青貯飼料微生物群落組成與功能研究進展

陳夢言 白潔 柯文燦 許冬梅 艾琳 郭旭生

（1. 蘭州大學生命科學學院，蘭州 730000；2. 蘭州大學益生菌與生物飼料研究中心，蘭州 730000；3. 蘭州大學草地農(nóng)業(yè)科技學院，蘭州730000；4. 中國畜牧業(yè)協(xié)會，北京 100044）

青貯飼料是指以青綠飼草為原料，在厭氧條件下通過乳酸菌發(fā)酵而調(diào)制的優(yōu)質(zhì)青粗飼料。青貯的成功與否與原料特性、發(fā)酵環(huán)境及原料附生微生物等因素密切相關(guān)。大量研究已經(jīng)證明發(fā)酵代謝產(chǎn)物、降雨量、溫度、濕度、經(jīng)緯度和海拔都會影響青貯飼料微生物菌群的結(jié)構(gòu)組成［1-3］。因此，目前已采用多種生物學方法對微生物群落組成結(jié)構(gòu)及微生物在青貯飼料發(fā)酵過程中行使的生物化學過程進行了探究，如從早期的平板培養(yǎng)技術(shù)到以聚合酶鏈式反應(yīng)技術(shù)為基礎(chǔ)延展出的變性梯度凝膠電泳、末端限制性片段長度多態(tài)性、長度異質(zhì)性PCR和自動核糖體基因間隔分析等技術(shù)［4-7］，再到變性梯度凝膠電泳（DDGE）和16S rRNA基因的末端限制性片段分析技術(shù)（T-RFLP）方法等。雖然這些方法已獲得大量并富有成效的研究成果，但其獲得微生物種類的信息量較少，無法準確反映微生物的菌種類型和數(shù)量的弊端仍需進一步解決。因此，如何利用分子生物學手段全面準確檢測和定量青貯飼料中的微生物群落結(jié)構(gòu)和種類特征將對突破青貯飼料發(fā)酵的微生態(tài)調(diào)控研究具有重大意義，也是目前青貯飼料發(fā)酵微生物調(diào)控亟待解決的問題。對此，人們嘗試使用高通量測序手段進行解決。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，二代測序技術(shù)和基于SMRT測序技術(shù)的16SrRNA基因全長測序的出現(xiàn)為解決該問題提供了切實可行的方法。本文就國內(nèi)外利用高通量測序技術(shù)對青貯微生物結(jié)構(gòu)組成與功能的研究報道加以綜述，旨在為進一步探討青貯飼料中微生物群落結(jié)構(gòu)與演替規(guī)律及其代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供參考。

1 青貯飼料微生物結(jié)構(gòu)的組成及演替

青貯發(fā)酵過程是由微生物介導(dǎo)的動態(tài)變化過程，在這個過程中，牧草本身附著的微生物與牧草種類、生長環(huán)境等密切相關(guān)。此外，各種青貯添加劑也會在很大程度上影響其微生物的組成。通常情況下，當青貯原料中乳酸菌的數(shù)量超過105CFU/g鮮重時［8］，才能保證乳酸菌在青貯發(fā)酵初期快速繁殖，產(chǎn)生大量乳酸，成為優(yōu)勢菌種，進而保證青貯飼料快速良好的發(fā)酵。一個良好的微生物發(fā)酵過程是調(diào)制高品質(zhì)青貯飼料的關(guān)鍵。這個發(fā)酵過程不僅取決于原料本身所具有的營養(yǎng)成分，而且也取決于青貯發(fā)酵過程中微生物的群落結(jié)構(gòu)及其演替過程與代謝網(wǎng)絡(luò)功能的關(guān)系，所以對這些信息的了解可為有效調(diào)控青貯飼料的發(fā)酵過程以調(diào)制優(yōu)質(zhì)的青貯飼料提供重要的科學依據(jù)，并對于篩選優(yōu)良乳酸菌菌種具有重要的實際生產(chǎn)意義。

