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    透明化三維成像研究艾灸對(duì)結(jié)腸炎大鼠腸道血管生成的作用

    2021-11-08 00:12:48祁琴童小雨吳璐一吳楚婷趙繼夢(mèng)黃艷李昆珊馬曉芃王照欽馮異吳煥淦
    上海針灸雜志 2021年10期
    關(guān)鍵詞:藥灸透明化結(jié)腸炎

    祁琴,童小雨,吳璐一,吳楚婷,趙繼夢(mèng),黃艷,李昆珊,馬曉芃,王照欽,馮異,吳煥淦

    ·動(dòng)物實(shí)驗(yàn)·

    透明化三維成像研究艾灸對(duì)結(jié)腸炎大鼠腸道血管生成的作用

    祁琴1,童小雨2,吳璐一1,吳楚婷3,趙繼夢(mèng)3,黃艷1,李昆珊3,馬曉芃3,王照欽1,馮異2,吳煥淦3

    (1.上海中醫(yī)藥大學(xué)針灸免疫效應(yīng)重點(diǎn)研究室,上海 200030;2.復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合學(xué)系,醫(yī)學(xué)神經(jīng)生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,復(fù)旦大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院,上海 200032;3.上海市針灸經(jīng)絡(luò)研究所,上海 200030)

    應(yīng)用組織透明化技術(shù)觀察隔藥灸對(duì)2-4-6三硝基苯磺酸(TNBS)誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎大鼠腸道血管生成的影響,從三維水平探討隔藥灸治療結(jié)腸炎的潛在機(jī)制。采用TNBS灌腸法制備結(jié)腸炎大鼠模型,將大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、隔藥灸組和抑制劑組,每組8只。隔藥灸組采用隔藥灸天樞、氣海穴治療;抑制劑組采用10 mg/mL的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(VEGFR)抑制劑溶液按1 mL/kg體質(zhì)量進(jìn)行腹腔注射治療。采用蘇木素-伊紅(HE)染色法觀察各組結(jié)腸組織病理學(xué)改變;采用CUBIC組織透明化技術(shù)對(duì)各組大鼠結(jié)腸組織進(jìn)行透明化處理,通過(guò)血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子1(PECAM-1/CD31)染色標(biāo)記血小板內(nèi)皮細(xì)胞,采用Imaris三維圖像處理軟件對(duì)結(jié)腸血管網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行三維測(cè)量和分析。HE染色結(jié)果顯示,模型組大鼠結(jié)腸形態(tài)結(jié)構(gòu)紊亂,黏膜固有層有明顯裂隙樣潰瘍,并有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn);隔藥灸組和抑制劑組上述病理改變均減輕,可見(jiàn)新生的黏膜上皮修復(fù)。結(jié)腸血管網(wǎng)絡(luò)三維測(cè)量和分析結(jié)果顯示,與正常組比較,模型組結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分顯著升高,結(jié)腸平均血管密度增加,分支等級(jí)增加,血管直徑降低;與模型組比較,隔藥灸組和抑制劑組結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分均顯著降低,結(jié)腸平均血管密度降低,分支等級(jí)降低,血管直徑增加,而隔藥灸組和抑制劑組無(wú)明顯差異。隔藥灸能有效減輕結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸炎癥和組織損傷,抑制結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸血管生成,從而發(fā)揮對(duì)結(jié)腸炎的治療作用。

