紫鴨跖草CpBURP的克隆、表達(dá)及生物信息學(xué)分析

彭國穎 盧山 黃超 楊坤 萬瑋 黃長干

（1. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)/南昌市植物資源化學(xué)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南昌 330045；2. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)校友辦，南昌 330045）

重金屬污染日益成為影響農(nóng)作物產(chǎn)量的重要因素，銅作為重金屬污染物之一，在污染土壤時(shí)具有毒性和高持久性，而植物修復(fù)技術(shù)［1］是一種很有潛力、且環(huán)保的清除環(huán)境污染的綠色技術(shù)，通過超積累植物吸收污染物來達(dá)到修復(fù)土壤、水及空氣的目的。目前，國內(nèi)外研究較多的超積累植物有東南景天（Sedum alfredii）［2］、蜈 蚣 草（Pteris vittata）［3］、藍(lán) 遏 菜（Thlaspi arvens）［4］、印 度 芥 菜（Brassica juncea）［5］、車前草（Herba plantaginis）［6］等植物。紫鴨跖草（Commelina purpurea）是一種超積累銅植物［7］，其耐受銅離子的能力強(qiáng)于其他普通植物，在修復(fù)銅污染的土地具有一定的潛力。因此，從分子水平上研究紫鴨跖草的耐銅機(jī)制具有重要的意義。

BURP蛋白為植物特有蛋白，由一類具有相似的初級(jí)結(jié)構(gòu)且含有BURP保守結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)［8］，在植物生長過程中，BURP蛋白不僅參與植物種子的生長發(fā)育，而且在植物抵抗非生物脅迫時(shí)也具有重要的作用［9］。BURP蛋白是由BNM2（小孢子蛋白）、USP（種子非儲(chǔ)存蛋白）、RD22（脫水反應(yīng)蛋白）和PG1β（多聚半乳糖醛酸酶同工酶）4種蛋白質(zhì)共同組成［10］，甘藍(lán)型油菜中的BNM2會(huì)參與甘藍(lán)型油菜的小孢子的產(chǎn)生及發(fā)育［11］；蠶豆種子中的USP參與種子的發(fā)育，Vokkaliga等［12］發(fā)現(xiàn)擬南芥USP基因的異位表達(dá)會(huì)影響種子的生長發(fā)育；RD22的發(fā)現(xiàn)源于擬南芥的脫水反應(yīng)蛋白，其是植物應(yīng)在非生物脅迫中的重要蛋白。José等［13］發(fā)現(xiàn)大豆GmRD22蛋白的異源表達(dá)會(huì)提高水稻對(duì)鹽脅迫的抗逆性，鐘活權(quán)［14］研究表明擬南芥受銅脅迫后，通過上調(diào)AtRD22的表達(dá)而提高自身的抗脅迫能力；番茄PG1β通過調(diào)節(jié)果實(shí)成熟過程中果膠的溶解的程度參與到果膠代謝中［15］。

目前，還未有關(guān)于紫鴨跖草BURP基因的報(bào)道。本研究依據(jù)紫鴨跖草的全長轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，應(yīng)用HMMER 3.0程序篩選出CpBURP，并克隆出CpBURP，通過運(yùn)用生物信息學(xué)軟件對(duì)CpBURP蛋白的理化性質(zhì)、保守結(jié)構(gòu)域、磷酸化位點(diǎn)、二/三級(jí)結(jié)構(gòu)、信號(hào)肽、跨膜結(jié)構(gòu)、亞細(xì)胞定位及對(duì)同源蛋白構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹等方面進(jìn)行探究分析，并利用qRT-PCR分析在Cu2+脅迫下紫鴨跖草根、莖、葉中的CpBURP表達(dá)量，為后期紫鴨跖草的BURP基因的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

剪取紫鴨跖草的嫩莖，用5 g/L高錳酸鉀溶液消毒后放進(jìn)霍格蘭氏營養(yǎng)液中培養(yǎng)，待培養(yǎng)30 d后，嫩根長成，分別在0、50、100和300 μmol/L Cu2+的霍格蘭氏營養(yǎng)液中培養(yǎng)4 d，以各Cu2+營養(yǎng)液培養(yǎng)的紫鴨跖草根、莖、葉為試驗(yàn)材料，取樣后迅速用液氮冷凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

