發(fā)酵TMR應(yīng)用及其微生物種群演替規(guī)律研究進展

江迪 徐春城

（1. 河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院，鄭州 450001；2. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)工學(xué)院，北京 100083）

畜牧業(yè)是我國現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的重要組成部分，隨著我國人民生活水平的不斷提高，人們對肉蛋奶等畜產(chǎn)品的需求量越來越大。2019年全年肉蛋奶產(chǎn)量約為1.4億t，其中牛奶產(chǎn)高達3 201萬t，與2018年相比增長4.1%，同比增長率創(chuàng)下了近5年的新高［1］。畜產(chǎn)品需求量的穩(wěn)步增長促使我國飼料糧的需求量不斷增加，糧食的供求長期處于緊平衡狀態(tài)，其中飼料用糧占糧食消費的40%以上，超過人對糧食的消費，“人畜爭糧”問題嚴重［1-2］。因此，為了緩解飼料糧對我國糧食產(chǎn)業(yè)的巨大壓力，減少畜牧業(yè)對糧食的依賴，加強非常規(guī)飼料資源的開發(fā)利用對促進我國畜牧業(yè)的發(fā)展至關(guān)重要。我國非常規(guī)飼料資源豐富每年近40億t。然而這些飼料資源通常因為水分含量高、營養(yǎng)成分不均衡、適口性差、消化率低等問題導(dǎo)致其應(yīng)用范圍受到限制［3］。發(fā)酵全混合日糧（total mixed ration silage，TMR）作為一種在TMR調(diào)制加工技術(shù)上發(fā)展起來的新型飼喂技術(shù)，其推廣和普及能夠有效利用非常規(guī)飼料資源，緩解飼料資源短缺制約我國畜牧業(yè)穩(wěn)定發(fā)展的難題［4］。由于發(fā)酵TMR厭氧發(fā)酵過程中的環(huán)境復(fù)雜，其微生物組成也多種多樣。因此飼料中的微生物組成對飼料的發(fā)酵品質(zhì)及有氧穩(wěn)定性都有重要作用。本文通過綜合閱讀近些年國內(nèi)外關(guān)于發(fā)酵TMR研究的文獻，對TMR發(fā)酵過程及有氧狀態(tài)下的微生物種群進行分析，初步總結(jié)了發(fā)酵TMR應(yīng)用及其微生物種群多樣性的研究現(xiàn)狀。

1 發(fā)酵TMR技術(shù)及應(yīng)用

1.1 發(fā)酵TMR的加工工藝

發(fā)酵TMR是根據(jù)家畜不同生產(chǎn)階段的營養(yǎng)需要和飼料原料的營養(yǎng)價值，設(shè)計科學(xué)合理的日糧配方，經(jīng)過乳酸菌厭氧發(fā)酵調(diào)制而成的一種營養(yǎng)平衡的日糧。日本早在20世紀90年代開始發(fā)酵TMR技術(shù)的研究，通過該方法使高水分食品副產(chǎn)物等非常規(guī)飼料能夠長期貯藏并有效利用。發(fā)酵TMR技術(shù)融合了TMR技術(shù)與青貯技術(shù)，不僅能夠有效保全了TMR的營養(yǎng)成分，同時發(fā)酵產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)又增加了飼料的附加價值［5］。由于飼料的質(zhì)量通常會直接影響奶牛的產(chǎn)奶量、乳品質(zhì)、泌乳年限及奶牛健康，因此，需要根據(jù)奶牛生長階段的營養(yǎng)需求對配方進行嚴格的設(shè)計。一般來說，用于調(diào)制發(fā)酵TMR的原料主要包括以下飼料（表1）。我國每年有大量的糟渣、秸稈等農(nóng)產(chǎn)品加工副產(chǎn)物產(chǎn)生，然而利用率都不高，不但造成資源的浪費，同時還污染環(huán)境。利用農(nóng)產(chǎn)品加工副產(chǎn)物調(diào)制發(fā)酵TMR能夠充分開發(fā)利用非常規(guī)飼料資源，在一定程度上解決我國飼料糧資源的不足，緩解人畜爭糧的矛盾，保護環(huán)境。利用高水分的農(nóng)產(chǎn)品加工副產(chǎn)物與其他原料混合后制備發(fā)酵TMR，不僅能夠有效保存原料中的營養(yǎng)成分、提高有機酸、酶、維生素等功能性成分的含量，加之TMR的發(fā)酵品質(zhì)良好，而且有氧穩(wěn)定性得到顯著提高，促進了發(fā)酵TMR的商品化流通［6］。