    針灸療法;結(jié)腸炎;藥餅灸療法;組織透明化;血管生成;三維成像;2-4-6三硝基苯磺酸;大鼠

    炎癥性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)包括潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩病,是一類非特異性的慢性腸道炎性疾病,臨床表現(xiàn)多為腹痛、腹瀉、便血等。本病較難徹底根治,多數(shù)患者呈終生反復(fù)發(fā)作,具有潛在的癌變風(fēng)險(xiǎn)[1]。近年來(lái),國(guó)內(nèi)IBD發(fā)病率逐年攀升,但其具體發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明[2]。有研究通過(guò)對(duì)IBD患者結(jié)腸黏膜血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子1(platelet endothelial cell adhesion molecule 1, PECAM-1/CD31)免疫組化染色發(fā)現(xiàn)IBD患者結(jié)腸黏膜和黏膜下層的血管密度明顯高于健康人[3]。組織透明化三維成像技術(shù)能從組織器官的宏觀層面研究血管結(jié)構(gòu),完整且準(zhǔn)確地反映機(jī)體在生理、病理狀態(tài)下血管生成的細(xì)微變化。故本研究采用2-4-6三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid, TNBS)建立實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎大鼠模型,應(yīng)用組織透明化技術(shù),從三維宏觀角度觀察血管生成在結(jié)腸炎發(fā)病中的作用并探討隔藥灸對(duì)結(jié)腸炎大鼠腸道血管生成的影響,現(xiàn)報(bào)道如下。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

    36只清潔級(jí)雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(滬)2017-0005],體質(zhì)量為(170±10)g,飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽(yáng)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院科研處實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SCXK(滬)2018-0040]。

    1.2 主要試劑與儀器

    5%(W/V)TNBS(Sigma,美國(guó));阿西替尼(博飛美科,中國(guó));二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)(上海碧云天生物技術(shù)有限公司,中國(guó));藥粉(上海華濟(jì)藥業(yè)有限公司,中國(guó));艾絨(南陽(yáng)漢醫(yī)艾絨有限責(zé)任公司,中國(guó));黃酒(上海慶豐釀造調(diào)味品有限公司,中國(guó));多聚甲醛(上海國(guó)藥集團(tuán)有限公司,中國(guó));戊巴比妥鈉(Sigma,美國(guó));伊紅染色液(上海生工生物工程股份有限公司,中國(guó));蘇木素染色液(上海生工生物工程股份有限公司,中國(guó));PI(Sigma,美國(guó));山羊抗鼠CD31抗體(R&D Systems,美國(guó));驢抗山羊IgG(Abcam,英國(guó));雙光子共聚焦顯微鏡(Nikon,日本);光片顯微鏡(锘海LS18,中國(guó));光學(xué)顯微鏡(Olympus,日本)。

    組織透明液具體制作步驟為,將25 g尿素、24.96 g四乙二胺、28.8 g蒸餾水放置在100 mL離心管中攪拌均勻,待完全溶解降至室溫之后加入5 g Triton X-100,最后靜置過(guò)夜或置于真空泵(0.1 MPa)中30 min脫氣去除氣泡。

    1.3 造模方法

    將36只雄性SD大鼠隨機(jī)分為正常組10只和造模組26只。正常組大鼠不進(jìn)行任何處理,造模組大鼠采用TNBS灌腸液制備結(jié)腸炎大鼠模型[4]。具體造模步驟為,采用2%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)的劑量對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔注射麻醉,將5%TNBS與50%乙醇按2:1體積比混合均勻配制成TNBS灌腸液,每次灌腸劑量為3 mL/kg。每周灌腸1次,共4次。造模結(jié)束后,正常組和造模組各隨機(jī)抽取2只大鼠,對(duì)其結(jié)腸組織進(jìn)行蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin, HE)染色觀察來(lái)鑒定模型是否制備成功。

    1.4 分組與治療

    造模組大鼠造模成功后,隨機(jī)分為模型組、隔藥灸組和抑制劑組,每組8只,并與正常組大鼠作對(duì)照。

    正常組和模型組大鼠不進(jìn)行處理。

    隔藥灸組選取天樞(雙)、氣海穴進(jìn)行隔藥餅灸。先將附子、肉桂、丹參等藥研末,用黃酒調(diào)和之后制成厚約0.3 cm、直徑約0.5 cm的藥餅,將重約90 mg的艾絨捏成艾炷后放在藥餅上,再置于相應(yīng)穴位上施灸。每次每穴灸2壯,每日1次,連續(xù)治療7 d。

    抑制劑組采用血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(vascular endothelial growth factor receptor, VEGFR)抑制劑(阿西替尼)灌胃治療。將VEGFR抑制劑粉末與DMSO、生理鹽水配制成10 mg/mL的溶液,按1 mL/kg體質(zhì)量進(jìn)行灌胃。每日1次,連續(xù)治療7 d。