1.1 苜蓿青貯飼料微生物群落組成及演替

苜蓿作為重要的飼料作物之一，因其蛋白含量高且富含多種營養(yǎng)成分而在國內(nèi)外被廣泛用于飼料加工［9］。然而，由于其緩沖能力較高、可溶性碳水化合物含量較低、乳酸菌數(shù)量較少使得青貯效果并不理想［10］，因此，在日常生產(chǎn)實踐中往往需要額外添加外源乳酸菌，以促進牧草的發(fā)酵進程。

青貯發(fā)酵是一個微生物相互競爭的過程，充分了解苜蓿青貯發(fā)酵過程中微生物群落結(jié)構(gòu)的變化，尋找其發(fā)酵規(guī)律對提高苜蓿青貯發(fā)酵品質(zhì)極為重要（表1）。在有關(guān)苜蓿原料附著微生物組成的研究方面，Yang等［11］發(fā)現(xiàn)萎蔫苜蓿原樣中假單胞菌屬（Pseudomonas）、微小桿菌屬（Exiguobacterium）馬賽菌屬（Massilla）、動性球菌屬（Planococcus）微生物為主要附生菌群，而乳桿菌屬微生物的相對含量僅占比2%。Bao等［12］的研究表明腸桿菌屬（Enterobacter）、泛 菌 屬（Pantoea）、腸 球 菌屬（Enterococcus）、芽胞桿菌屬（Bacillus）和魏斯氏菌屬（Weissella）微生物是新鮮苜蓿樣品中主要附著菌群。Guo等［13］的試驗表明苜蓿原料表面附著的微生物主要有泛菌屬（Pantoea）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、腸桿菌屬、鏈球菌屬（Streptococcus）等。而Yang［14］的結(jié)果表明，在苜蓿青貯中，腸桿菌屬微生物是最豐富的附生菌群，其次是泛菌屬微生物和芽胞桿菌屬微生物。出現(xiàn)這些差異的原因與樣品所處的生長環(huán)境、地理位置等密切相關(guān)［13-14］。在環(huán)境因子對苜蓿青貯發(fā)酵的影響探究中，Agarussi等［15］發(fā)現(xiàn)熱帶地區(qū)萎蔫的苜蓿青貯與未萎蔫苜蓿青貯相比，微生物多樣性顯著降低，且在未萎蔫苜蓿青貯飼料中植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）為優(yōu)勢菌種，而萎蔫后的優(yōu)勢菌群為腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）。此外，Agarussi還發(fā)現(xiàn)原料干物質(zhì)的不同也會影響其原料附著微生物組成，即從未萎蔫苜蓿原料中可以分離出赫倫魏斯氏菌（Weissella hellenica），彎曲乳桿菌（Lactobacillus curvatus），戊 糖 片 球 菌（Pediococcus pentosaceus），而酸魚乳桿菌（Lactobacillus acidipiscis），鶉雞腸球菌（Enterococcus gallinarum）。而腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）則僅能從萎蔫樣品中分離得到。Zhang等［16］發(fā)現(xiàn)當儲存溫度在20-30℃時，無論是否使用接種劑，乳桿菌屬微生物的相對豐度都是最高的，且一直處于主導(dǎo)地位。此外，使用不同乳酸菌發(fā)酵劑也能改變苜蓿青貯微生物的組成。Guo等［13］在接種植物乳桿菌和布氏乳桿菌后，發(fā)現(xiàn)在苜蓿青貯發(fā)酵過程中，雖然對照組、植物乳桿菌組和布氏乳桿菌組都以乳桿菌屬、腸球菌屬、鏈球菌屬和魏斯氏菌屬微生物為主，但其相對豐度在各處理組之間存在顯著差異，在青貯發(fā)酵前期植物乳桿菌處理組的優(yōu)勢菌種為植物乳桿菌（L.plantarum），而布氏乳桿菌處理組則在青貯初期以布氏乳桿菌（Lactobacillus buchneri）為主，在發(fā)酵后期所有處理組都以植物乳桿菌（L. plantarum）為主，且在這個變化過程中布氏乳桿菌（L. buchneri）逐漸消失。Bai等［17］在探究不同乳酸菌及其組合對青貯苜蓿的發(fā)酵品質(zhì)及微生物群落的影響時發(fā)現(xiàn)把植物乳桿菌（L. plantarum）、戊糖片球菌（P.pentosaceus）、糞 腸 球 菌（Enterococcus faecalis）分別或混合接種于苜蓿青貯中時，青貯發(fā)酵前期，所有處理組中乳桿菌屬（Lactobacillus）、哈夫尼菌屬（Hafnia）和魏斯氏菌屬微生物均為優(yōu)勢菌群；但在發(fā)酵14 d后，隨著青貯pH的降低，不耐酸的哈夫尼菌屬微生物的相對豐度急劇下降，乳酸桿菌屬和魏氏菌屬微生物成為優(yōu)勢菌群，Graf等［18］在對黑麥草青貯的相關(guān)研究中也有類似發(fā)現(xiàn)。此外，在Bai的研究中魏斯氏菌在整個苜蓿青貯中都呈現(xiàn)出較高的相對豐度，這表明苜蓿本身附著的乳酸菌在青貯發(fā)酵過程可能具有較強的競爭力。在對比乳酸菌發(fā)酵劑和酶促劑對苜蓿青貯細菌多樣性的影響時，Hu等［19］發(fā)現(xiàn)不同處理組間細菌群落存在明顯差異，而乳桿菌屬微生物在所有青貯飼料中均為優(yōu)勢菌群，且在青貯56 d后，乳桿菌屬微生物的相對豐度在纖維素酶處理組和干酪乳桿菌處理組中分別達83.93%和94.17%，與對照組（75.1%）相比，添加纖維素酶和干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）均能有效促進乳桿菌的生長，但干酪乳桿菌的作用效果更佳。