表1 發(fā)酵TMR的原料組成Table 1 Raw material composition of TMR silage

1.2 發(fā)酵TMR的生產(chǎn)應(yīng)用

在我國，規(guī)模化牛場已經(jīng)采用TMR 飼喂技術(shù)。TMR 飼喂方式能夠有效避免奶牛挑食和營養(yǎng)失衡狀況的發(fā)生；而且能夠增強瘤胃機能，維持瘤胃pH穩(wěn)定，降低奶牛發(fā)病率。發(fā)酵TMR作為一種在TMR調(diào)制加工技術(shù)上發(fā)展起來的新型飼喂技術(shù)，不僅能夠提高飼料適口性，同時能夠進一步提高飼料價值，保證奶牛機體健康，提高奶制品品質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，奶牛飼喂發(fā)酵TMR后，干物質(zhì)采食量（DMI）相比于對照組有了顯著的提升；同時，4%的標準乳、乳蛋白和乳糖均提高了10%以上，這些結(jié)果表明發(fā)酵TMR 對營養(yǎng)物質(zhì)在反芻動物消化吸收的過程中均具有較好促進效果［7］。以咖啡渣、蘑菇渣、桃渣等農(nóng)產(chǎn)品加工副產(chǎn)物替代部分精料、干草等常規(guī)原料調(diào)制TMR，經(jīng)過發(fā)酵后，其乳酸含量顯著提高、pH和氨態(tài)氮含量顯著降低，顯著改善了TMR的發(fā)酵品質(zhì)；提高了發(fā)酵TMR的適口性、增加了家畜的干物質(zhì)采食量；且不影響發(fā)酵TMR的營養(yǎng)物質(zhì)消化率及可消化養(yǎng)分總量和消化能；對家畜的血液指標、瘤胃發(fā)酵性狀無不良影響，同時，像綠茶飲料渣等還能提高家畜的免疫性能［8-11］?？梢?，使用高水分副產(chǎn)物代替部分原料制備發(fā)酵TMR，不僅能夠得到品質(zhì)較好的發(fā)酵飼料，而且能夠降低生產(chǎn)成本，增加經(jīng)濟效益。一些營養(yǎng)成分較少，適口性差的作物秸稈單獨作為飼料使用時，其能量和消化率都比較低，然而當使用這類原料與副產(chǎn)物共同調(diào)制TMR發(fā)酵后，能夠有效保持其營養(yǎng)成分，提高飼喂價值［12-14］。而且，與某一原料單獨青貯相比，將其與其他原料混合調(diào)制發(fā)酵TMR后無論適口性還是貯藏性都得到了較大的提高［15］。苜蓿是奶牛等草食動物的重要優(yōu)質(zhì)飼草，但由于水分含量高，可溶性碳水化合物含量低，緩沖能較高，青貯過程中極易發(fā)生丁酸發(fā)酵，導(dǎo)致飼草品質(zhì)下降。而將新鮮苜蓿與玉米粉、豆?jié){渣、豆粕、預(yù)混料等混合調(diào)制發(fā)酵TMR后，有效解決了苜蓿難以獲得優(yōu)質(zhì)青貯的技術(shù)瓶頸［16］。此外，TMR暴露在空氣中48 h內(nèi)即發(fā)生好氧變質(zhì)，而發(fā)酵TMR暴露在空氣中7 d內(nèi)無顯著變化，表現(xiàn)出相當好的有氧穩(wěn)定性；且隨著發(fā)酵時間的延長，有氧穩(wěn)定性顯著增強［17-18］。

2 發(fā)酵TMR好氧變質(zhì)及其微生物影響因素

2.1 發(fā)酵TMR好氧變質(zhì)

TMR厭氧發(fā)酵過程是一個微生物主導(dǎo)的復(fù)雜生物化學(xué)過程。TMR經(jīng)過厭氧發(fā)酵后，以乳酸菌為主的有益菌，將飼料中的可溶性糖轉(zhuǎn)化為以乳酸為主的有機酸，迅速降低pH，抑制其他好氧微生物對飼料營養(yǎng)成分的降解作用，從而使飼料得到很好的保存。當發(fā)酵TMR開封后暴露在空氣中，好氧微生物在有氧狀態(tài)下快速增殖，飼料中的發(fā)酵酸和其他底物會被酵母、好氧細菌及霉菌利用，導(dǎo)致飼料發(fā)熱、pH升高、營養(yǎng)物質(zhì)損失而發(fā)生變質(zhì)［19］。發(fā)生變質(zhì)的飼料干物質(zhì)損失嚴重，其營養(yǎng)價值會隨著發(fā)酵產(chǎn)物的消耗而降低［20-21］。同時，由于有害微生物的孢子以及代謝過程中毒素的積累［22-25］，奶牛的健康和牛奶的品質(zhì)也會受到不良影響，進而影響新鮮牛奶和奶制品的安全［5，26-28］。