    1.5 標(biāo)本采集

    治療結(jié)束后,各組均采用2%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)行腹腔注射麻醉,先以4%多聚甲醛溶液灌流固定,然后用4%多聚甲醛溶液緩慢灌注至四肢、尾部僵硬,取肛門向上6~8 cm的結(jié)腸,分為兩部分放入4%多聚甲醛溶液中固定,一部分用于結(jié)腸組織病理學(xué)觀察,另一部分用于組織透明化。

    1.6 大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)觀察

    經(jīng)4%多聚甲醛固定24 h后的結(jié)腸組織通過(guò)石蠟切片、HE染色,在光學(xué)顯微鏡下觀察各組結(jié)腸組織形態(tài),并根據(jù)結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分[5]。每只大鼠的結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分為炎癥程度評(píng)分、損傷程度評(píng)分、隱窩損傷評(píng)分和病變范圍評(píng)分之和,評(píng)分范圍為0~14分。詳見(jiàn)表1。

    表1 大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

    1.7 CUBIC透明化三維成像

    采用以脫脂為主要原理的CUBIC透明化方法對(duì)各組大鼠結(jié)腸組織進(jìn)行透明化處理,主要包括組織透明、免疫熒光染色、折射率匹配、顯微鏡成像和三維數(shù)據(jù)處理。結(jié)腸組織在4%多聚甲醛中4 ℃過(guò)夜固定,在室溫下采用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline, PBS)清洗固定的組織,再用約10 mL的組織透明液在37 ℃搖床上搖晃浸泡至透明,再用PBS室溫洗脫透明液3次,每次2 h。用含5%牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)的PBS溶液按照1:100的稀釋比例配制一抗溶液(CD31),37 ℃恒溫孵育2 d;用PBS溶液清洗去除一抗溶液,37 ℃恒溫?fù)u床清洗1 d;在避光條件下用含5% BSA的PBS溶液按照1:100的稀釋比例配制二抗溶液,37 ℃恒溫避光孵育2 d;用PBS溶液清洗去除二抗溶液,37 ℃恒溫?fù)u床避光清洗1 d。結(jié)腸組織采用血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子1(platelet endothelial cell adhesion molecule 1, PECAM-1/CD31)染色標(biāo)記后,進(jìn)行折射率匹配,即可光片顯微鏡成像。顯微鏡獲取的原始數(shù)據(jù)通過(guò)LS18 ImageCombine軟件[锘海生物科學(xué)儀器(上海)股份有限公司]數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換后借助Imaris三維圖像處理軟件進(jìn)行處理。通過(guò)軟件分析功能“surface”“filament”半自動(dòng)重構(gòu)血管線狀結(jié)構(gòu),待相關(guān)操作完成后即可查看重構(gòu)后結(jié)腸血管測(cè)量值,包括平均血管密度、分支級(jí)數(shù)和直徑等。

    1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析,若服從正態(tài)分布且方差齊時(shí),組間比較采用方差分析()中的最小顯著性差異();方差不齊時(shí),組間比較采用-,結(jié)果均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。若不服從正態(tài)分布,則采用非參數(shù)檢驗(yàn)中的秩和檢驗(yàn),結(jié)果采用中位數(shù)和四分位數(shù)間距[(25,75)]表示。以<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

    2 結(jié)果

    2.1 大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)觀察

    光學(xué)顯微鏡顯示,正常組大鼠結(jié)腸黏膜上皮組織結(jié)構(gòu)完整,腺體排列規(guī)則,無(wú)潰瘍及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等病理改變。模型組大鼠結(jié)腸損傷嚴(yán)重,黏膜上皮組織缺失,腺體排列紊亂,結(jié)腸黏膜充血水腫,可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)以及潰瘍,多累及黏膜、黏膜下層,嚴(yán)重者深達(dá)肌層,呈裂隙樣改變,部分大鼠可見(jiàn)隱窩輕度或中度損傷。隔藥灸組大鼠結(jié)腸組織損傷明顯改善,結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)尚完整,腺體排列較規(guī)則,炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度較模型組顯著減輕,并可見(jiàn)新生的黏膜上皮修復(fù)。抑制劑組大鼠結(jié)腸組織損傷程度也較模型組明顯減輕,腸上皮結(jié)構(gòu)尚完整,腺體結(jié)構(gòu)基本正常,潰瘍有愈合傾向,炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度較模型組減少,黏膜下層可見(jiàn)少量充血,可見(jiàn)新生的黏膜上皮修復(fù)。詳見(jiàn)圖1。

