甲型流感H3抗原在畢赤酵母系統(tǒng)中的優(yōu)化表達(dá)與純化

陳 溥，李安娜，湯巖松，龍浩雨，劉坤山，周 勉

（華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237）

流感是世界范圍內(nèi)可以同時(shí)感染人和動(dòng)物的傳染性疾病。流感病毒非常活躍，多次在流感季節(jié)“襲擊”全球，逐漸成為全球疾病防控的重點(diǎn)病毒之一。甲型流感病毒為最常見的流感病毒，并且最容易發(fā)生變異。甲型流感病毒的一些亞型如我們熟知的“禽流感”，病毒基因變異后能夠感染人類，感染后的癥狀主要表現(xiàn)為高熱、咳嗽、流涕、肌痛等，多數(shù)伴有嚴(yán)重的肺炎。嚴(yán)重者心、腎等多種臟器衰竭導(dǎo)致死亡，病死率較高。目前，我國(guó)每年仍會(huì)季節(jié)性地受到甲型流感的肆虐，嚴(yán)重危害畜牧業(yè)發(fā)展和人類健康。甲型流感對(duì)人類致病性高，曾多次引起世界性大流行。甲型流感病毒根據(jù)血凝素（hemaglutinin，HA）和神經(jīng)氨酸酶（neuraminidase，NA）抗原性不同，又分為許多亞型，HA可分為17個(gè)亞型（H1～H17），NA有10個(gè)亞型（N1～N10）。1918年以來，HA的2個(gè)亞型（H1和H3）一直在人群中流行，導(dǎo)致高發(fā)病率和高死亡率［1-2］。

甲型流感H3N2是導(dǎo)致人類感染死亡的最主要的毒株之一，而目前防治流感最有效而安全的方式為接種疫苗［3］。傳統(tǒng)制備流感疫苗的方法是在雞胚中培養(yǎng)病毒，滅活純化后即得到經(jīng)典的流感滅活疫苗，其主要抗原成分為流感病毒HA［4］。然而，該方法生產(chǎn)周期長(zhǎng)，需要巨大的工作量，同時(shí)難以對(duì)抗甲型流感抗原的易突變性。因此，開展新型流感疫苗及其關(guān)鍵技術(shù)的研發(fā)仍然是流感研究的熱點(diǎn)。流感病毒基因工程疫苗是近年興起的一門新技術(shù)，是將流感病毒基因片段克隆入合適的表達(dá)載體，在體外表達(dá)病毒抗原后經(jīng)純化制備而成的疫苗，常用的表達(dá)系統(tǒng)有大腸桿菌、酵母、哺乳動(dòng)物細(xì)胞或桿狀病毒等。特別是在流感大流行期間，借助成熟的分子生物技術(shù)和生物發(fā)酵技術(shù)，即可在短時(shí)間內(nèi)研制并生產(chǎn)出大量的流感疫苗以滿足大規(guī)模接種之需。目前，基于不同靶抗原的流感基因工程亞單位疫苗的有效性已經(jīng)在多項(xiàng)研究中得以證實(shí)。