表1 苜蓿青貯細菌群落組成及其動態(tài)Table 1 Composition and dynamics of bacterial community in alfalfa silage

續(xù)表Continued

為進一步探討環(huán)境因子及添加劑對苜蓿發(fā)酵過程中微生物群落的綜合影響，柯文燦［20］通過在不同干物質(zhì)、不同溫度下接種植物乳桿菌（L.plantarum）和戊糖片球菌（P. pentosaceus）發(fā)現(xiàn)，隨著干物質(zhì)的增加，苜蓿原樣中附著的魏斯氏菌屬微生物的相對含量顯著降低，而片球菌屬微生物的相對含量明顯提高，在發(fā)酵初期（7 d）對照組和戊糖片球菌處理組的優(yōu)勢菌群均為魏斯氏菌和片球菌屬微生物，而植物乳桿菌處理組則主要由乳桿菌組成，且在20℃貯存條件下能顯著抑制哈夫尼菌、葡萄球菌和節(jié)桿菌等有害微生物的生長。當發(fā)酵進行至中后期（14-60 d）時，植物乳桿菌處理組中的優(yōu)勢菌群轉(zhuǎn)變?yōu)槲核故暇椭参锶闂U菌（L. plantarum），且與低干物質(zhì)處理組相比高干物質(zhì)處理組中植物乳桿菌（L. plantarum）的相對豐度明顯更高。此外，該研究還發(fā)現(xiàn)35℃青貯時添加植物乳桿菌對苜蓿青貯沒有明顯促進作用。Ni等［7］的試驗結(jié)果也表明接種劑和溫度對苜蓿青貯發(fā)酵特性和細菌多樣性有較大影響，并建議在20℃和30℃青貯條件下，可通過提高乳酸菌的比例改善苜蓿青貯發(fā)酵品質(zhì)。

綜上所述，苜蓿原料表面微生物主要有泛菌屬（Pantoea）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、腸球菌屬（Enterococcus）、鏈球菌屬（Streptococcus）、腸桿菌屬（Enterobacter）、芽胞桿菌屬（Bacillus）、魏斯氏菌屬（Weissella）、假單胞菌屬（Pseudomonas）等菌屬。而青貯后則以腸桿菌屬（Enterobacter）、芽胞桿菌（Bacillus）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、魏斯氏菌屬（Weissella）、乳球菌屬（Lactococcus）、泛菌屬（Pantoea）、哈夫尼菌屬（Hafnia）、腸球菌屬（Enterococcus）、假單孢菌屬（Pseudomonas）、片球菌屬（Pediococcus）微生物為主。在苜蓿青貯發(fā)酵過程中微生物群落的動態(tài)變化受干物質(zhì)，溫度及乳酸菌添加劑等多種因素的影響，因此，嚴格把控各類因素對苜蓿青貯發(fā)酵過程的影響將有助于進一步改善苜蓿青貯的發(fā)酵品質(zhì)。

