脈沖電場(chǎng)對(duì)AC16人心室肌細(xì)胞的影響?

袁佳櫟 李瑛澤 莫斌峰 饒俊峰 王群山

脈沖電場(chǎng)消融(PFA)是對(duì)不良細(xì)胞/組織施加高強(qiáng)脈沖電場(chǎng),使細(xì)胞發(fā)生不可逆電穿孔(irreversible electroporation,IRE),進(jìn)而凋亡的消融方法。相較于其他細(xì)胞,心肌細(xì)胞對(duì)電穿孔的閾值低[1－3]。因此,PFA 具有較好的組織選擇性,并且無(wú)明顯溫度效應(yīng),使得其在心臟心律失常消融中具有非常大的應(yīng)用前景,能有效減少消融相關(guān)并發(fā)癥。近幾年,大量證據(jù)包括動(dòng)物及臨床實(shí)驗(yàn)證實(shí),心臟PFA 是一種安全、有效的新能量[4－8]。

脈沖電場(chǎng)對(duì)細(xì)胞的研究多集中在腫瘤細(xì)胞中,電穿孔對(duì)體外人心肌細(xì)胞的影響和機(jī)制的研究相對(duì)缺乏。已有部分研究證實(shí)了脈沖電場(chǎng)在小鼠胚胎心肌細(xì)胞H9C2中的作用[9],但脈沖電場(chǎng)在人心肌細(xì)胞的研究尚缺乏。因此,筆者對(duì)于脈沖電場(chǎng)對(duì)體外人心室肌細(xì)胞AC16細(xì)胞的作用和初步機(jī)制進(jìn)行了探索。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 AC16人心室細(xì)胞系,購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院。高糖DMEM 培養(yǎng)基(Cytiva);青霉素/鏈霉素溶液(Yeasen);0.25%胰酶-EDTA(Thermo);澳洲胎牛血清(Cytiva)。無(wú)菌低電導(dǎo)脈沖電場(chǎng)溶液如已有研究所示[9],含有10 mmol/L 磷酸鈉,1 mmol/L氯化鎂,250 mmol/L 蔗糖,將p H 值用氫氧化鈉溶液調(diào)至7.4,再使用0.22μm 濾器(Merck)過濾。臺(tái)盼藍(lán)染色試劑盒(Beyotime);CCK-8試劑盒(Beyotime);Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(Yeasen)。

1.2 脈沖刺激模型的建立 常規(guī)培養(yǎng)人心室肌AC16細(xì)胞于含有10%FBS、1%青霉素/鏈霉素高糖全培養(yǎng)基中,5%CO2、37℃。收集指數(shù)生長(zhǎng)期的AC16細(xì)胞,胰酶消化離心后,用無(wú)菌的低電導(dǎo)溶液制作細(xì)胞懸液,用以避免由于熱效應(yīng)導(dǎo)致的細(xì)胞損傷,并調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為2×106個(gè)/ml。細(xì)胞懸液加入至4 mm 電極杯(BTX)中。對(duì)照組不進(jìn)行電穿孔刺激,實(shí)驗(yàn)組使用ECM830(BTX)電穿孔儀進(jìn)行由低到高不同電壓電刺激。場(chǎng)強(qiáng)設(shè)置為100～2 000 V/cm,脈寬1 ms,脈沖次數(shù)10或40次,頻率2或5 Hz。細(xì)胞在電穿孔刺激后靜置20 min用于穩(wěn)定細(xì)胞膜,再被重懸入等體積上述高糖全培養(yǎng)基中。

1.3 細(xì)胞死亡情況的觀察 使用脈寬1ms,頻率2Hz的單相方波,使用500、750、1 000、1 500 V/cm 的電壓進(jìn)行電穿孔,在電穿孔刺激后20 min,使用Olympus BX51倒置顯微鏡于50×倍鏡下觀察AC16細(xì)胞,細(xì)胞懸浮于20μl DMEM 培養(yǎng)基中。隨后使用臺(tái)盼藍(lán)染料,等比例加入2X 臺(tái)盼藍(lán)染液,染色2～3 min,觀察記錄藍(lán)染的細(xì)胞占整體細(xì)胞總數(shù)的比例。

