南芥基因組DNA。在SALK網(wǎng)站（http：//signal.salk.edu/tdnaprimers.2.html/）上根據(jù)擬南芥突變體的編號(hào)查詢genotyping引物（表1），其中MK3-15-1LP和MK3-15-1RP、MK3-15- 2LP和MK3-15-2RP、MK3-15-3LP和MK3-15-3RP分別與LBb1.3組合，利用三引物法鑒定mapkkk15純合突變體。PCR反應(yīng)體系包括1 ?L模板，3條引物各0.5 ?L，2×PCR Mix 10 ?L，用ddH2O補(bǔ)足至20 ?L。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s、55 ℃退火1 min、72 ℃延伸1 min，循環(huán)30次;最后72 ℃延伸7 min。

1.2.4? 野生型和mapkkk15突變體植株中MAPK?K-K15基因表達(dá)量分析? 使用QIAGEN公司的RNeasy? Plant Mini Kit提取擬南芥葉片總RNA，具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。參照Thermo Fisher公司的RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒說明書制備cDNA第一鏈。以擬南芥葉片cDNA為模板，MK3-15-QF和MK3-15- QR為引物，擬南芥Actin為內(nèi)參基因，使用TB GreenTM Premix Ex TaqTMⅡ（TaKaRa）進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）分析。設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)和無模板對(duì)照。擴(kuò)增條件為95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。相對(duì)表達(dá)量用2?ΔΔCT法計(jì)算。

1.2.5? 低溫脅迫對(duì)擬南芥植株的影響? （1）低溫脅迫對(duì)mapkkk15突變體的表型影響：各選取2盤生長(zhǎng)4～6周的野生型及突變體幼苗，其中一盤放于22 ℃人工氣候室培養(yǎng)，另一盤放于4 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行低溫馴化。2 d后將馴化和未馴化的幼苗均放入0 ℃培養(yǎng)箱中，設(shè)置培養(yǎng)箱溫度每小時(shí)降低1 ℃并保持在?6 ℃。?6 ℃處理后0、4、8、24 h取出幼苗置于4 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，然后再轉(zhuǎn)移至22 ℃人工氣候室繼續(xù)培養(yǎng)，一周后觀察表型并拍照記錄。

（2）低溫脅迫下擬南芥葉片電解質(zhì)滲漏率測(cè)定：隨機(jī)選取抗凍性實(shí)驗(yàn)中?6 ℃處理4 h后的擬南芥葉片10 mg，將樣品置于15 mL離心管中，將離心管放入防凍劑（乙二醇∶水=3∶1）中進(jìn)行?2 ℃低溫水浴處理，每半小時(shí)降低0.5 ℃直至降至?6 ℃，繼續(xù)處理4 h，然后置于室溫解凍后，將損傷幼苗放入含有5 mL去離子水的15 mL管中，在22 ℃下振蕩15 min，測(cè)量電導(dǎo)率為S1。然后將試管放入100 ℃的沸水浴15 min，在22 ℃下振蕩1 h后，測(cè)定電導(dǎo)率為S2。電解質(zhì)滲漏率表示為（S1-S0）/（S2-S0）（S0為去離子水的電導(dǎo)率）[15]。每個(gè)材料設(shè)置6個(gè)重復(fù)。

（3）MAPKKK15基因?qū)Φ蜏孛{迫的響應(yīng)：將4～6周的擬南芥野生型幼苗置于22 ℃人工氣候室中培養(yǎng)2 d，然后轉(zhuǎn)移至4 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行模擬寒害處理，分別于處理后0、0.25、1、2、4、8、24 h取樣，采用qRT-PCR技術(shù)分析MAPKKK15基因表達(dá)模式。

1.2.6? 干旱脅迫下擬南芥葉片脫水率測(cè)定? 剪取3株擬南芥野生型和突變體幼苗葉片，置于培養(yǎng)皿中迅速稱取初始鮮重（FW），每種材料設(shè)置6個(gè)重復(fù)，將培養(yǎng)皿放入人工氣候室后2、4、6、8、10、12、14、16、20 h分別測(cè)定重量（DW），葉片脫水率表示為（FW-DW）/FW×100%。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 橡膠樹MAPKKK基因與擬南芥MAPKKK15基因序列比對(duì)