2.2 好氧變質(zhì)過程中的微生物影響因素

發(fā)酵TMR的好氧變質(zhì)一般經(jīng)歷3個階段［27］，當氧氣進入到飼料后，酵母首先利用發(fā)酵過程中產(chǎn)生的有機酸和殘存的可溶性糖大量繁殖，快速提高飼料的溫度和pH，為其他微生物的生長提供有利環(huán)境［24］；隨著pH的升高，好氧細菌開始增殖，進一步消耗飼料中的營養(yǎng)成分，升高飼料溫度；最后，霉菌在表面大量生長，飼料完全變質(zhì)［19］。發(fā)酵TMR發(fā)生好氧變質(zhì)的過程中一般會出現(xiàn)兩個溫度高峰［29］，第一個溫度高峰與酵母菌或者好氧乙酸菌的生長增殖有關(guān)，第二個溫度高峰則反映了霉菌的生長［27］。Wang等［15］在對全株玉米發(fā)酵TMR好氧變質(zhì)過程中的溫度監(jiān)測中發(fā)現(xiàn)，整個過程中共檢測到了兩個溫度高峰，第一個溫度高峰與最大酵母數(shù)量一致，且在有氧狀態(tài)下檢出了數(shù)量較高的好氧細菌，表明需氧細菌在后期降解中的作用。發(fā)酵TMR在有氧變質(zhì)的過程中，乳酸等發(fā)酵酸被迅速代謝，飼料pH快速升高，從而引起梭狀芽胞桿菌的增殖，導(dǎo)致蛋白質(zhì)和碳水化合物的大量損失。梭狀芽胞桿菌（Clostridium）一般是嚴格厭氧或者微需氧的芽胞桿菌，當好氧細菌利用乳酸產(chǎn)生酸性終產(chǎn)物較少時，飼料的pH顯著增加，一些兼性厭氧微生物進一步消耗氧氣和發(fā)酵終產(chǎn)物，在飼料局部形成一個厭氧高pH的小環(huán)境，為梭狀芽胞桿菌的生長提供有利條件，使其在好氧變質(zhì)過程中數(shù)量增加，加速好氧變質(zhì)發(fā)生［30］。而霉菌的大量出現(xiàn)意味著飼料中的乳酸含量較低，pH較高，此時飼料發(fā)生變質(zhì)，失去飼喂價值［31］。其中，酵母被認為是好氧變質(zhì)過程中最重要的微生物［24］。由于酵母喜在糖分高的偏酸環(huán)境中生長，因此雖然在厭氧發(fā)酵過程其生長會受到抑制，一旦飼料開封后，充足的底物和適宜的環(huán)境使酵母首先快速增值，提高飼料pH，為其他好氧微生物的生長提供有利環(huán)境。因此，在發(fā)酵過程中存活下來的酵母菌被認為是引起飼料好氧變質(zhì)的主要微生物［24］。Beck等［32］認為酵母是導(dǎo)致青貯飼料發(fā)生好氧變質(zhì)的主要微生物因素，當青貯飼料中的酵母數(shù)量高于105CFU/g FM時，青貯飼料更容易發(fā)生好氧變質(zhì)［33］。許多研究表明，開封時酵母菌的數(shù)量是影響青貯飼料有氧穩(wěn)定性的重要因素，且隨著酵母菌數(shù)量的減少，有氧穩(wěn)定性增強［28，34-35］。然而Hu等［10］對發(fā)酵TMR有氧穩(wěn)定性的研究發(fā)現(xiàn)，以苜蓿為主要原料調(diào)制的TMR經(jīng)過56 d發(fā)酵后，雖然酵母菌的數(shù)量達到104CFU/g FM以上，但發(fā)酵TMR在6 d內(nèi)并未發(fā)生好氧變質(zhì)。因此，可以推測開封時酵母的種類比數(shù)量對有氧穩(wěn)定性的影響更大。一般來說，在發(fā)酵過程及有氧狀態(tài)下被檢出的酵母種類有很多（表2）。與好氧變質(zhì)有關(guān)的酵母按照其生理特征可以分為兩組，第一組是具有較高糖發(fā)酵能力的酵母，如Saccharomyces cerevisiae和Torulopsis spp.；第二組是具有高有機酸親和力的酵母，如Candida、Issatchenkia、Pichia、Hansenula和Endomycopsis［36］。其中，Pichia和Candida由于其高乳酸同化能力和高葡萄糖親和能力而在好氧變質(zhì)過程中檢出率較高［24］。這類酵母往往是影響飼料好氧變質(zhì)的關(guān)鍵因素。