1.4 細(xì)胞活力的測(cè)定 細(xì)胞活力以線粒體活力即CCK-8法表示。使用脈寬1ms,頻率2 或5Hz,10或40 次刺激的單相方波,電壓分別為100、200、300、400、600、800、1 000、1 200、1 400、1 600、2 000 V/cm,對(duì)細(xì)胞電穿孔刺激后,重懸細(xì)胞于等體積高糖全培養(yǎng)基中,于96 孔板上每孔接種100μL。37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h,待觀察到細(xì)胞鋪展貼壁后,加入10μLCCK-8溶液,混勻后于37℃培養(yǎng)基中孵育1 h,使用EPOCH 酶標(biāo)儀測(cè)定450mm 處的吸光度(OD 值)。各組的細(xì)胞活性用與對(duì)照組的相對(duì)百分比為縱坐標(biāo)表示。且按照之前的研究[9],實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞活力高于對(duì)照組的50%定義為相對(duì)安全。

1.5 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 使用Annexin V-FITC與PI共染色。使用不含EDTA 的胰酶消化收集對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的AC16細(xì)胞,經(jīng)過脈寬1 ms頻率2 Hz,電場(chǎng)強(qiáng)度為500、1 000、1 500的脈沖電場(chǎng)刺激后,300 g,離心5 min收集細(xì)胞。用預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞2次,加入緩沖液調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105個(gè)/ml。每100μL混合液加入5μL Annexin V和10μL PI染色試劑,避光、室溫反應(yīng)15 min。再加入400μL緩沖液混勻后上機(jī)進(jìn)行流式分析,檢測(cè)FITC及PE通道熒光。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 應(yīng)用SPSS 20.0 軟件,所有數(shù)據(jù)均以Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)判斷是否符合正態(tài)分布。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)表示,計(jì)數(shù)資料使用率表示。兩組間比較采用studentt檢驗(yàn),非正態(tài)分布采用Mann-Whitney檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有顯著性。相關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)圖表由Graph Pad Prism 8.0完成。

2 結(jié)果

2.1 脈沖電場(chǎng)刺激后的形態(tài)變化 不同電壓脈沖電場(chǎng)刺激后的形態(tài)見圖1。細(xì)胞電穿孔之前(1A),750 V/cm,脈寬1 ms,頻率2 Hz,10個(gè)脈沖的電場(chǎng)刺激(1B),以及1 500 V/cm 脈沖電場(chǎng)刺激之后(1C)的人體心室細(xì)胞形態(tài)有明顯改變。細(xì)胞明顯水腫、增大,部分裂解。

圖1 不同電壓刺激對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響

2.2 不同電壓脈沖電場(chǎng)刺激后細(xì)胞死亡情況 在0 V/cm 對(duì)照組,500、750、1 000、1 500 V/cm 電場(chǎng)刺激實(shí)驗(yàn)組中記錄臺(tái)盼藍(lán)藍(lán)染細(xì)胞比例。對(duì)照組死亡率2%,500V/cm 組死亡率7.75%、750 V/cm 組死亡率11.25%、1 000 V/cm 組死亡率36.8%、1 500 V/cm 組死亡率85.5%,與對(duì)照組有明顯差異(P＝0.029)。隨著電壓的增高,細(xì)胞不可逆死亡數(shù)量明顯增加。

2.3 不同電壓刺激對(duì)細(xì)胞活性的影響 1 000 V/cm 及以上電壓刺激后細(xì)胞活力明顯降低,且在24 h內(nèi)無(wú)明顯恢復(fù),提示對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生了不可逆性損傷。在24 h后,1 000 V/cm 電場(chǎng)降低細(xì)胞活力為對(duì)照組的46.4%,1 500 V/cm 電場(chǎng)降低細(xì)胞活力為對(duì)照組的29.9%(圖2)。

圖2 不同電壓脈沖電場(chǎng)24 h內(nèi)對(duì)細(xì)胞活力的影響

2.4 不同頻率、次數(shù)對(duì)細(xì)胞活性的影響 電場(chǎng)強(qiáng)度小于1 000 V/cm 時(shí),脈沖電場(chǎng)對(duì)于細(xì)胞CCK-8的OD值大于對(duì)照組的50%,可認(rèn)為該場(chǎng)強(qiáng)相對(duì)安全。當(dāng)電場(chǎng)達(dá)到1 000 V/cm 時(shí),不同組細(xì)胞活力降低為對(duì)照組的23.6%～42.9%,且不同頻率及次數(shù)刺激下均造成細(xì)胞活力下降(圖3)。即對(duì)于AC16細(xì)胞系,1 000 V/cm 以下的電脈沖刺激,即使增加刺激次數(shù)與頻率,也不會(huì)造成額外的細(xì)胞死亡。電場(chǎng)強(qiáng)度達(dá)到1 600～2 000 V/cm 時(shí),細(xì)胞活力降低為對(duì)照組的13.0%～21.0%。且1 ms 5 Hz的閾下刺激,反而能一定程度上增加細(xì)胞活性。