本課題組前期從橡膠樹低溫脅迫的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中獲得1個(gè)橡膠樹MAPKKK基因[10]，該基因的開放閱讀框?yàn)?356 bp，編碼451個(gè)氨基酸。為研究橡膠樹MAPKKK基因功能時(shí)作為參考，通過同源搜索發(fā)現(xiàn)擬南芥MAPKKK15基因（AT5G55090.1）與橡膠樹MAPKKK基因一致性為54.57%（圖1），橡膠樹MAPKKK基因與AtMAPKKK15基因編碼的氨基酸一致性為42.11%（圖2），其中2～257位氨基酸為保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶催化結(jié)構(gòu)域。AtMAPKKK15基因組序列無內(nèi)含子。文獻(xiàn)檢索后發(fā)現(xiàn)AtMAPKKK15 功能仍未被鑒定。因此，鑒定非生物脅迫下擬南芥MAPKKK15的功能，為進(jìn)一步研究橡膠樹MAPKKK基因功能時(shí)有可供參考的研究結(jié)果。

2.2? 鑒定mapkkk15純合突變體

TAIR數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)發(fā)現(xiàn)3個(gè)突變體株系的T-DNA都插入在外顯子上，mk3-15-1、mk3-15-2和mk3-15-3突變體T-DNA分別插入在MAPKKK15基因ATG下游930、1090、1180 bp左右（圖3A）。用三引物法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，野生型植株擴(kuò)增產(chǎn)物為1100 bp左右的單一條帶;純合突變體植株擴(kuò)增產(chǎn)物為560 bp左右的條帶;雜合突變體植株擴(kuò)增產(chǎn)物為560 bp和1100 bp左右2條條帶。結(jié)果顯示，mk3-15-1突變體的1～20號(hào)植株中，4、5、8、10和19為純合突變體，11為雜合突變體;mk3-15-2均為野生型;mk3-15-3均為純合突變體（圖3B）。以擬南芥野生型作為對(duì)照，MAPKKK15基因在mk3-15-1和mk3-15-3兩個(gè)突變體株系中幾乎不表達(dá)，表明突變體是完全缺失突變體（圖3C）。將mk3-15-1和mk3-15-3純合突變單株收種，擴(kuò)繁保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3? 低溫脅迫下mapkkk15突變體表型分析

擬南芥野生型植株經(jīng)過4 ℃低溫處理，然后進(jìn)行qRT-PCR分析基因表達(dá)模式。結(jié)果表明，AtMAPKKK15基因在低溫脅迫后0.25 h表達(dá)明顯下調(diào)，1 h后輕微上調(diào)，隨后表達(dá)量一直處于較低水平（圖4A）。表明AtMAPKKK15基因表達(dá)受低溫脅迫的抑制。

以野生型植株作為對(duì)照，將擬南芥植株在?6 ℃分別進(jìn)行凍害處理0、4、8、12、24 h。結(jié)果顯示，擬南芥經(jīng)過低溫處理后未立即死亡，但恢復(fù)培養(yǎng)一周后，僅低溫處理4 h的突變體植株部分存活，其余處理植株全部死亡。低溫處理4 h的2個(gè)突變體株系間幼苗存活株數(shù)無差異。電解質(zhì)滲漏率結(jié)果也表明，mapkkk15突變體葉片的滲漏率低于野生型植株，mk3-15-3株系的電解質(zhì)滲漏率低于mk3-15-1株系，其中mk3-15-3株系與WT相比差異達(dá)到極顯著水平（圖4C）。上述結(jié)果表明，與野生型相比，mk3-15-1和mk3-15-3突變體表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗凍性，突變體mk3-15-3株系低溫脅迫抗性可能高于mk3-15-1株系（圖4B、圖4C）。

2.4? mapkkk15突變體離體葉片脫水率變化

測(cè)定擬南芥葉片脫水率，發(fā)現(xiàn)葉片離體0～ 10 h后，mk3-15-3突變體株系脫水率高于野生型和mk3-15-1突變體株系，葉片離體10 h后2個(gè)突變體株系脫水率高于野生型，暗示mapkkk15突變體抗旱能力要弱于野生型植株（圖5）。

