無(wú)核白綠葡萄干清洗前后酚類(lèi)物質(zhì)變化及其與酶促褐變的關(guān)系

雷 靜，廉葦佳，陳 雅，韓 琛，任紅松，肖 麗

(1.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院吐魯番農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，新疆吐魯番 838000；2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院科研管理處，烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】葡萄干是葡萄的主要加工品之一，含糖量高，富含多種人體所需氨基酸、維生素和礦物質(zhì)[1,2]。葡萄干含水量低，方便運(yùn)輸和貯藏[3,4]。無(wú)核綠葡萄干是新疆特色干果制品，占全疆葡萄干的70%以上，傳統(tǒng)干制綠色葡萄干主要是采用蜂眼式透風(fēng)晾房陰干方法[5,6]。綠葡萄干清洗會(huì)有褐變現(xiàn)象。分析無(wú)核白綠葡萄干清洗前后酚類(lèi)物質(zhì)變化及其與酶促褐變的關(guān)系，研究葡萄干清洗酶促褐變的原因，為綠葡萄干清洗技術(shù)提供理論依據(jù)[7,8]。【前人研究進(jìn)展】白俊文[9]認(rèn)為葡萄干燥加工中存在干燥時(shí)間長(zhǎng)和褐變問(wèn)題，將高溫高濕氣體射流沖擊燙漂技術(shù)(HHAIB)用于葡萄干燥前處理，研究了燙漂處理對(duì)葡萄PPO酶活性、葡萄干燥動(dòng)力學(xué)以及色澤的影響；張利娟等[10]評(píng)價(jià)綠葡萄干干制過(guò)程中褐變的發(fā)生對(duì)其抗氧化活性的影響，分析了抑制無(wú)核白綠葡萄干褐變的方法。李曉麗等[11]研究了無(wú)核白葡萄干制過(guò)程中酚類(lèi)物質(zhì)的變化與葡萄干發(fā)生褐變的關(guān)系。最主要的酶促褐變底物為兒茶素[11]；Williamson and Carughi等[15]研究表明，葡萄干中最豐富的酚類(lèi)化合物是槲皮素、山奈酚、酚酸以及咖啡酸和香豆酸。Breksa III A P等[16-20]。【本研究切入點(diǎn)】雖然研究葡萄干的文獻(xiàn)很多，但是專(zhuān)注研究葡萄干清洗褐變的研究報(bào)道較少。研究無(wú)核白綠葡萄干清洗前后酚類(lèi)物質(zhì)含量變化及與酶促褐變的關(guān)系。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】分析無(wú)核白綠葡萄干清洗前后酚類(lèi)物質(zhì)含量變化及其與酶促褐變的關(guān)系，研究清洗無(wú)核白綠葡萄干發(fā)生酶促褐變的機(jī)理，為葡萄干精深加工提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 葡萄干

綠葡萄干于2018年12月購(gòu)買(mǎi)自新疆吐魯番市東疆市場(chǎng)，品種為無(wú)核白(V.viniferacv. Thompson Seedless)。

1.1.2 試劑

磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、鹽酸、甲醇、福林-肖卡試劑均為分析純；綠原酸、沒(méi)食子酸、阿魏酸、原兒茶酸、山奈酚、香草酸、咖啡酸、丁香酸、P-香豆酸、芥子酸、龍膽酸、兒茶素、槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自Anpel公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備

FA2004N電子天平，上海菁海儀器有限公司；UV754N紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；KQ-500E機(jī)械式超聲波清洗器，東莞康士潔超聲波科技有限公司；DZKW-S-4電熱恒溫水浴鍋，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；全能臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)SIGMA公司；UPLC-Vion-IMS-QTof超高效液相-離子淌度飛行時(shí)間質(zhì)譜，美國(guó)Waters公司；Scotsman AF 100 AS雪花制冷機(jī)，上海旦鼎國(guó)際貿(mào)易有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 葡萄干清洗