    由表2可見(jiàn),與正常組比較,模型組結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(<0.01)。與模型組比較,隔藥灸組和抑制劑組結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分均顯著降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均<0.01);隔藥灸組和抑制劑組結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(>0.05)。

    表2 各組大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分比較 [M(P25,P75),分]

    注:與正常組比較1)<0.01;與模型組比較2)<0.01

    圖1 各組大鼠結(jié)腸組織HE染色(×200)

    2.2 大鼠結(jié)腸組織透明過(guò)程

    由圖2可見(jiàn),在心臟灌注后取出結(jié)腸組織,首先用4%多聚甲醛固定1 d后,結(jié)腸組織呈不透明的淡黃色。在經(jīng)過(guò)透明液浸泡1周及折射率匹配液處理后,結(jié)腸組織呈完全透明狀態(tài)即可光片顯微鏡成像,整個(gè)結(jié)腸組織透明過(guò)程歷時(shí)8 d。待組織完全透明之后截取其中一部分進(jìn)行后續(xù)免疫熒光染色和三維圖像分析。

    圖2 使用CUBIC組織透明的過(guò)程示意圖

    2.3 大鼠結(jié)腸組織血管網(wǎng)絡(luò)三維重構(gòu)分析

    免疫熒光染色用PI標(biāo)記細(xì)胞核,CD31標(biāo)記結(jié)腸組織的血管內(nèi)皮細(xì)胞,可以完整重構(gòu)結(jié)腸組織血管網(wǎng)絡(luò)。由圖3可見(jiàn),模型組大鼠結(jié)腸血管網(wǎng)較正常組明顯密集,分支血管走行凌亂且數(shù)量增多;隔藥灸組和抑制劑組大鼠結(jié)腸血管網(wǎng)密集程度和血管分支數(shù)目均較模型組降低,分支血管走行凌亂程度也較模型組顯著降低,而隔藥灸組和抑制劑組之間無(wú)明顯差異。

    通過(guò)Imaris軟件對(duì)結(jié)腸內(nèi)部血管進(jìn)行“Crop”截取并對(duì)血管部位進(jìn)行放大,隨機(jī)選取其中5個(gè)不同部位進(jìn)行平均血管密度、分支等級(jí)和血管直徑統(tǒng)計(jì)和分析。由表3可見(jiàn),與正常組比較,模型組大鼠結(jié)腸組織平均血管密度顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(<0.01);與模型組比較,隔藥灸組和抑制劑組結(jié)腸組織平均血管密度均顯著降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(<0.05);隔藥灸組和抑制劑組結(jié)腸組織平均血管密度比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(>0.05)

    注:藍(lán)色為PI標(biāo)記細(xì)胞核,紅色為CD31血管內(nèi)皮細(xì)胞染色顯示血管;第一行為原始三維重構(gòu),第二行為surface分析,第三行

    表3 各組大鼠結(jié)腸組織平均血管密度比較 [M(P25,P75)]

    注:與正常組比較1)<0.01;與模型組比較2)<0.05

    由表4可見(jiàn),與正常組比較,模型組大鼠結(jié)腸組織平均血管分支等級(jí)顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(<0.01);與模型組比較,隔藥灸組和抑制劑組結(jié)腸平均血管分支等級(jí)顯著降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(<0.01);隔藥灸組和抑制劑組結(jié)腸組織平均血管分支等級(jí)比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(>0.05)。

    表4 各組大鼠結(jié)腸組織平均血管分支等級(jí)比較 [M(P25,P75)]