HA蛋白是流感病毒重要表面抗原，以HA為靶抗原的流感病毒基因工程疫苗是目前研究最多的基因工程疫苗。早在二十世紀(jì)七十年代，研究人員就證實(shí)流感病毒表面抗原HA能在試驗(yàn)動(dòng)物中誘導(dǎo)產(chǎn)生有效的特異性抗體。有研究人員使用中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢（Chinese hamster ovary cell，CHO）細(xì)胞表達(dá)重組H7抗原，證實(shí)H7抗原能夠在小鼠中誘導(dǎo)高滴度的中和抗體，賦予小鼠抵抗活病毒攻擊的能力［5］。目前，利用大腸桿菌、酵母、哺乳動(dòng)物細(xì)胞以及植物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)HA（或HA1、HA2亞基）亞單位疫苗均有報(bào)道。例如，F(xiàn)lublok是由Protein Sciences公司所開發(fā)的一種三價(jià)季節(jié)性流感疫苗，是利用桿狀病毒昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)分別表達(dá)H1N1、H3N2和B型3株病毒的HA，經(jīng)純化后混合制備而成［6］。Flublok已經(jīng)相繼在3 000多名志愿者人群中開展了4項(xiàng)臨床研究，結(jié)果顯示其在各年齡組人群中都具有良好的安全性，可誘導(dǎo)良好的免疫應(yīng)答。Flublok于2013年1月獲得美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于流感的預(yù)防，是第一個(gè)獲得批準(zhǔn)上市的重組亞單位疫苗［7］。植物來源的流感病毒樣顆粒（virus-like particle，VLP）也是近年來的研究熱點(diǎn)。D’Aoust等［8-9］將流感病毒HA基因通過農(nóng)桿菌滲入法轉(zhuǎn)化本塞姆煙草后，在植物葉片中成功提取到了一種新型的含HA的VLP。動(dòng)物試驗(yàn)顯示，小鼠在給予1劑0.1 μg的VLP肌肉注射后即可產(chǎn)生相當(dāng)高水平的免疫應(yīng)答，2劑0.5 μg的VLP免疫后可保護(hù)小鼠免受來自相同亞型但不同分支的流感病毒致死量攻擊。至今，包括2009新甲型H1N1流感病毒在內(nèi)的多種病毒的植物表達(dá)VLP均已成功制備，并在動(dòng)物試驗(yàn)中顯示了巨大潛能［10］。相關(guān)臨床研究表明VLP疫苗在人體的安全性、耐受性以及誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答水平均較好［11-12］。

巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)是一種可以利用甲醇作為唯一碳源進(jìn)行生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)型酵母，具有所需培養(yǎng)基成分簡(jiǎn)單便宜、分子操作簡(jiǎn)單方便、生長(zhǎng)較快等優(yōu)勢(shì)。自二十世紀(jì)八十年代以來，畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)逐漸被廣泛用于外源蛋白的表達(dá)生產(chǎn)。到目前為止，畢赤酵母已成為僅次于大腸桿菌的第二大表達(dá)系統(tǒng)，被廣泛用于外源蛋白的表達(dá)以及結(jié)構(gòu)解析等方面。據(jù)RTC公司統(tǒng)計(jì)，至今畢赤酵母中成功表達(dá)出的蛋白多達(dá)5 000多個(gè)，且有1 500多個(gè)學(xué)術(shù)機(jī)構(gòu)和工業(yè)實(shí)驗(yàn)室將畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)用于科研和工業(yè)化生產(chǎn)，70多個(gè)畢赤酵母表達(dá)的商業(yè)化產(chǎn)品成功上市（http://www.pichia.com/）。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)屬于真核表達(dá)系統(tǒng)，具有翻譯后修飾能力，因而可以快速制備具有糖基化結(jié)構(gòu)的HA抗原，并且適合于在發(fā)酵罐中進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)，所以它是能應(yīng)對(duì)流感暴發(fā)的理想表達(dá)系統(tǒng)［13］。根據(jù)最新文獻(xiàn)，已有研究團(tuán)隊(duì)成功使用畢赤酵母系統(tǒng)來進(jìn)行H1抗原的表達(dá)，研制了亞單位疫苗，并在小鼠中進(jìn)行了免疫［14］。但是目前H3抗原的重組表達(dá)和疫苗研制還沒有研究團(tuán)隊(duì)嘗試過。

密碼子優(yōu)化是重組蛋白表達(dá)過程中常用的策略。在任一物種中，密碼子的使用頻率往往和編碼對(duì)應(yīng)反密碼子的tRNA基因拷貝數(shù)、tRNA的表達(dá)量成正相關(guān)［15］。表達(dá)量較高的基因中多使用常見密碼子，這也被認(rèn)為是自然選擇的結(jié)果，可以讓高度表達(dá)的基因更有效和精確地被翻譯。近年來不斷有研究顯示，密碼子偏好除了調(diào)控mRNA的翻譯速率，也通過共翻譯折疊影響著蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能［16-17］。密碼子頻率與蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)混亂度的負(fù)相關(guān)性也在粗糙脈孢菌、酵母、果蠅、小鼠等基因組中被發(fā)現(xiàn)，二級(jí)結(jié)構(gòu)混亂度較高的區(qū)域總是傾向于使用稀有密碼子。這可能是一種降低翻譯速率給予更多時(shí)間可供折疊的機(jī)制，而對(duì)于這些區(qū)域過度的密碼子優(yōu)化則有可能影響其正常的結(jié)構(gòu)與蛋白質(zhì)功能［18］。