挑選無(wú)病蟲(chóng)害，無(wú)損傷，大小均勻，色澤均一的葡萄干為材料。無(wú)核白綠葡萄干用常溫自來(lái)水清洗2遍，每次清洗時(shí)間1 min，于通風(fēng)處自然晾干。

1.2.2 葡萄干褐變度的測(cè)定[12，13]

取3 g(干物質(zhì))葡萄干按1∶10加蒸餾水，勻漿后，在4℃條件下9 000 r/min離心30 min，取上清液在420 nm處測(cè)OD值。

1.2.3 酚類(lèi)物質(zhì)組成測(cè)定

參照Kolniak-Ostek J等[14]方法。采用UPLC-Vion-IMS-QTof超高效液相-離子淌度飛行時(shí)間質(zhì)譜進(jìn)行酚類(lèi)物質(zhì)單體測(cè)定。色譜條件如下：色譜柱采用UPLC BEH C18柱(1.7 μm，2.1 mm×50 mm)，流動(dòng)相由溶劑A(0.1%甲酸)和溶劑B(100%乙腈)組成。梯度洗脫：0～1 min，99%溶劑A；1～12 min，99%～0溶劑A；12～13.5 min，0～99%溶劑A；保持不變以重新平衡該柱子。流速0.45 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，柱溫45℃，進(jìn)樣室溫10℃。質(zhì)譜條件：毛細(xì)管電壓2 500V，錐形電壓30V，源溫度100℃，去溶劑化溫度300℃，脫溶劑氣體(氮?dú)?流量300 L/h，電壓斜坡循環(huán)從0.3到2V。

1.2.4 酚類(lèi)物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

利用UPLC-Vion-IMS-QTof超高效液相-離子淌度飛行時(shí)間質(zhì)譜體系鑒定清洗前后無(wú)核白綠葡萄干中的主要酚類(lèi)物質(zhì)，確定各自的線性回歸方程，判斷該體系的分離度和方程的線性關(guān)系。

1.2.5 無(wú)核白綠葡萄干酶促褐變底物鑒定[15]

多酚氧化酶提?。簻?zhǔn)確稱(chēng)取一定量葡萄干，加入18 mL 0.2 mol/L pH 5.8預(yù)冷的磷酸緩沖液，用均質(zhì)機(jī)勻漿，在4℃條件下浸提2.9 h，在同樣4℃下9 000 r/min離心15 min，取其清液。重復(fù)1次，得到葡萄干多酚氧化酶提取液。

多酚氧化酶活性測(cè)定：在試管中加入3 mL 0.2 mol/L pH 6.8磷酸緩沖液，1 mL不同反應(yīng)物(沒(méi)食子酸、龍膽酸、兒茶素、阿魏酸、香草酸、P-香豆酸、原兒茶酸、山奈酚、綠原酸、芥子酸、丁香酸、咖啡酸、槲皮素)，1 mL粗酶液，混合均勻，在420 nm吸收波長(zhǎng)下測(cè)定其在4 min內(nèi)的吸光度值，每隔30s測(cè)1次，根據(jù)公式(1)計(jì)算酶活。鑒定無(wú)核白綠葡萄干清洗酶促褐變的底物。

(1)

式中：△A為反應(yīng)時(shí)間內(nèi)吸光度值的變化；

Vr為提取酶液總體積(mL)；

W為取樣質(zhì)量(g)；

Vs為測(cè)定時(shí)取用酶液體積(mL)；

t為反應(yīng)時(shí)間(min)。

1.2.6 無(wú)核白綠葡萄干清洗前后褐變度與酚類(lèi)物質(zhì)含量變化之間的相關(guān)性

分別測(cè)定無(wú)核白綠葡萄干清洗前后的褐變度，使用SPSS軟件相關(guān)性分析法分析清洗前后無(wú)核白綠葡萄干褐變度與酚類(lèi)物質(zhì)含量變化的相關(guān)性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析和相關(guān)性分析，當(dāng)P<0.01時(shí)，差異極顯著，當(dāng)P<0.05時(shí)，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2. 1 酚類(lèi)物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線