表2 發(fā)酵過程及有氧狀態(tài)下的主要酵母Table 2 Main yeasts during ensiling and aerobic exposure

3 發(fā)酵TMR中的微生物種群多樣性

3.1 TMR發(fā)酵過程微生物種群的動態(tài)變化

發(fā)酵TMR中的微生物組成對飼料的發(fā)酵品質(zhì)及有氧穩(wěn)定性均具有重要的影響。針對發(fā)酵TMR中微生物種群多樣性的研究一直都是研究的熱點。對不同季節(jié)不同地域發(fā)酵TMR中的微生物組成進行分析發(fā)現(xiàn)，大部分發(fā)酵TMR中，芽胞桿菌和好氧細菌的數(shù)量在發(fā)酵過程中略有降低；酵母隨著發(fā)酵時間的延長，其生長逐步受到抑制；7 d后霉菌數(shù)量降至檢出限以下［37］。乳酸菌是TMR發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌，在厭氧發(fā)酵過程中的種類較多（表3）。其中，在厭氧發(fā)酵前期的乳酸菌主要為Lactobacillus casei、Lactobacillus brevis、Tetragenococcus halpphilus、Lactobacillus buchneri、Lactobacillus plantarum、Pediococcus pentosaceus、Weissella paramesenteroides和Pediococcus acidilactici，而 到 了 發(fā) 酵 后 期，Lactobacillus代替Lactococcus成為發(fā)酵TMR中的優(yōu)勢乳酸菌［10，38］。TMR發(fā)酵過程中微生物種群常常與營養(yǎng)成分的降解密切相關(guān)。半纖維素的降解通常發(fā)生在厭氧發(fā)酵早期，Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus licheniformis、Bacillus subtilis、Bacillus pumilus和Paenibacillus xylanexedens是 降 解 半 纖維素的主要微生物；B. amyloliquefaciens、Bacillus cereus、B. licheniformis、B. subtilis、Bacillus flexus和P.xylanexedens在發(fā)酵前期與淀粉的降解密切相關(guān)，而Enterococcus faecium是發(fā)酵后期降解淀粉的主要微生物［39］；降解蛋白的細菌主要屬于Curtobacterium和Paenibacillus，其中Curtobacterium flaccumfaciens、Paenibacillus amylolyticus、Paenibacillus borealis、P.xylanexedens和Paenibacillus turicensis為 發(fā) 酵TMR中微生物蛋白酶的主要來源；到了發(fā)酵后期，E.faecium成為發(fā)酵TMR中降解蛋白的主要細菌［40］。發(fā)酵TMR中酵母隨著發(fā)酵時間的延長其生長逐漸受到抑制，而開封后檢出的酵母通常被認為是導(dǎo)致好氧變質(zhì)的主要微生物。Pichia kudriavzevii、Kazachstania exigua、Kluyveromyces marxianus和Candida milleri常常在發(fā)酵TMR中被檢出，抑制K.marxianus和P. kudriavzevii的生長能夠在一定程度上改善發(fā)酵TMR的有氧穩(wěn)定性［38，41］。

表3 厭氧發(fā)酵過程的常見乳酸菌Table 3 Main lactic acid bacteria during ensiling

近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，高通量測序技術(shù)（high-throughput sequencing）被廣泛用于發(fā)酵TMR微生物種群多樣性的研究，使得我們對發(fā)酵過程的微生物種群有了進一步了解。Pediococcus、Lactobacillus等乳酸菌屬的相對豐度通常在發(fā)酵過程中顯著增加，抑制了Erwinia、Pseudomonas等有害細菌相對豐度的增長；隨著發(fā)酵時間的延長，Cryotococcus、Pseudozyma等真菌菌屬的相對豐度逐漸降低，真菌的生長逐漸受到抑制；許多發(fā)酵TMR開封時酵母和霉菌的數(shù)量處于檢出限以下，而通過高通量測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)，Pichia、Candida、Aspergillus和Phanerochaete均能夠在開封時被檢出，其相對豐度隨著發(fā)酵時間的延長顯著增加［16，18］。