3? 討論

巴西橡膠樹原產(chǎn)于高溫、高濕的亞馬遜河流域，是一個(gè)典型的熱帶雨林樹種。我國(guó)植膠區(qū)地處熱帶北緣和南亞熱帶，屬非傳統(tǒng)植膠區(qū)，橡膠樹常遭受低溫和干旱等非生物脅迫危害[9]。研究逆境脅迫反應(yīng)的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制對(duì)于提高橡膠樹抗逆性具有重要意義。MAPK級(jí)聯(lián)途徑在極端溫度和干旱等非生物脅迫應(yīng)答中發(fā)揮著重要作用。MAPKKK作為級(jí)聯(lián)途徑最上游的組分，可通過蛋白質(zhì)磷酸化作用將上游信號(hào)級(jí)聯(lián)放大并傳遞至下游應(yīng)答分子，從而激活抗逆基因的表達(dá)。本課題組前期獲得1個(gè)低溫響應(yīng)的橡膠樹MAPKKK基因，鑒于橡膠樹轉(zhuǎn)基因技術(shù)仍不成熟，目前通過借鑒同源的模式植物基因的功能來解析橡膠樹基因的功能為一種行之有效的研究途徑。同源比對(duì)發(fā)現(xiàn)該基因與擬南芥MAPKKK15基因（AT5G55090.1）一致性為54.57%（圖1），基因編碼的氨基酸一致性為42.11%（圖2）。但隨后文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)AtMAPKKK15功能仍未被鑒定。因此，本研究通過鑒定非生物脅迫下擬南芥MAPKKK15的功能，為進(jìn)一步研究橡膠樹MAPKKK基因功能提供參考依據(jù)。

已有研究證明MAPKKK在非生物脅迫過程中發(fā)揮重要作用[[7-8， 16-20]。擬南芥MAPKKK的RAF亞族中Raf 43基因的表達(dá)受干旱脅迫誘導(dǎo)，raf43-1突變體抗旱性下降[18]。RAF亞群的DSM1基因在水稻中能被鹽、干旱、ABA誘導(dǎo)，但不能被低溫誘導(dǎo)。DSM1作為早期信號(hào)組分通過調(diào)控ROS清除來提高水稻干旱脅迫抗性[19]。PEG和NaCl抑制棉花GhRaf19表達(dá)，低溫和H2O2誘導(dǎo)棉花GhRaf19表達(dá)。GhRaf19沉默導(dǎo)致棉花抗旱性和耐鹽性增強(qiáng)，抗寒性下降。過表達(dá)GhRaf19基因的本生煙干旱和鹽脅迫抗性下降，抗寒性提高[20]。Wang等[13]發(fā)現(xiàn)低溫處理后62個(gè)麻風(fēng)樹MAPKKK基因中有8個(gè)上調(diào)表達(dá)，9個(gè)下調(diào)表達(dá)。本研究結(jié)果顯示AtMAPKKK15基因表達(dá)受低溫抑制。以野生型植株作為對(duì)照，將擬南芥植株在?6 ℃進(jìn)行脅迫處理，mapkkk15突變體植株的死亡率和電解質(zhì)滲漏率低于野生型植株，表明與野生型相比mapkkk15突變體抗寒性提高。本研究還發(fā)現(xiàn)mapkkk15突變體葉片在隨著離體時(shí)間延長(zhǎng)，脫水率高于野生型，提示mapkkk15突變體抗旱性弱于野生型植株。根據(jù)上述結(jié)果推測(cè)AtMAPKKK15基因在擬南芥中可能反向調(diào)控抗寒性，正向調(diào)控抗旱性。MAPKKK基因在非生物脅迫過程中是一個(gè)關(guān)鍵調(diào)節(jié)子，其功能復(fù)雜，仍需進(jìn)一步研究才能闡明AtMAPKKK15基因的功能及其作用機(jī)制。

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責(zé)任編輯：黃東杰