以紫鴨跖草全長轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)作為篩選BURP基因的數(shù)據(jù)庫。

1.2 方法

1.2.1 基因的篩選與克隆 從Pfma數(shù)據(jù)庫中下載BURP基因家族保守結(jié)構(gòu)域的隱馬爾可夫模型（Pfam：PF03181），運(yùn)用HMMER 3.0程序在紫鴨跖草的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索篩選出一個(gè)基因，再利用SMART確定其編碼的蛋白具有BURP結(jié)構(gòu)域，利用NCBI確定其具有完整的開放閱讀框，將該基因命名為CpBURP。

采取Trizol法提取紫鴨跖草的總RNA，以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，依據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)CpBURP引物（CpBURP-F：5'-AACCCCTTCACTGCAAAGGC-3'，CpBURP-R：5'-ATCCGCGACGGTCCATGT-3'），進(jìn)行基因PCR擴(kuò)增。用1.5%瓊脂糖凝膠檢測(cè)、回收，將目的基因與載體pMDTM19-T連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，篩選陽性克隆進(jìn)行菌液擴(kuò)增并測(cè)序（普洛麥格克公司）。

1.2.2 CpBURP的生物信息學(xué)分析 運(yùn)用Expasy在線軟件分析蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)；運(yùn)用MotifSearch在線軟件分析蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域；運(yùn)用NetPhos 3.1 Server在線軟件分析蛋白質(zhì)的磷酸化位點(diǎn)；運(yùn)用Prabi在線軟分析蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)；運(yùn)用SWISSMODEL在線軟件分析蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)；運(yùn)用TMHMM在線軟件分析蛋白質(zhì)的信號(hào)肽；運(yùn)用SignalP 4.1 Server在線軟件分析蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)域；運(yùn)用PSOR在線軟件分析蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位；在NCBI中檢索擬南芥、蘋果（Malus domestica）、黃瓜（Cucumis sativus）、香瓜（Cucumis melo）、野大豆（Glycine soja Sieb）、花生（Arachis hypogaea）、木豆（Cajanus cajan）、水稻（Oryza sativa）、玉米（Zea mays）、刺毛黧豆（Mucunapruriens）、辣椒（Capsicum annuum）、甘藍(lán)型油菜、小蘭嶼蝴蝶蘭（Phalaenopsis equestris）等13個(gè)物種的BURP蛋白，運(yùn)用MEGA7軟件（neighbour joining tree法）將13個(gè)物種BURP蛋白與CpBURP蛋白構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹、并運(yùn)用EVOLVIEW在線軟件美化。

1.2.3 CpBURP的qRT-PCR分析 選取泛素連接酶（Ubiquitin，UBI）基因（UBI-F：5'-AGCACTCTTCACCTCGTCC-3'；UBI-R：5'-CTTCGCCTTCACATTCTC-3'）作為內(nèi)參基因，分析CpBURP（F：5'-TTTGAAGTTTAGTAACTATGATGCG-3'；R：5'-CATTCCCATCTTGCGCATAGTTCAT-3'）的表達(dá)。利用實(shí)時(shí)熒光定量儀LightCycler 480 System進(jìn)行反應(yīng)，每個(gè)反應(yīng)進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。qRT-PCR反應(yīng)程序如圖1，運(yùn)用2-△△Ct法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

圖1 qRT-PCR擴(kuò)增程序Fig.1 Amplification procedure of qRT-PCR

2 結(jié)果

2.1 CpBURP的克隆

以紫鴨跖草的cDNA為模板，以CpBURP-F和CpBURP-R為引物擴(kuò)增出一條1 383 bp的特異性條帶（圖2-A），經(jīng)菌液PCR檢測(cè)（圖2-B）和測(cè)序，結(jié)果表明，該條帶為目的基因。

圖2 CpBURP的擴(kuò)增和PCR檢測(cè)Fig.2 Amplification and PCR detection of CpBURP

2.2 CpBURP蛋白理化性質(zhì)分析

CpBURP可編碼含460個(gè)氨基酸的蛋白（圖3），分子量為49.3 kD，分子式為C2153H3260N594O710S15，脂肪系數(shù)為56.37。帶負(fù)電荷的殘基總數(shù)（Asp+Glu）為51，帶正電荷的殘基總數(shù)（Arg+Lys）為42，等電點(diǎn)（pI）為5.46。CpBURP的不穩(wěn)定系數(shù)為26.91，為穩(wěn)定蛋白；CpBURP蛋白的總平均親水系數(shù)為-0.448，為親水蛋白（圖4）。