研究表明，無(wú)核白葡萄中酚類(lèi)物質(zhì)有14種，參與酶促褐變的底物有6種，分別為順式-白藜蘆醇、原花青素B2、阿魏酸、兒茶素、反式-咖啡酸、對(duì)羥基肉桂酸，葡萄干中也含有兒茶素、表兒茶素、沒(méi)食子酸、丁香酸、香草酸、綠原酸、原兒茶酸和阿魏酸等酚類(lèi)物質(zhì)。單體酚標(biāo)準(zhǔn)品確定各自的線性回歸方程，相關(guān)系數(shù)均達(dá)到0.999以上，線性關(guān)系好，檢測(cè)體系分離度好。鑒定出無(wú)核白綠葡萄干清洗前后有山奈酚、阿魏酸、原兒茶酸、香草酸、P-香豆酸、龍膽酸、兒茶素、綠原酸、芥子酸、丁香酸、沒(méi)食子酸、咖啡酸和槲皮素共計(jì)13種主要的酚類(lèi)物質(zhì)。表1

表1 無(wú)核白綠葡萄干中 13種酚類(lèi)物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的線性回歸方程Table 1 Linear regression Equations of 12 phenolics standards in green raisins

2.2 無(wú)核白綠葡萄干清洗前后酚類(lèi)物質(zhì)含量的變化

研究表明，無(wú)核白綠葡萄干在清洗前兒茶素含量最高，為0.105 mg/100g，龍膽酸含量最低，為0.001 mg/100g。綠葡萄干在清洗后兒茶素含量仍然最高，為0.052 mg/100g，綠原酸含量最低，為0.000 65 mg/100g。兒茶素在清洗前的含量就非常高，是其它單體酚類(lèi)物質(zhì)含量的幾十到100倍，在葡萄干清洗過(guò)程中損失一部分，但是其含量還是很高。綠葡萄干通過(guò)清洗干燥后沒(méi)食子酸、原兒茶酸的含量增加，增加的含量非常小，分別增加了9.83%和0.89%，其他酚類(lèi)物質(zhì)含量都是減少的，其中兒茶素和槲皮素含量減少的較多，分別減少了50.48%和57.25%。酚類(lèi)物質(zhì)減少大小依次為：P-香豆酸>槲皮素>綠原酸>兒茶素>山奈酚>丁香酸>阿魏酸>香草酸>咖啡酸>龍膽酸>芥子酸。綠原酸、阿魏酸、香草酸、咖啡酸和丁香酸的質(zhì)量變化沒(méi)有顯著性差異，原兒茶酸、芥子酸和龍膽酸的質(zhì)量變化沒(méi)有顯著性差異，兒茶素、槲皮素、山奈酚、P-香豆酸、沒(méi)食子酸的質(zhì)量變化有顯著性差異。表2

表2 無(wú)核白綠葡萄干清洗前后單體酚類(lèi)物質(zhì)組成和含量變化Table 2 Changes in composition and content of monophenols in green raisins before and after cleaning