1.2 全株玉米青貯飼料微生物群落組成及演替

全株玉米能量高，營養(yǎng)豐富，是世界范圍內(nèi)最常見的反芻動物飼料［21-22］。據(jù)統(tǒng)計，全球超過1.33億頭奶牛每年消耗青貯飼料高達6.65億t，其中全株玉米青貯占比超過40%［23-24］，因此提高全株玉米青貯發(fā)酵品質(zhì)，有助于提高飼料的利用率，進而能促進畜牧業(yè)經(jīng)濟發(fā)展。

盡管前期的研究結(jié)果表明，明串珠菌科（Leuconostocaceae）、醋桿菌科（Acetobacteraceae）、腸 桿 菌 科（Enterobacteriaceae）和 莫 拉 菌 科（Moraxellaceae）是全株玉米青貯前的主要優(yōu)勢菌群［25］，然而Xu等［26］2018年的研究卻顯示農(nóng)桿菌屬（Agrobacterium）、微 桿 菌 屬（Microbacterium）、鞘氨醇桿菌屬（Sphingobacterium）、金黃桿菌屬（Chryseobacterium）等屬的微生物是青貯前全株玉米的主要附著菌群。這種差異可能與原料的生長環(huán)境有關(guān)。Gharechahi等［24］以3個不同氣候區(qū)的雜交玉米為青貯原料，研究青貯飼料中細菌群落的動態(tài)變化，結(jié)果顯示青貯原料表面附著微生物與作物生長環(huán)境密切相關(guān)，且處于溫暖和干燥地區(qū)的全株玉米原料附著微生物多樣性相對較低。Guan等［27］對中國西南部四川、重慶和貴州5個主要生態(tài)區(qū)的全株玉米窖貯樣品進行分析發(fā)現(xiàn)在窖貯青貯中出現(xiàn)了高豐度的醋酸桿菌。該研究也表明降雨和濕度是影響玉米原料中附生細菌群落變化的主要因素，而溫度則是影響全株玉米青貯發(fā)酵過程中微生物群落變化的主要因素。許冬梅［28］在對不同氣候區(qū)及乳酸菌影響玉米青貯發(fā)酵的微生物組與代謝組學機制研究中指出，青貯原料表面附著的微生物受氣溫、降雨量、光照、平均相對濕度等氣候因子的影響，其中，平均相對濕度對全株玉米原料附著微生物群落的影響最為顯著。此外在全株玉米發(fā)酵過程中不同氣候區(qū)青貯過程標志微生物及優(yōu)勢菌種也有明顯不同（表2），亞熱帶季風氣候區(qū)、高原高山氣候區(qū)以及熱帶季風氣候區(qū)的全株玉米發(fā)酵過程中植物乳桿菌為優(yōu)勢菌種；溫帶大陸性氣候區(qū)和溫帶季風氣候區(qū)則分別以類食品乳桿菌（Lactobacillus paralimentarius）和短乳桿菌（L. brevis）為優(yōu)勢菌種。

表2 不同氣候區(qū)全株玉米青貯過程標志微生物（種水平）Table 2 Marker microorganisms of whole-plant corn silage in different climate zones（species）

目前對添加乳酸菌接種劑的全株玉米青貯發(fā)酵過程中微生物群落的動態(tài)變化的研究也有大量報道。Xu等［26］結(jié)合多種組學方法，通過接種植物乳桿菌及布氏乳桿菌，研究了全株玉米青貯過程中細菌菌群的變化（表3）。在整個青貯過程中，接種劑布氏乳桿菌和植物乳桿菌并不是優(yōu)勢菌種，說明外源乳酸菌在玉米青貯飼料中的競爭力較弱于本土乳酸菌。此外，在發(fā)酵前期，添加布氏乳桿菌增加了布氏乳桿菌的相對豐度但降低了短乳桿菌的相對豐度；添加植物乳桿菌則增加了副短乳桿菌（L. parabrevis）的相對豐度。而在發(fā)酵后期，添加布氏乳桿菌和植物乳桿菌均增加了類谷糠乳桿菌（Lactobacillus parafarraginis）的相對豐度，且降低了硅乳酸桿菌（Lactobacillus silagei）的相對豐度。除這兩種最常用的接種劑外，研究者也試圖將其他乳酸菌或酶制劑加入到玉米青貯中，進一步探究添加劑對全株玉米青貯微生物演替的影響，Drouin等［29］將希氏乳桿菌（Lactobacillus hilgardii）添加到玉米青貯中，與布氏乳桿菌處理組相比希氏乳酸菌處理組在發(fā)酵后期乳酸菌的相對豐度要明顯提高。Li等［30］將鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）研究表明接種鼠李糖乳桿菌（L. rhamnosus）對發(fā)酵產(chǎn)物和微生物群落的影響不大，而接種布氏乳桿菌（L. buchneri）可能會改變發(fā)酵和有氧穩(wěn)定性，但細菌和真菌群落沒有明顯變化。