    注:與正常組比較1)<0.01;與模型組比較2)<0.01

    由表5可見(jiàn),與正常組比較,模型組大鼠結(jié)腸組織平均血管直徑顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(<0.01);與模型組比較,隔藥灸組和抑制劑組結(jié)腸組織平均血管直徑均顯著升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(<0.01,<0.05);隔藥灸組和抑制劑組結(jié)腸組織平均血管直徑比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(>0.05)。

    表5 各組大鼠結(jié)腸組織平均血管直徑比較[M(P25,P75), mm]

    注:與正常組比較1)<0.01;與模型組比較2)<0.01,3)<0.05

    3 討論

    2-4-6三硝基苯磺酸可誘發(fā)大鼠腸道免疫反應(yīng),其誘導(dǎo)的大鼠結(jié)腸炎模型具有體質(zhì)量減輕、腹瀉、結(jié)腸組織病理學(xué)改變等特點(diǎn),與人類IBD發(fā)病機(jī)制和病理特點(diǎn)具有很大的相似性,是研究IBD較為廣泛的一種動(dòng)物模型[6]。目前,TNBS誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎模型被廣泛應(yīng)用于IBD發(fā)病機(jī)制研究、新型藥物作用靶點(diǎn)的研發(fā)實(shí)驗(yàn)中[7-8]。本研究使用5%TNBS和50%乙醇溶液誘導(dǎo)大鼠結(jié)腸炎模型,誘導(dǎo)4周后大鼠結(jié)腸出現(xiàn)腺體破壞、大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),并有充血水腫、潰瘍,潰瘍呈裂隙樣改變,結(jié)腸組織受損明顯,以上結(jié)果說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)所采用TNBS誘導(dǎo)大鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎模型造模成功。

    近年來(lái),中醫(yī)藥尤其是針灸在治療IBD方面優(yōu)勢(shì)明顯,得到了越來(lái)越多的關(guān)注和認(rèn)可。國(guó)內(nèi)外臨床研究表明,針灸治療IBD具有良好的臨床療效,可有效改善IBD患者腸道炎癥,降低疾病活動(dòng)指數(shù),同時(shí)還能明顯改善患者生活質(zhì)量和總體幸福感[9-11]。艾灸作為中醫(yī)學(xué)的重要組成部分,可從多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)調(diào)節(jié)機(jī)體生理平衡,且具有安全性高、復(fù)發(fā)率低及遠(yuǎn)期療效好等優(yōu)勢(shì),在治療IBD的臨床中具有廣泛的應(yīng)用前景[12-14]。大量研究也表明,艾灸可以通過(guò)調(diào)節(jié)基因表達(dá)、調(diào)控相關(guān)炎癥因子水平等,起到降低腸道炎癥反應(yīng)、保護(hù)腸黏膜屏障、糾正腸道菌群失調(diào)、減輕結(jié)腸組織纖維化等作用,從而達(dá)到治療IBD的目的[15-17]。

    組織器官三維結(jié)構(gòu)信息的獲取長(zhǎng)久以來(lái)均為生物學(xué)領(lǐng)域的研究重點(diǎn)之一。隨著共聚焦顯微鏡的研發(fā)和大數(shù)據(jù)采集處理系統(tǒng)以及計(jì)算機(jī)重建技術(shù)的不斷發(fā)展與優(yōu)化,組織器官成像由傳統(tǒng)的二維組織切片發(fā)展到三維成像技術(shù)[18],其中具有成像深度高等優(yōu)點(diǎn)的組織透明化技術(shù)可從組織器官的宏觀層面研究神經(jīng)、脈管系統(tǒng)、蛋白質(zhì)、核酸等結(jié)構(gòu),能完整準(zhǔn)確地反映機(jī)體生理、病理狀態(tài)下組織器官結(jié)構(gòu)的細(xì)微變化,將人們帶入了完整組織器官成像的全新領(lǐng)域?,F(xiàn)代許多臨床研究表明艾灸在改善結(jié)腸炎患者臨床癥狀、控制病情活動(dòng)、維持緩解方面具有較好的療效[19-20],而組織透明化技術(shù)能從宏觀和微觀角度觀察組織整體結(jié)構(gòu),與針灸的整體調(diào)節(jié)特點(diǎn)相契合。有研究采用組織透明化技術(shù)通過(guò)三維成像揭示卵巢的卵泡結(jié)構(gòu)和血管系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)變化,并發(fā)現(xiàn)電針能夠促進(jìn)多囊卵巢綜合征大鼠有腔卵泡血管生成和卵巢門附近血管神經(jīng)支配,進(jìn)而促進(jìn)卵泡成熟、排卵和黃體的形成,從而恢復(fù)其病理生理[21-23]。除了提供平臺(tái)來(lái)研究血管新生在卵巢疾病中的作用外,通過(guò)組織透明化技術(shù)還可以從整體組織器官水平研究針灸對(duì)其他優(yōu)勢(shì)病種的效應(yīng)機(jī)理,如從整體水平觀察IBD的腸道、帕金森病的神經(jīng)系統(tǒng)等,為腸道等組織高分辨率三維結(jié)構(gòu)和生物功能等研究提供了有利的技術(shù)支持。