2.3 無(wú)核白綠葡萄干酶促褐變底物鑒定

研究表明，無(wú)核白綠葡萄干多酚氧化酶催化咖啡酸酶促褐變酶活是35.07 U/mL，催化綠原酸的酶活是3.48 U/mL。無(wú)核白綠葡萄干多酚氧化酶對(duì)主要酚類(lèi)物質(zhì)的催化褐變活性大小依次為咖啡酸>P-香豆酸>槲皮素>兒茶素>山奈酚>綠原酸，而葡萄干多酚氧化酶對(duì)阿魏酸，原兒茶酸、香草酸、龍膽酸、芥子酸、丁香酸、沒(méi)食子酸無(wú)反應(yīng)活性。對(duì)比清洗前后，葡萄干中咖啡酸、P-香豆酸、槲皮素、兒茶素、山奈酚和綠原酸這幾種酚類(lèi)物質(zhì)含量也是減少的，P-香豆酸和槲皮素含量減少的最多，與多酚氧化酶反應(yīng)酶活性值也較高，分別排在第2和第3，咖啡酸與多酚氧化酶反應(yīng)酶活性值最高，但清洗后含量降低率僅為10.21%，咖啡酸與葡萄干多酚氧化酶的結(jié)合能力大于P-香豆酸和槲皮素與葡萄干多酚氧化酶的結(jié)合能力。不同酚類(lèi)物質(zhì)與葡萄干多酚氧化酶結(jié)合能力大小依次為咖啡酸>P-香豆酸>槲皮素>兒茶素>山奈酚>綠原酸，而阿魏酸、原兒茶酸、香草酸、龍膽酸、芥子酸、丁香酸和沒(méi)食子酸與葡萄干多酚氧化酶不結(jié)合或基本不結(jié)合，葡萄干多酚氧化酶可以與多種酚類(lèi)物質(zhì)反應(yīng)，而不是具有特異性底物。無(wú)核白綠葡萄干清洗前后酚類(lèi)物質(zhì)減少是被多酚氧化酶催化氧化成醌類(lèi)物質(zhì)所致，醌類(lèi)物質(zhì)自聚或與其他物質(zhì)聚合而生成褐色或褐色物質(zhì)，導(dǎo)致清洗后葡萄干褐變。無(wú)核白綠葡萄干清洗酶促褐變的底物主要是槲皮素、綠原酸、咖啡酸、P-香豆酸、山奈酚和兒茶素。阿魏酸、香草酸、龍膽酸、芥子酸和丁香酸不與或者基本不與葡萄干多酚氧化酶結(jié)合，可能會(huì)與苯丙氨酸解氨酶或過(guò)氧化物酶等酶結(jié)合反應(yīng)。原兒茶酸和沒(méi)食子酸清洗后含量增加但不與多酚氧化酶反應(yīng)，可能清洗過(guò)程中由于水分進(jìn)入葡萄干內(nèi)部，內(nèi)部成分之間發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，導(dǎo)致2種物質(zhì)含量都有增加，原兒茶酸含量?jī)H增加了0.89%，沒(méi)食子酸增加較多，增加了9.83%。表3

表3 無(wú)核白綠葡萄干多酚氧化酶對(duì)不同底物催化酶活性Table 3 Catalytic browning activity of green raisin polyphenol oxidase on different substrates

2.4 無(wú)核白綠葡萄干清洗前后褐變度與酚類(lèi)物質(zhì)含量變化之間的相關(guān)性

研究表明，無(wú)核白綠葡萄干清洗前后褐變度與清洗中酶促褐變的底物山奈酚、咖啡酸、P-香豆酸、兒茶素和槲皮素呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，相關(guān)性大小由高到低是咖啡酸>P-香豆酸>槲皮素>兒茶素>山奈酚>綠原酸，山奈酚、咖啡酸、P-香豆酸、兒茶素和槲皮素對(duì)無(wú)核白綠葡萄干清洗后褐變的影響顯著。綠原酸與無(wú)核白綠葡萄干褐變度的相關(guān)性最小為-0.866，且相對(duì)于其它5種酚類(lèi)物質(zhì)對(duì)褐變度的影響不顯著。表4

表4 無(wú)核白綠葡萄干清洗前后褐變度與酚類(lèi)物質(zhì)含量變化之間的相關(guān)性Table 4 Correlation between browning degree and phenol content before and after cleaning seedless green raisins

3 討 論

褐變通常分為酶促褐變和非酶褐變兩類(lèi)。酶促褐變是指在氧氣存在的條件下，多酚氧化酶催化酚類(lèi)物質(zhì)向醌及其聚合物轉(zhuǎn)變的過(guò)程，反應(yīng)生成褐色素或黑色素造成褐變現(xiàn)象的發(fā)生。非酶褐變則是指沒(méi)有酶參與時(shí)發(fā)生的褐變，主要包括美