表3 添加劑及生長環(huán)境對全株玉米青貯微生物群落組成的影響Table 3 Effects of additives and growth environment on bacterial community compositions of whole-plant corn silage

續(xù)表Continued

綜上所述，全株玉米原料表面微生物主要有農(nóng)桿菌屬（Agrobacterium）、微桿菌屬（Microbacterium）、鞘氨醇桿菌屬（Sphingobacterium）、金黃桿菌屬（Chryseobacterium）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、克雷伯菌屬（Klebsiella）、乳桿菌屬（Lactobacillus）等。而青貯后則以乳桿菌屬（Lactobacillus）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、檸檬酸桿菌屬（Citrobacter）、魏斯氏菌屬（Weissella）、醋酸桿菌屬（Acetobacter）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、片球菌屬（Pediococcus）為主。由于全株玉米本身的原料特性及表面附著乳酸菌的數(shù)量充足，盡管使用乳酸菌添加劑會改變?nèi)暧衩浊噘A過程中的微生物群落組成，但對其發(fā)酵品質(zhì)的影響并不顯著［31-32］。此外，不同氣候區(qū)全株玉米原料表面附著的微生物組成差異較大，進而導(dǎo)致全株玉米青貯發(fā)酵過程微生物組成及演替也存在很大差異。所以在對于進行全株玉米青貯時，不僅要考慮氣候因子對青貯原料表面附著微生物的影響，還需考慮不同添加劑對青貯微生物群落的影響。

1.3 其他牧草青貯飼料微生物群落組成及演替

除苜蓿和玉米外，其他牧草的微生物動態(tài)研究也在不斷深入。Ni等［7］在研究飼料大豆與玉米、高粱混合青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)及微生物群落時發(fā)現(xiàn)，雖然乳桿菌和魏斯氏菌是所有青貯飼料樣本中的主要菌屬，但混合青貯飼料中乳桿菌屬的豐度（33%-76%）要高于單一飼用大豆青貯（27%）。Xu等［34］以紅豆草為研究對象，發(fā)現(xiàn)紅豆草原料中微生物α-多樣性（Shannon指數(shù)）高于苜蓿，但低于全株玉米，并且紅豆草原料中不動桿菌屬、膿單胞菌、假單胞菌、乳桿菌的相對豐度較高，而在青貯后苜蓿和全株玉米的α-多樣性均低于紅豆草。Wang等［35］將植物乳桿菌（L. plantarum）分別添加至萎蔫與未萎蔫辣木樣品中發(fā)現(xiàn)未萎蔫辣木青貯中以乳桿菌屬（Lactobacillus）占優(yōu)勢，而萎蔫辣木青貯中則以腸桿菌屬（Enterobacter）、魏斯氏菌屬（Weissella）和泛菌屬（Pantoea）占優(yōu)勢。在環(huán)境因素對微生物群落的影響研究中，Guo等［36］的研究表明了光照對象草和意大利黑麥草發(fā)酵極為重要，不僅影響青貯發(fā)酵品質(zhì)，而且對青貯微生物菌群的影響也較為顯著。Ding等［37］的研究結(jié)果表明海拔也會影響牧草表面附生微生物，在低海拔地區(qū)，垂穗披堿草的附生微生物以假單胞菌屬和泛菌屬為主，而在高海拔地區(qū)，魏斯氏菌屬和明串珠菌屬占主導(dǎo)地位。在發(fā)酵14-90 d后，高海拔地區(qū)青貯垂穗披堿草中的魏斯氏菌屬被乳酸桿菌屬取代，隨著發(fā)酵時間的增加，乳桿菌逐漸成為優(yōu)勢菌群。低海拔地區(qū)樣品在發(fā)酵初期哈夫尼菌屬為優(yōu)勢菌種，一直到青貯發(fā)酵60 d乳桿菌屬才處于主導(dǎo)地位。除此之外，Zi等［38］的研究表明來自我國南方的12種不同的狼尾草天然發(fā)酵青貯的微生物多樣性具有明顯的差異，這與降水、溫度、濕度、位置等環(huán)境因素密不可分。