    本研究采用組織透明化技術(shù)研究隔藥灸對(duì)結(jié)腸炎大鼠血管生成的作用,結(jié)果發(fā)現(xiàn)隔藥灸治療可改善TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎大鼠模型組織病理學(xué)改變,對(duì)大鼠結(jié)腸炎具有較好的治療效果,其作用機(jī)制可能與抑制結(jié)腸血管生成有關(guān)。血管生成是IBD發(fā)病機(jī)制的重要組成部分,其主要包括內(nèi)皮細(xì)胞的刺激,基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)的降解,血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和粘附,重建形成新的血管和血管網(wǎng)[24]。慢性炎癥和血管生成是兩個(gè)密切相關(guān)的過(guò)程。缺氧時(shí),巨噬細(xì)胞和其他炎癥細(xì)胞遷移到缺氧區(qū),分泌多種血管生成因子,刺激內(nèi)皮細(xì)胞,激活血管生成的初始環(huán)節(jié)。反之,血管生成又可通過(guò)白細(xì)胞遷移、攜帶氧氣、細(xì)胞因子和黏附分子等來(lái)增強(qiáng)機(jī)體炎癥反應(yīng)[25],并在IBD腸道炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。血管生成由促血管生成因子及其配體協(xié)調(diào)完成,其中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)是最主要的血管生成因子,它們與3種特異性受體(VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3)結(jié)合在IBD的發(fā)病中起著重要作用。有研究發(fā)現(xiàn),在結(jié)腸炎患者的結(jié)腸中,黏膜微血管密度顯著高于健康人,腸道炎癥病灶中VEGF水平也顯著升高[26]。本研究中模型組大鼠結(jié)腸血管網(wǎng)變密集,分支血管走行凌亂且數(shù)量增多,其血管密度顯著高于正常組大鼠,與以往研究類似。

    IBD患者腸道血管結(jié)構(gòu)改變和重構(gòu)是由于體內(nèi)VEGF高表達(dá),抗血管生成治療可減輕炎癥活動(dòng)程度。目前,越來(lái)越多的研究表明抗血管生成成為治療IBD的重要環(huán)節(jié),VEGF在結(jié)腸炎中可誘發(fā)病理學(xué)血管生成,增加微血管密度,導(dǎo)致血管收縮、微血栓形成,同時(shí)提高血管通透性、加重炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)[27]。而抗血管生成藥能夠通過(guò)靶向降低VEFG的表達(dá)來(lái)抑制IBD患者血管生成[28]。本研究中隔藥灸組和VEFGR抑制劑組大鼠結(jié)腸血管網(wǎng)密集程度和血管分支數(shù)目均降低,分支血管走行凌亂程度也較模型組大鼠顯著降低,其血管密度顯著降低。同時(shí),隔藥灸組和VEGFR抑制劑組大鼠結(jié)腸血管復(fù)雜度等級(jí)顯著降低。以上結(jié)果提示隔藥灸治療可能是通過(guò)抑制結(jié)腸炎大鼠腸道血管生成,達(dá)到降低腸道炎癥反應(yīng)之目的。