拉德反應(yīng)和焦糖化反應(yīng)[21]。有研究表明，有些水果的褐變不僅與多酚氧化酶(PPO)活性有關(guān)，還與酚類(lèi)物質(zhì)的濃度有關(guān)，也有些水果的褐變僅僅與PPO活性相關(guān)。李曉麗等[11]研究得出無(wú)核白葡萄主要酚類(lèi)物質(zhì)單體中有6種酚類(lèi)單體與多酚氧化酶發(fā)生反應(yīng)，即原花青素B2、對(duì)羥基肉桂酸、兒茶素、反式-咖啡酸、順式-白藜蘆醇、阿魏酸。在干制過(guò)程中褐變度與總酚、原花青素B2、對(duì)羥基肉桂酸、兒茶素、反式-咖啡酸、順式-白藜蘆醇呈顯著相關(guān)性。Hogan等[22]認(rèn)為葡萄的褐變度與總酚、原花青素、兒茶素和根皮苷相關(guān)性較高。

前人大多從葡萄干制過(guò)程中發(fā)生酶促褐變的角度開(kāi)展試驗(yàn)研究。但是圍繞無(wú)核白綠葡萄干清洗褐變的研究非常少，研究主要針對(duì)無(wú)核白綠葡萄干清洗干燥后發(fā)生的酶促褐變開(kāi)展研究，通過(guò)試驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，參與葡萄干清洗酶促褐變的酚類(lèi)物質(zhì)與葡萄干制過(guò)程中的酚類(lèi)物質(zhì)不同。酚類(lèi)物質(zhì)與多酚氧化酶反應(yīng)的活性也不同。無(wú)核白綠葡萄干清洗前后主要酚類(lèi)物質(zhì)單體中有6種酚類(lèi)單體與多酚氧化酶發(fā)生反應(yīng)，主要為槲皮素、兒茶素、咖啡酸、山奈酚、P-香豆酸、綠原酸。

葡萄干清洗干燥后發(fā)生的褐變主要是酶促褐變，但是非酶促褐變也伴隨其中，這主要是因?yàn)槠咸迅芍械奶欠譃?8 g/100g左右，在清洗之后，需要用熱泵干燥機(jī)快速干燥，干燥溫度為45℃左右。葡萄干在這樣的溫度之下會(huì)發(fā)生一定程度的焦糖化反應(yīng)[23]。這樣就會(huì)影響無(wú)核白綠葡萄干的顏色，發(fā)生輕微的非酶促褐變。

4 結(jié) 論

4.1無(wú)核白綠葡萄干清洗前后P-香豆酸、槲皮素、兒茶素等11種酚類(lèi)物質(zhì)含量減少。

4.2無(wú)核白綠葡萄干多酚氧化酶對(duì)主要酚類(lèi)物質(zhì)的催化褐變活性大小依次為咖啡酸>P-香豆酸>槲皮素>兒茶素>山奈酚>綠原酸，而葡萄干多酚氧化酶對(duì)阿魏酸、原兒茶酸、香草酸、龍膽酸、芥子酸、丁香酸和沒(méi)食子酸無(wú)反應(yīng)活性。說(shuō)明無(wú)核白綠葡萄干清洗酶促褐變的底物主要是槲皮素、綠原酸、咖啡酸、P-香豆酸、山奈酚和兒茶素。

4.3咖啡酸、P-香豆酸、槲皮素、兒茶素和山奈酚這5種酚類(lèi)底物含量變化與葡萄干清洗前后褐變度有顯著的相關(guān)性，這5種酚類(lèi)物質(zhì)對(duì)無(wú)核白綠葡萄干清洗褐變度的影響顯著，而綠原酸對(duì)清洗褐變度的影響不顯著。

4.4酚類(lèi)物質(zhì)咖啡酸、P-香豆酸、槲皮素、兒茶素、山奈酚和綠原酸含量低的綠葡萄干在清洗過(guò)程中褐變程度較小，將此6種酚類(lèi)物質(zhì)含量作為葡萄制干品種選擇和葡萄育種的一項(xiàng)指標(biāo)。