在對接種劑對微生物群落的影響研究中，Nazar等［39］將蘇丹草、象草、飼用高粱、全株玉米的外源性附著微生物分別接種于無菌蘇丹草中進行青貯發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵初期蘇丹草青貯中主要以片球菌屬為主，青貯3 d后接種全株玉米和象草附著微生物的無菌蘇丹草以乳桿菌屬為主，而接種高粱附著微生物的無菌蘇丹草則以魏斯氏菌屬為主。Sun等［40］的研究結(jié)果表明接種乳酸菌菌懸液促進了細菌的演替和發(fā)酵過程，且全株玉米源的乳酸菌菌懸液比披堿草源的乳酸菌菌懸液更有效。

2 青貯飼料微生物群落功能初探

青貯發(fā)酵過程主要涉及的代謝途徑包括碳水化合物代謝、氨基酸代謝、能量代謝、輔酶因子和維生素代謝以及異源生物的生物降解和代謝。對于這些功能變化的研究，可采用PIRUSt（Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States）的方法與KEGG數(shù)據(jù)庫比對進行預(yù)測。近年來，PICRUSt已用于大麥青貯［41］、小麥青貯［42］、玉米青貯［26］及苜蓿青貯［17］等青貯飼料的微生物功能研究中，通過對細菌群落代謝途徑的預(yù)測，可以更深入地了解代謝途徑與發(fā)酵過程之間的關(guān)系，從而調(diào)控優(yōu)質(zhì)青貯的發(fā)酵。

前人的研究已發(fā)現(xiàn)不同乳酸菌調(diào)控青貯發(fā)酵過程的途徑是不同的，布氏乳桿菌［43］是一種異型發(fā)酵乳酸菌，能將乳酸轉(zhuǎn)化成乙酸，進而有效抑制引起青貯腐敗的酵母。植物乳桿菌和戊糖片球菌［44］通過產(chǎn)生大量的乳酸從而快速啟動青貯發(fā)酵，在抑制有害微生物的生長繁殖的同時還可以有效降低青貯飼料干物質(zhì)損失。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，通過PICRUSt功能預(yù)測，可進一步探究在青貯發(fā)酵過程中乳酸菌添加劑對青貯過程微生物的代謝途徑及功能的影響。Liu等［41］研究發(fā)現(xiàn)添加乳酸菌后，磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)、果糖和甘露糖代謝、糖酵解、丙氨酸-天冬氨酸-谷氨酸代謝、甲烷代謝、丙酮酸代謝、戊糖磷酸途徑的相對豐度在有氧暴露的第5天高于對照青貯飼料。Keshri等［42］發(fā)現(xiàn)在全株小麥青貯飼料中，相對豐度最高的代謝途徑是轉(zhuǎn)運體（transporters），與添加了植物乳桿菌的青貯飼料相比，對照組青貯至15 d的轉(zhuǎn)運體的相對豐度顯著升高，微生物種群間也存在共生關(guān)系。并且在碳水化合物代謝方面，Keshri等［42］發(fā)現(xiàn)添加了植物乳桿菌的青貯飼料中，碳水化合物代謝在整個青貯階段都保持恒定水平，這與優(yōu)勢乳酸菌種群的代謝密不可分。相比之下，未經(jīng)處理的青貯飼料的碳水化合物代謝在第15天顯著增加，然后在第30天減少，直到第90天才與植物乳桿菌處理組的青貯碳水化合物代謝水平相當。之后，在Xu［26］和Bai［17］的研究中，他們選擇了碳水化合物代謝、氨基酸代謝、能量代謝及輔酶因子和維生素代謝等與青貯發(fā)酵過程緊密相關(guān)的代謝途徑進行了深入研究。Xu等［26］發(fā)現(xiàn)，這些代謝途徑的相對豐度在全株玉米青貯的發(fā)酵中期有所上調(diào)。與植物乳桿菌處理組相比，接種布氏乳桿菌上調(diào)了全株玉米黃酮和黃酮醇的生物合成途徑。Bai等［17］研究中發(fā)現(xiàn)，接種戊糖片球菌的苜蓿青貯與其他處理相比氨基酸代謝途徑的相對豐度最低，同時發(fā)現(xiàn)該處理組的pH與氨態(tài)氮含量也較低。因此，此現(xiàn)象可以解釋較低的pH抑制了由不良微生物生長繁殖所導(dǎo)致的蛋白降解及氨基酸代謝途徑，從而降低了氨態(tài)氮含量。在該研究中，還有一個有趣的發(fā)現(xiàn)，即單獨接種糞腸球菌及糞腸球菌與植物乳桿菌混合接種的苜蓿青貯中，輔酶因子與維生素代謝途徑的相對豐度有所升高。他們推測糞腸球菌的接種可以直接產(chǎn)生維生素或促進了青貯過程中維生素的產(chǎn)生。且該研究也進一步表明，青貯飼料中的碳水化合物代謝途徑的相對豐度較低時，微生物群落中的總?cè)樗峋鷶?shù)量也較低，反之亦然。在功能性乳酸菌的研究中，Zhang等［45-46］將具抗氧化活性植物乳桿菌添加至苜蓿青貯中發(fā)現(xiàn)青貯苜蓿中α-生育酚和β-胡蘿卜素的濃度和多不飽和脂肪酸（PUFA）的比例顯著提高了。