因此，本研究首先參照畢赤酵母基因組對(duì)甲型流感病毒H3抗原進(jìn)行科學(xué)的密碼子優(yōu)化設(shè)計(jì)，目標(biāo)是提高其在畢赤酵母系統(tǒng)中的蛋白質(zhì)表達(dá)并維持正確的結(jié)構(gòu)功能［19-20］；隨后，使用甲醇誘導(dǎo)型高效啟動(dòng)子PAOX1分泌表達(dá)優(yōu)化后的H3基因，構(gòu)建高拷貝的畢赤酵母重組菌株；最后，通過金屬離子親和層析技術(shù)，對(duì)H3抗原進(jìn)行純化分離，為下一步動(dòng)物體內(nèi)免疫打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株：本研究所用酵母菌株均在GS115基礎(chǔ)上構(gòu)建，大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞為DH5α菌株。質(zhì)粒：本研究克隆H3基因使用pPICZα質(zhì)粒，帶有AOX1啟動(dòng)子、alpha因子分泌序列、組氨酸（6×his）標(biāo)簽和博來霉素（Zeocin）抗性。試劑：質(zhì)粒抽提試劑盒購(gòu)自生工生物工程（上海）；H3和引物序列合成由蘇州金唯智生物科技有限公司完成；針對(duì)6×his標(biāo)簽的一抗和二抗購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；純化用鈷柱購(gòu)自ThermoFisher公司；無縫克隆試劑盒購(gòu)自諾唯贊公司；其他化學(xué)品試劑購(gòu)自華東理工大學(xué)材料平臺(tái)。

1.2 H3基因密碼子優(yōu)化及序列合成

從NCBI網(wǎng)站獲得甲型流感病毒［A/New York/392/2004(H3N2)］H3抗原基因的原始序列（NC_007366），利用IUPRED在線工具（https://iupred2a.elte.hu/）對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)混亂度分析。根據(jù)Codon Usage Database （http://www.kazusa.or.jp/codon/）獲得畢赤酵母基因組高表達(dá)基因中各密碼子的使用頻率ω，計(jì)算同義密碼子的相對(duì)使用頻率。基因的密碼子適應(yīng)指數(shù)（codon adaptation index，CAI）曲線根據(jù)各密碼子的相對(duì)使用頻率數(shù)據(jù)繪制，滑動(dòng)框采用15個(gè)密碼子。密碼子優(yōu)化后序列交由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

1.3 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則利用SnapGene軟件設(shè)計(jì)引物，并將其交給蘇州金唯智生物科技有限公司合成，引物序列見表1。

表1 引物設(shè)計(jì)Tab. 1 Primer design

1.4 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

將基因片段使用無縫克隆插入pPICZα質(zhì)粒的alpha因子分泌序列之后，末端保留His和Myc標(biāo)簽。構(gòu)建好的質(zhì)粒使用大腸桿菌擴(kuò)增，測(cè)序驗(yàn)證基因序列的正確性。

1.5 電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母及多拷貝的菌株篩選

構(gòu)建好的質(zhì)粒經(jīng)BlnI酶切線性化后與新鮮制備的畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞混合，轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的電擊杯進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化結(jié)束后加入1 mL冰凍的1 mol/L山梨醇溶液和1 mL酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基（yeast extract peptone dextrose medium，YPD）復(fù)蘇2～3 h，離心，涂帶有高質(zhì)量濃度Zeocin抗生素（0.7 mg/mL）的平板。

2～3 d后挑選出Zeocin抗性平板長(zhǎng)出的單菌落，YPD培養(yǎng)-洗菌-緩沖復(fù)合甲醇培養(yǎng)基（buffered methanol-complex medium，BMMY）培養(yǎng)誘導(dǎo)H3表達(dá)，取上清進(jìn)行組氨酸標(biāo)簽的Western blot驗(yàn)證，篩選目的基因表達(dá)量最高的轉(zhuǎn)化株。

