超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定二陳湯中麻黃堿和甘草酸的含量

孔 瑋

（鎮(zhèn)江市第一人民醫(yī)院西藥庫 江蘇 鎮(zhèn)江 212000）

二陳湯由半夏、茯苓、橘紅與甘草等組成，其為中醫(yī)治痰通劑，既可祛已生之痰，亦可杜生痰之源，全方可共奏理氣和中與燥濕化痰之功[1]。高效液相測定成分含量低等中藥質(zhì)量標(biāo)志物難度較高，具有樣品處理復(fù)雜、精度不足與分析時間過長等缺點(diǎn)，超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）前處理相對簡單，可兼具分離、定量定性分析，適用于中藥成分定量、確證分析，具有選擇性佳、靈敏度高與分析時間短等優(yōu)勢[2-3]。鑒此，本研究探討超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定二陳湯中麻黃堿、甘草酸的含量。

1.儀器與材料

1.1 試驗(yàn)儀器

Quattra Premier 質(zhì)譜儀（色譜工作站：Masslynx 4.0）；MixOne 渦旋儀；SQP 電子天平；MICRO-17R 冷凍離心機(jī)；UPH-Ⅲ型優(yōu)普超純水機(jī)。

1.2 藥品與試劑

二陳湯處方藥材均購于濟(jì)南市建聯(lián)大藥房，藥材質(zhì)量均符合2015 年版《中華人民共和國藥典》規(guī)定，實(shí)驗(yàn)樣品均為自制，含3 批（200307，200313，200318）；鹽酸麻黃堿對照品，甘草酸對照品；水為超純水，乙腈、甲醇銨與甲酸為色譜純，其他試劑均為分析純。

2.方法與結(jié)果

2.1 色譜與質(zhì)譜條件

色譜與質(zhì)譜條件，見表1、2。麻黃堿、甘草酸質(zhì)譜，見表3。

表1 色譜條件

表2 質(zhì)譜條件

表3 麻黃堿、甘草酸質(zhì)譜參數(shù)

2.2 對照品溶液制備

精密稱量適量麻黃堿、甘草酸對照品，以50%乙腈水對麻黃堿、甘草酸對照品進(jìn)行溶解，制備成0.1 μg/mL麻黃堿溶液、0.02 μg/mL 甘草酸溶液，并對麻黃堿、甘草酸對照品溶液依次行倍比稀釋，得到含麻黃堿0.100、0.080、0.040、0.020、0.010、0.005 與0.003 μg/mL 濃度的對照品溶液，含甘草酸0.020、0.016、0.008、0.004、0.002、0.001 與0.001 μg/mL 濃度的對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

二陳湯組方含法半夏、橘紅各15 g、茯苓9 g 與甘草6 g。取一劑二陳湯飲片，加入飲片10 倍量的水，每次煎煮1 h，煎煮3 次后對水煎液進(jìn)行合并，于2 層紗布將濾液進(jìn)行濃縮，最后得到300 mL 湯液。精密吸取1 mL 并置于100 mL 量瓶中，應(yīng)用50%乙腈水溶液對其進(jìn)行溶解定容，在50 W、40 KHz 超聲下處理10 min，在12 000 r/min 離心5 min。取上清液1 mL 置于100 mL 量瓶中，以50%乙腈水稀釋即為供試品溶液。

2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取5 μL 各濃度含麻黃堿、甘草酸對照品溶液，以上述色譜條件進(jìn)樣測定，以橫坐標(biāo)（X）為濃度、縱坐標(biāo)（Y）為峰面積對標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行繪制，見表4。結(jié)果表明在相應(yīng)范圍內(nèi)麻黃堿、甘草酸濃度與峰面積呈良好線性關(guān)系。

表4 線性關(guān)系考察

2.5 精密度試驗(yàn)