綜上所述，植物乳桿菌在維持碳水化合物代謝、提高氨基酸代謝水平、減少轉(zhuǎn)運體相對數(shù)量、降低了多環(huán)芳烴降解上調(diào)的程度等方面具有重要作用，布氏乳桿菌則可以上調(diào)黃酮和黃酮醇的生物合成途徑D-丙氨酸代謝途徑。而有關(guān)青貯飼料微生物群落功能研究還需進一步通過宏基因組測序技術(shù)進一進行深入研究，從而揭示青貯飼料發(fā)酵過程中微生物的代謝功能及其對青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)及代謝產(chǎn)物的影響。

3 展望

對于青貯發(fā)酵過程中代謝途徑及功能變化的研究目前仍處于初步探索階段。目前對青貯飼料微生物群落功能的研究只基于16S rRNA測序技術(shù)中的測序數(shù)據(jù)進行了功能預(yù)測，分析了不同處理及不同發(fā)酵時期中一些代謝途徑及功能的豐度變化，并沒有深入研究這些代謝途徑及功能的變化具體是由哪些微生物引起，又導(dǎo)致了哪些生化過程及代謝產(chǎn)物的具體變化。因此，在未來的研究中，可結(jié)合宏基因組學和轉(zhuǎn)錄組學等生物技術(shù)對青貯發(fā)酵過程微生物的功能基因進行系統(tǒng)深入研究，進而有效揭示青貯飼料發(fā)酵過程中微生物群落結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系及發(fā)酵代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)特征，明晰青貯飼料品質(zhì)形成的微生物與生物化學過程，為優(yōu)質(zhì)、安全青貯飼料發(fā)酵調(diào)控提供理論依據(jù)。同時，青貯飼料不同發(fā)酵調(diào)控措施、不同飼草種類、氣候環(huán)境條件等均會對青貯飼料微生物群落結(jié)構(gòu)及功能產(chǎn)生影響，需進一步開展系統(tǒng)性的研究。由于我國地域遼闊，氣候環(huán)境和自然條件多樣，飼草資源豐富，這為我國在青貯飼料微生物發(fā)酵調(diào)控領(lǐng)域研究提供了得天獨厚的資源，同時也為優(yōu)質(zhì)、安全青貯飼料的生產(chǎn)提出了不同挑戰(zhàn)。