1.6 聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）和蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）

將發(fā)酵液離心，取上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳，上樣量為20 μL。濃縮膠使用電壓80 V，分離膠使用電壓100 V。電泳恒壓100 V轉(zhuǎn)膜1.5 h，進(jìn)行Western blot。一抗使用6×his單克隆抗體，二抗使用辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記山羊抗小鼠IgG抗體。

1.7 H3抗原的表達(dá)與純化

酵母菌株使用YPD培養(yǎng)基培養(yǎng)，當(dāng)菌株懸液在600 nm波長(zhǎng)處的光密度值為2～6時(shí)，將菌株用無菌水洗滌3次后轉(zhuǎn)移到BMMY（含1%甲醇）培養(yǎng)基誘導(dǎo)表達(dá)。每24 h補(bǔ)充1次甲醇，誘導(dǎo)72 h后離心收集上清。培養(yǎng)溫度為30℃。

純化H3抗原時(shí)，首先通過10 kD孔徑超濾膜包將發(fā)酵液上清濃縮10倍。在濃縮后的上清中加入等量的平衡緩沖液并調(diào)pH至7.4，加入鈷柱中與介質(zhì)充分結(jié)合。分別使用含5 mmol/L和150 mmol/L咪唑的緩沖液進(jìn)行洗滌和洗脫。將含目標(biāo)蛋白H3的數(shù)管洗脫液合并，使用30 kD超濾管超濾去除雜帶、濃縮目標(biāo)蛋白。將以上操作得到的樣品進(jìn)行蛋白電泳檢測(cè)，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色和Western blot對(duì)表達(dá)和純化的效果進(jìn)行表征。

1.8 紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)

血凝試驗(yàn)于96孔V型微量反應(yīng)板上進(jìn)行。每孔分別加入50 μL不同濃度的H3蛋白樣品，陰性對(duì)照加入磷酸緩沖液（phosphote buffered saline，PBS），再依次加入1%雞紅細(xì)胞懸液50 μL，混勻后棄去50 μL。振板1 min后靜置，45～50 min后觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 密碼子優(yōu)化

首先，我們從NCBI網(wǎng)站下載了H3抗原的原始基因序列，分析了其在畢赤酵母基因組中的CAI曲線（圖1，藍(lán)色曲線）和蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)混亂度曲線（圖2），設(shè)計(jì)密碼子優(yōu)化方案。總體原則是適當(dāng)降低二級(jí)結(jié)構(gòu)混亂度較高區(qū)域的密碼子優(yōu)化程度，減少密碼子優(yōu)化對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的影響。二級(jí)結(jié)構(gòu)混亂度小于0.5的區(qū)域替換為相對(duì)使用頻率最高的同義密碼子，二級(jí)結(jié)構(gòu)混亂度大于0.5的區(qū)域替換為相對(duì)使用頻率次高的同義密碼子，得到優(yōu)化后序列。將優(yōu)化前后的堿基序列繪制 CAI 曲線進(jìn)行比對(duì)，可以明顯看到CAI值的整體提高（圖1，紅色曲線）。

圖1 H3基因的CAI曲線Fig. l CAI curve of H3 gene

圖2 H3蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)紊亂度曲線Fig. 2 Protein secondary structural disorder curve of H3

2.2 表達(dá)載體的構(gòu)建

我們將合成的H3基因片段亞克隆入pPICZα載體得到質(zhì)粒pPICZα-H3（圖3）。

圖3 pPICZα-H3質(zhì)粒圖譜Fig. 3 Plasmid map of pPICZα-H3

測(cè)序和酶切電泳結(jié)果表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。如圖4所示，其中編號(hào)為2-4和1-4的菌株對(duì)應(yīng)的泳道與理論上目的條帶的大小一致。將該質(zhì)粒在AOX1啟動(dòng)子內(nèi)部線性化后電轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115菌株，篩選高表達(dá)轉(zhuǎn)基因菌株。