選取0.080、0.020 與0.005 μg/mL 濃度麻黃堿對照品溶液，0.016、0.004 與0.001 μg/mL 濃度甘草酸對照品溶液，以5 μL 進(jìn)樣量分別重復(fù)進(jìn)樣5 次，以上述色譜條件進(jìn)樣測定，對峰面積進(jìn)行記錄。試驗(yàn)顯示：麻黃堿RSD 分別為1.84%、1.42%、1.53%（n = 5）；甘草酸RSD分別為1.93%、1.65%、2.51%（n = 5）。試驗(yàn)顯示儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

以上述方法將實(shí)驗(yàn)樣品（200307）制備為供試品溶液，以同樣色譜條件進(jìn)樣測定室溫進(jìn)樣室放置0、4、8、12與24 h 時的供試品溶液，對峰面積進(jìn)行記錄。試驗(yàn)顯示：麻黃堿峰面積RSD 為2.14%（n = 5），甘草酸峰面積RSD為1.98%（n = 5）。試驗(yàn)顯示24 h 內(nèi)室溫條件下試品溶液穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取批號200307 樣品，共6 份，以上述方法制備供試品溶液，以同樣色譜條件進(jìn)樣測定。試驗(yàn)顯示：麻黃堿含量RSD 為2.72%（n = 6），甘草酸峰面積RSD 為3.06%（n = 6）。試驗(yàn)顯示本研究方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密量取0.05 mL 批號為200307 的已知含量樣品，待各適量對照品溶液分別精密加入后，以上述方法進(jìn)行制備，待測定后計算回收率，見表5。

表5 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.9 樣品含量測定

取 二 陳 湯 實(shí) 驗(yàn) 樣 品3 批（200307，200313，200318），以上述方法制備供試品溶液，以同樣色譜條件進(jìn)樣測定，對3 批二陳湯實(shí)驗(yàn)樣品中麻黃堿、甘草酸含量進(jìn)行計算，見表6。

表6 樣品含量測定結(jié)果（μg/mL）

3.討論

現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，二陳湯方中具有橙皮苷、麻黃堿、甘草酸與齊墩果酸等多種有效成分，具有祛痰平喘、鎮(zhèn)咳、抗炎、抗菌、調(diào)節(jié)胃腸功能與止吐等多方面藥理作用[4]。麻黃堿具有抗炎、抗病毒、抗菌、鎮(zhèn)咳平喘、收縮血管與松弛平滑肌等藥理作用，具有良好的平喘功效，當(dāng)攝入過量時可能導(dǎo)致心動過速、血壓升高與平滑肌遲緩等不良反應(yīng)。甘草酸具有解毒、抗病毒、抗氧化與免疫調(diào)節(jié)等藥理作用，具有保肝、抗癌、增強(qiáng)免疫力等功效[5]。

二陳湯成分較為復(fù)雜，各成分相互干擾較嚴(yán)重，甘草酸紫外吸收弱且含量較低，應(yīng)用HPLC-UV 檢測難以定量分析其中活性成分。本研究應(yīng)用UPLC-MS/MS 同時測定二陳湯中麻黃堿、甘草酸含量，通過多反應(yīng)離子監(jiān)測對麻黃堿、甘草酸等成分進(jìn)行高選擇性、靈敏度定量分析，分析速度快。本研究比較不同規(guī)格色譜柱，選擇ACE Excel 3 C18（2.0 mm×100 mm，3 μm）所得色譜峰峰形較好，試驗(yàn)過程中對比流動相組成比例，依據(jù)考察結(jié)果，當(dāng)乙腈-2 mmol/L 甲酸銨水溶液（75 ∶25）時麻黃堿、甘草酸分離良好，具有較好的峰形且出峰時間短。同時分別嘗試應(yīng)用正、負(fù)兩種離子模式進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)在負(fù)離子模式下甘草酸具有較良好的響應(yīng)，在正離子模式下麻黃堿具有較良好的響應(yīng)，故選擇正、負(fù)離子同時進(jìn)行檢驗(yàn)。

在二陳湯麻黃堿、甘草酸成分含量檢測中應(yīng)用UPLCMS/MS 效果良好，具有靈敏度高、分析時間短與操作較簡單等優(yōu)勢，可為二陳湯質(zhì)量控制提供依據(jù)。