圖3 CpBURP核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列Fig. 3 CpBURP nucleotide sequence and its encoded amino acid sequence

圖4 CpBURP蛋白的親疏水性分析Fig.4 Hydrophilic and hydrophobic analysis of CpBURP protein

2.3 CpBURP蛋白保守結(jié)構(gòu)域

通過分析CpBURP蛋白的保守結(jié)構(gòu)域（圖5），發(fā)現(xiàn)CpBURP蛋白的氨基酸序列具有一個(gè)BURP保守結(jié)構(gòu)域，說明CpBURP屬于BURP基因家族。

圖5 CpBURP蛋白的保守結(jié)構(gòu)域Fig.5 Conserved domain of CpBURP protein

2.4 CpBURP蛋白的磷酸化位點(diǎn)

CpBURP蛋白共含有50個(gè)磷酸化位點(diǎn)（圖6），分別是31個(gè)絲氨酸（serine）位點(diǎn)、14個(gè)蘇氨酸（threonine）位點(diǎn)和5個(gè)酪氨酸（tyrosine）位點(diǎn)。

圖6 CpBURP蛋白的磷酸化位點(diǎn)Fig. 6 Phosphorylation sites of CpBURP protein

2.5 CpBURP蛋白的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)

CpBURP蛋白的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)如圖7所示，CpBURP蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)是由21.09%的α螺旋、27.39%的延伸鏈、6.74%的β轉(zhuǎn)角和44.78%無規(guī)卷曲組成。

圖7 CpBURP蛋白的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)分析Fig.7 Analysis of the secondary and tertiary structure of CpBURP protein

2.6 CpBURP蛋白的信號(hào)肽及跨膜結(jié)構(gòu)域分析

跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖（圖8-A）顯示CpBURP蛋白不含跨膜結(jié)構(gòu)，表明CpBURP蛋白不是跨膜蛋白；信號(hào)肽預(yù)測(cè)圖（圖8-B）顯示CpBURP蛋白不含信號(hào)肽，表明CpBURP蛋白不是分泌蛋白。

圖8 CpBURP的跨膜結(jié)構(gòu)和信號(hào)肽分析Fig.8 Transmembrane structure and signal peptide prediction of CpBURP

2.7 CpBURP蛋白亞細(xì)胞定位

CpBURP蛋白的亞細(xì)胞定位分析表明：CpBURP蛋白定位在細(xì)胞質(zhì)的可能性最高，概率為0.450；其次是過氧化物酶體，概率為0.449；定位在線粒體基質(zhì)和溶酶體可能性較低，概率均為0.100。因此，推斷CpBURP蛋白作用于細(xì)胞質(zhì)和過氧化酶體中的可能性較大。

2.8 構(gòu)建BURP蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹

為了探究紫鴨跖草CpBURP蛋白與其他植物BURP蛋白之間的親緣關(guān)系，將CpBURP蛋白與13種植物的BURP蛋白構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖9）。系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，14個(gè)物種的53個(gè)BURP蛋白分為6個(gè)亞類，其中CpBURP蛋白與甘藍(lán)型油菜的BURP蛋白親緣性最高，其次是擬南芥的BURP蛋白。

圖9 不同物種BURP蛋白與CpBURP蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.9 Phylogenetic tree analysis of BURP proteins and CpBURP protein of different species

2.9 Cu2+脅迫下CpBURP的表達(dá)差異分析

qRT-PCR分析結(jié)果如圖10所示，CpBURP在根中表達(dá)量最高，其次是葉和莖。隨著Cu2+濃度的增加，根、莖、葉中的CpBURP表達(dá)量均是先升高再降低，其中，根中CpBURP在100 μmol/L Cu2+脅迫后表達(dá)量最高，較對(duì)照組（0 μmol/L Cu2+）的表達(dá)量增加了約1倍，說明CpBURP在紫鴨跖草抵抗Cu2+脅迫中具有一定的調(diào)控作用。