圖3 不同參數(shù)的脈沖電場(chǎng)對(duì)AC16細(xì)胞活力的影響

2.5 不同電壓脈沖電場(chǎng)對(duì)細(xì)胞凋亡、壞死的影響0,500,1 000及1 500 V/cm 的電壓對(duì)細(xì)胞呈現(xiàn)出不同的影響(圖4)。500 V/cm 的場(chǎng)強(qiáng)未明顯改變細(xì)胞狀態(tài)。1 000 V/cm 及1 500 V/cm 的場(chǎng)強(qiáng)刺激后,細(xì)胞與Annexin V 結(jié)合明顯增加,而PI染色能力變化較小,提示細(xì)胞產(chǎn)生早期凋亡表型。

圖4 不同電壓刺激組的流式結(jié)果

3 討論

本研究基于臨床已經(jīng)應(yīng)用的脈沖電場(chǎng)參數(shù)(脈寬1 ms),研究其對(duì)體外人心室肌AC16細(xì)胞系的影響,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞對(duì)電壓反應(yīng)存在閾值(800～1 000 V/cm),閾值之上的電刺激對(duì)細(xì)胞引起明顯死亡,且AC16細(xì)胞的電刺激閾值在一定范圍內(nèi)與頻率與脈沖數(shù)無(wú)關(guān)。我們也初步探索并發(fā)現(xiàn)了脈沖電場(chǎng)可能通過凋亡機(jī)制誘導(dǎo)了細(xì)胞死亡。

高頻脈沖電場(chǎng)能夠誘導(dǎo)納米級(jí)別的孔洞,當(dāng)跨膜電壓足夠大而超過細(xì)胞閾值時(shí),可以產(chǎn)生持續(xù)性的孔洞,從而可能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的變化從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)壞死,這種技術(shù)被稱為IRE。之前對(duì)于腫瘤等多種細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn),細(xì)胞對(duì)于脈沖電場(chǎng)的反應(yīng)存在閾值,即超過此電壓細(xì)胞死亡明顯,而閾值與細(xì)胞的大小、特性有關(guān)。由于不同細(xì)胞閾值不同[1,9],缺少體外對(duì)人體心肌細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。為進(jìn)一步證明脈沖電場(chǎng)消融心臟的安全性,因此本研究探索是否脈沖電場(chǎng)對(duì)人心肌細(xì)胞同樣具有穩(wěn)定的閾值。

與其他研究相同的是,本研究同樣發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞存在明確且固定的閾值約為1 000 V/cm,閾值以下的刺激對(duì)細(xì)胞活力造成的影響短暫且輕微,閾值以上的刺激明顯導(dǎo)致細(xì)胞死亡,且24 h內(nèi)不恢復(fù)。電穿孔后CCK-8的OD 值增加可能與殘存細(xì)胞的再次增殖生長(zhǎng)有關(guān)。曾有研究表明H9C2小鼠心室肌細(xì)胞的閾值為300 V/cm[4],與本研究相差較大,可能是由于細(xì)胞密度、細(xì)胞形態(tài)等影響有關(guān)。需要值得注意的是,脈沖電場(chǎng)所致的電穿孔技術(shù)并不會(huì)造成熱損傷,這也是脈沖消融的選擇特異性的理論基礎(chǔ)所在。研究報(bào)道電壓在1 000 V/cm 的脈沖場(chǎng)僅僅只升高活體組織溫度0.36℃,而2 000 V/cm的脈沖場(chǎng)僅僅升高了1.44℃,遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于消融所需熱損傷的溫度范圍[10],因此可以有效阻止食管損傷、膈神經(jīng)損傷等常見并發(fā)癥。