3.2 發(fā)酵TMR有氧狀態(tài)下的微生物種群多樣性

開封后，發(fā)酵TMR中的無氧環(huán)境由于氧氣的進入發(fā)生變化，飼料中的微生物組成隨之改變。發(fā)酵TMR在有氧狀態(tài)下的細菌種群沒有顯著變化，Lactobacillus、Pediococcus和Erwinia無論在原料、發(fā)酵過程還是有氧狀態(tài)下均能夠被檢出［16，42］。Pichia、Cryptococcus和Candida是有氧狀態(tài)下的主要酵母，其中Pichia與發(fā)酵TMR的好氧變質(zhì)密切相關(guān)，P.kudriavzevii和Pichia manshurica均被認為是導(dǎo)致發(fā)酵TMR好氧變質(zhì)的主要酵母，抑制Candida humilis在一定程度上夠提高發(fā)酵TMR的有氧穩(wěn)定性；而在一些長期發(fā)酵的TMR中，Zygosaccharomyces bailii被認為是引發(fā)好氧變質(zhì)的主要酵母［17-18，41，43］。霉菌一般出現(xiàn)在有氧狀態(tài)后期，Cladosporium、Alternaria、Aspergillus和Monascus均是有氧狀態(tài)下常見的霉菌屬；當發(fā)酵TMR好氧變質(zhì)后，Monascus的相對豐度能夠達到80%以上，為發(fā)酵TMR中的主要真菌［16，18，44］。

4 總結(jié)與展望

發(fā)酵TMR技術(shù)的普及和推廣對于提高非常規(guī)飼料資源的利用效率，解決飼料資源短缺問題具有重要意義。而關(guān)于發(fā)酵TMR有氧穩(wěn)定性及其微生物種群多樣性的研究對促進發(fā)酵 TMR技術(shù)的推廣至關(guān)重要。目前，通過傳統(tǒng)分離純化技術(shù)、DGGE技術(shù)以及高通量測序技術(shù)對發(fā)酵TMR發(fā)酵過程及有氧狀態(tài)下的微生物種群多樣性進行了一系列的研究并取得了一定的研究結(jié)果，但是仍存在一定的不足。傳統(tǒng)微生物分離鑒定方法由于實驗室培養(yǎng)條件及微生物生長條件的限制，很難對微生物種群整體進行分析。近些年，高通量測序技術(shù)已成為研究飼料中微生物組成的常用方法。這種方法能夠?qū)ξ⑸锓N群進行更全面的分析，但是由于測序的通量較大，所以在確定到菌株水平上的準確率較低；同時，由于高通量測序技術(shù)直接提取樣品中的微生物總DNA進行微生物群落的分析，單純的相對豐度并不能顯示實時的微生物組成，因此單純的高通量測序技術(shù)在準確分析實時微生物菌群構(gòu)成上存在一定的缺陷；在提供有關(guān)微生物群落代謝活性的定量數(shù)據(jù)方面也仍然存在問題。在未來的研究中，可以將一二代測序方法結(jié)合起來，使二者相互補充，能夠更好地對發(fā)酵TMR中的微生物種群進行分析。隨著現(xiàn)代分子生物技術(shù)的發(fā)展，第三代測序技術(shù)（PacBio Single Molecule）越來越多地被應(yīng)用到青貯飼料發(fā)酵過程的微生物種群的測定上，該技術(shù)結(jié)合實時測序技術(shù)（real-time sequencing technology，SMRT）能夠更準確的評估飼料中物種水平上的微生物群落。然而該技術(shù)在發(fā)酵TMR中的應(yīng)用還較少，在未來的研究中，利用更新、更高效的現(xiàn)代生物學(xué)手段對TMR發(fā)酵過程及有氧狀態(tài)下的微生物種群進行更深入的分析，并采用代謝組學(xué)技術(shù)分析優(yōu)勢微生物的代謝途徑與代謝產(chǎn)物，進一步分析TMR發(fā)酵過程中營養(yǎng)成分的代謝規(guī)律，為發(fā)酵TMR技術(shù)的普及和推廣提供堅實的理論基礎(chǔ)。