圖10 CpBURP在Cu2+脅迫下的表達(dá)變化Fig.10 Expression changes of CpBURP under Cu2+ stress

3 討論

BURP蛋白在許多植物中已被鑒定出，這類蛋白質(zhì)在植物無融合生殖、種子的生長發(fā)育、果膠代謝以及在重金屬離子、鹽、外源脫落酸、干旱等脅迫應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮重要的功能［16］。目前對(duì)BURP基因的研究大多集中于模式植物（擬南芥）［17］、糧食作物（水稻、玉米等作物）［18］和經(jīng)濟(jì)作物（甘藍(lán)型油菜、蠶豆和番茄等作物）［19］，隨著越來越多植物成為基因材料研究的對(duì)象及新植物的基因組測(cè)序完成，更多物種的BURP基因?qū)?huì)被發(fā)掘并報(bào)道出，BURP基因的功能及作用機(jī)制也將進(jìn)一步被擴(kuò)展。紫鴨跖草作為一種超積累銅植物，且BURP蛋白具有抗銅脅迫的功能，因此研究CpBURP對(duì)深入了解紫鴨跖草的耐銅機(jī)制具有一定的推動(dòng)作用。

因紫鴨跖草暫無基因組數(shù)據(jù)庫，本研究采用紫鴨跖草轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，利用BURP蛋白的Pfam模型在HMMER 3.0程序搜索并篩選出CpBURP。本研究從紫鴨跖草中克隆出CpBURP，再利用生物信息學(xué)分析了CpBURP蛋白結(jié)構(gòu)特征、功能，運(yùn)用qRTPCR分析CpBURP的表達(dá)模式。CpBURP蛋白是穩(wěn)定蛋白和親水蛋白；含磷酸化位點(diǎn)和BURP保守結(jié)構(gòu)域，不含跨膜結(jié)構(gòu)和信號(hào)肽結(jié)構(gòu)，預(yù)測(cè)CpBURP蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)和過氧化酶體中的概率較大。CpBURP蛋白與擬南芥和甘藍(lán)型油菜的BURP蛋白親緣性較高，進(jìn)一步確定CpBURP是BURP基因。CpBURP在紫鴨跖草各組織中均有表達(dá)，在Cu2+脅迫時(shí)，根的CpBURP表達(dá)量明顯增加，說明根中CpBURP表達(dá)有利于紫鴨跖草抵抗Cu2+脅迫。

與動(dòng)物相比，植物不能進(jìn)行遷移，因此在應(yīng)對(duì)生長發(fā)育過程中的各種外界環(huán)境因素的脅迫時(shí)，植物都會(huì)具有自己獨(dú)特的防御系統(tǒng)及應(yīng)對(duì)機(jī)制，例如馬鈴薯（Solanum tuberosum）調(diào)節(jié)WRKY應(yīng)對(duì)干旱脅迫［20］、葡萄（Vitis vinifera）調(diào)節(jié)MATE應(yīng)對(duì)鹽脅迫［21］、馬藺（Iris lactea）調(diào)節(jié)HMA3應(yīng)對(duì)重金屬鎘脅迫［22］、小黑楊（Opulus simonii×Populus nigra）調(diào)節(jié)CCH10應(yīng)對(duì)重金屬銅的脅迫［23］等。BURP基因作為一種植物特有基因，不僅參與應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫，還在植物的生長發(fā)育過程中起著重要的作用。到目前為止，還沒有關(guān)于對(duì)紫鴨跖草BURP基因/蛋白的研究分析，本研究首次從紫鴨跖草中分離出CpBURP，并運(yùn)用生物學(xué)工具及qRT-PCR對(duì)其進(jìn)行全面分析，為后續(xù)深入解析超積累銅植物紫鴨跖草的BURP基因功能及作用機(jī)制上提供參考依據(jù)。

4 結(jié)論

克隆了全長為1 383 bp的CpBURP，其編碼的CpBURP蛋白含有BURP保守結(jié)構(gòu)域，為親水蛋白，與甘藍(lán)型油菜的BURP蛋白具有較高同源性。CpBURP在根中的表達(dá)量最高，且Cu2+脅迫明顯能提高紫鴨跖草根的CpBURP表達(dá)量。CpBURP極有可能參與紫鴨跖草的耐銅應(yīng)答。