本研究仍有許多不足之處。①最大的不足之處在于本研究的細(xì)胞暴露在脈沖電場(chǎng)中時(shí)處于懸浮狀態(tài),與貼壁細(xì)胞甚至活體內(nèi)的細(xì)胞形態(tài)仍有較大差距,且脈沖電場(chǎng)的性質(zhì)也與在體研究有明顯不同。而細(xì)胞形態(tài)是影響IRE 閾值的重要因素。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)可能具有更高的證據(jù)等級(jí)。②本研究未對(duì)比不同組織來(lái)源細(xì)胞對(duì)于脈沖電場(chǎng)的閾值是否不同,即未能有效驗(yàn)證脈沖電場(chǎng)對(duì)于心肌細(xì)胞的選擇性消融。③未對(duì)細(xì)胞壞死的機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步闡述。下一步可進(jìn)一步研究脈沖電場(chǎng)對(duì)細(xì)胞離子通道、細(xì)胞內(nèi)自噬/凋亡/壞死相關(guān)通路的影響。

對(duì)于電穿孔的分子機(jī)制,尚無(wú)統(tǒng)一定論。部分已有研究表明,脈寬在毫秒級(jí)別的IRE 導(dǎo)致細(xì)胞組織損毀的機(jī)制主要通過壞死。近期一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)短脈寬(2μs)的脈寬在低電壓下主要導(dǎo)致細(xì)胞凋亡,在高電壓下主要導(dǎo)致細(xì)胞壞死[11]。而在納秒級(jí)別,細(xì)胞死亡主要是由凋亡所介導(dǎo)[12－13],但研究對(duì)象多為腫瘤細(xì)胞,缺乏心肌細(xì)胞相關(guān)證據(jù)。筆者發(fā)現(xiàn),在本研究的細(xì)胞狀態(tài)及脈沖參數(shù)下,細(xì)胞損傷可能由凋亡機(jī)制所導(dǎo)致。但考慮實(shí)體組織時(shí),除了考慮脈沖電場(chǎng)對(duì)細(xì)胞本身的直接影響之外,PFA 可能導(dǎo)致微循環(huán)的損傷,介導(dǎo)組織缺血從而引起組織細(xì)胞的相關(guān)改變。此外部分以往的研究認(rèn)為,施加更長(zhǎng)時(shí)間的脈沖電場(chǎng),更延長(zhǎng)親水孔洞的時(shí)間,更容易使細(xì)胞產(chǎn)生不可逆損傷[1],這與筆者的發(fā)現(xiàn)有所不同:筆者發(fā)現(xiàn)改變次數(shù)與頻率并不明顯增加細(xì)胞死亡的比例。這種特性可能在PFA 的安全性中起到重要作用。除此之外,筆者還發(fā)現(xiàn),閾值以下的刺激在部分情況下反而能夠增加利用CCK-8測(cè)量得到的細(xì)胞活力,這可能與誘導(dǎo)可逆穿孔從而導(dǎo)致檢測(cè)物質(zhì)攝取增加有關(guān)。需要不同方法再次驗(yàn)證。

IRE在實(shí)體腫瘤領(lǐng)域臨床引起廣泛關(guān)注。并且成功并廣泛應(yīng)用在肝臟、前列腺、腎臟等多種器官進(jìn)行腫瘤消融,并且表現(xiàn)出比常規(guī)化療放療更優(yōu)越的安全性和有效性[1]。近年來(lái)諸多臨床研究表明了脈沖電場(chǎng)心臟消融的安全性及有效性。多位學(xué)者在豬模型上進(jìn)行了心外膜與內(nèi)膜的PFA 消融,結(jié)果均證明了其有效性及安全性[4－6]。Reddy 等[7]在2018年首次對(duì)22 名患者進(jìn)行臨床數(shù)據(jù)的收集,發(fā)現(xiàn)PFA 能夠成功達(dá)到肺靜脈隔離,并且手術(shù)過程及術(shù)后無(wú)并發(fā)癥的發(fā)生。Reddy等[8]后續(xù)又報(bào)道了一項(xiàng)共81例的臨床研究,證明了該方法在臨床上的安全性與有效性。因此脈沖電場(chǎng)在臨床上有極大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

人心室肌細(xì)胞對(duì)脈沖電場(chǎng)具有穩(wěn)定的閾值,提示在控制電壓的情況下,就能穩(wěn)定達(dá)到選擇性消融心肌細(xì)胞,為PFA 的安全性及有效性提供了進(jìn)一步的證據(jù)。