    此外,本研究使用三維成像追蹤結(jié)腸血管生成打破常規(guī)的二維研究血管的局限,從三維角度揭示隔藥灸治療結(jié)腸炎的新機(jī)制,為隔藥灸應(yīng)用于臨床結(jié)腸炎的治療提供了更加強(qiáng)有力的實(shí)驗(yàn)資料和科學(xué)依據(jù)。與傳統(tǒng)的二維組織學(xué)相比,經(jīng)透明化處理的標(biāo)本可以對(duì)腫瘤進(jìn)行更準(zhǔn)確、客觀的分析,因此未來(lái)可以應(yīng)用組織透明化技術(shù)處理結(jié)腸炎相關(guān)性癌變動(dòng)物模型的結(jié)腸組織,標(biāo)記血管生成等的相關(guān)蛋白,從三維角度研究針灸對(duì)結(jié)腸炎相關(guān)性癌變血管生成等方面的作用機(jī)理,為臨床提供可視化診斷和治療依據(jù)。

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    Study of the Effect of Moxibustion on Intestinal Angiogenesis in Colitis Rats Using Three-dimensional Imaging

    1,-2,-1,-3,-3,1,-3,-3,-1,2,-3.

    1.,,200030,; 2.,,,200032,; 3.,200030,

    To observe the effect of herb-partitioned moxibustion on intestinal angiogenesis in rats with experimental colitis induced by TNBS using tissue clearing technology, and to explore the potential mechanism of herb-partitioned moxibustion treatment of colitis at the three dimensional level.The colitis rat model was established by TNBS via enema, and the rats were randomly divided into a normal group, a model group, a herb-partitioned moxibustion group and an inhibitor group, with 8 rats in each group. The herb-partitioned moxibustion group was treated with herb-partitioned moxibustion at Tianshu (ST25) and Qihai (CV6); the inhibitor group received intraperitoneal injection of 10 mg/mL vascular endothelial growth factor receptor (VEGFR) inhibitor at 1 mL/kg. HE staining was used to observe the histopathological changes of colon tissues in each group; the CUBIC tissue clearing technique was used to clear rat colon tissues, the platelet endothelial cells were stained and labeled with PECAM-1/CD31, and Imaris three-dimensional image processing software was used to perform three-dimensional measurement and analysis of the colonic vascular network.HE staining result showed that the morphological structure of colon in the model group was disordered, the lamina propria of mucosa presented with obvious slit-like ulcers, and a large number of inflammatory cell infiltration; the above-mentioned pathological changes were alleviated in the herb-partitioned moxibustion group and the inhibitor group, along with mucosal epithelial repair. The three-dimensional measurement and analysis of colonic vascular network demonstrated that compared with the normal group, the colonic histopathology score increased significantly in the model group, the average colonic blood vessel density increased, the blood vessel branch grade increased, and the blood vessel diameter decreased; compared with the model group, the colonic histopathological score dropped significantly in the herb- partitioned moxibustion group and the inhibitor group, the average colonic blood vessel density decreased, the blood vessel branch grade decreased, and the blood vessel diameter increased; there were no significant differences between the herb-partitioned moxibustion group and the inhibitor group.Herb-partitioned moxibustion can effectively reduce intestinal inflammation and tissue damage, and inhibit colonic angiogenesis in colitis rats, thus achieving therapeutic effect for colitis.

    Acupuncture-moxibustion; Colitis; Herbal cake moxibustion therapy; Tissue Transparency; Angiogenesis; Three-dimensional imaging; TNBS

    R2-03

    A

    10.13460/j.issn.1005-0957.2021.13.0018

    1005-0957(2021)10-1267-08

    國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81973953,81973955,81674074);上海市衛(wèi)生計(jì)生委優(yōu)秀人才培養(yǎng)計(jì)劃項(xiàng)目(2018YQ11)

    祁琴(1992—),女,2018級(jí)博士生,Email:qqqiqin2478@126.com

    吳煥淦(1956—),男,教授,博士生導(dǎo)師,Email:wuhuangan@126.com

    馮異(1976—),女,教授,博士生導(dǎo)師,Email:fengyi17@fudan.edu.cn

    2021-01-31

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