圖4 質(zhì)粒構(gòu)建的驗(yàn)證結(jié)果圖Fig. 4 Verification of plasmid construction

2.3 H3抗原的表達(dá)與純化

重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化入畢赤酵母中后，通過增加Zeocin抗性質(zhì)量濃度的方式篩選目標(biāo)蛋白表達(dá)量最高的重組菌株。選取1.0～1.5 mg/mL Zeocin抗性平板上長(zhǎng)出的重組菌落，經(jīng)培養(yǎng)和甲醇誘導(dǎo)表達(dá)后，通過考馬斯亮藍(lán)染色和Western blot檢測(cè)目標(biāo)蛋白，挑選表達(dá)量最高的菌株進(jìn)行后續(xù)純化。如圖5所示，菌株1-3和菌株2-5具備相對(duì)較高的H3表達(dá)水平，因此選擇菌株1-3進(jìn)行后續(xù)的表達(dá)純化步驟。

圖5 Western blot篩選H3高表達(dá)菌株Fig. 5 Screening for highly efficient H3 expressing strains by Western blot analysis

隨后，我們進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)和誘導(dǎo)重組菌，摸索了最優(yōu)的培養(yǎng)條件（時(shí)間與濃度），獲得了含目標(biāo)蛋白的上清，通過超濾濃縮、親和層析純化H3蛋白。使用考馬斯亮藍(lán)染色和Western blot檢測(cè)了純化結(jié)果。從洗脫組分來看，純化后蛋白中存在全長(zhǎng)的H3蛋白，但也存在一定程度的降解組分（圖6和圖7，Lane 10）。經(jīng)嘗試，通過控制超濾孔徑并多次超濾的方式可以有效地除去大多數(shù)降解條帶，保留較高純度的H3全長(zhǎng)條帶（圖6和圖7，Lanes 11～14）。

圖6 H3蛋白純化考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果圖Fig. 6 H3 protein purification analyzed by coomassie brilliant blue staining

圖7 H3蛋白純化 Western blot結(jié)果圖Fig. 7 H3 protein purification by Western blot analysis

2.4 H3抗原的紅細(xì)胞凝集活性檢測(cè)

流感病毒表面的HA蛋白可與紅細(xì)胞表面唾液酸位點(diǎn)結(jié)合，導(dǎo)致紅細(xì)胞凝集，這也是血凝素名字的由來。因此，接下來我們檢測(cè)了通過重組表達(dá)與純化得到的H3抗原是否具有紅細(xì)胞凝集活性。紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)顯示，0.07～0.35 mg/mL的H3重組蛋白不具備血凝活性。當(dāng)H3抗原位于流感病毒表面時(shí)，病毒顆粒作為承載核心起到相對(duì)富集的作用，而純化分離得到的H3抗原則分散溶解在溶液中，可能影響其血凝活性。因此，我們嘗試用結(jié)合H3抗原的鎳柱填料模擬病毒顆粒，并以空載鎳柱填料作為對(duì)照測(cè)試血凝活性。結(jié)果顯示，與PBS陰性對(duì)照相比，空鎳柱填料展示出一定程度的血凝活性，可能由填料本身的非特異性結(jié)合造成，而H3結(jié)合的鎳柱填料表現(xiàn)出相對(duì)更強(qiáng)的血凝活性。

3 討論

本研究選取常見流感病毒株的HA基因，在密碼子使用偏好分析和蛋白質(zhì)混亂度分析的基礎(chǔ)上對(duì)其進(jìn)行了密碼子優(yōu)化，隨后采用優(yōu)化序列進(jìn)行了克隆表達(dá)及酵母轉(zhuǎn)基因菌株構(gòu)建。在確認(rèn)H3抗原在畢赤酵母系統(tǒng)中成功表達(dá)后，我們嘗試了蛋白純化分離技術(shù)。本研究采用新型的密碼子優(yōu)化方法對(duì)H3基因進(jìn)行優(yōu)化，除了考慮密碼子使用頻率優(yōu)勢(shì)，還考慮到蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)混亂度，希望避免過度優(yōu)化導(dǎo)致蛋白失去原有的結(jié)構(gòu)和功能的現(xiàn)象。從目前的純化結(jié)果來看，H3蛋白可以通過親和層析進(jìn)行分離，表達(dá)過程中的降解條帶亦可以通過超濾有效去除。純化獲得的H3抗原溶液本身不表現(xiàn)出血凝活性，但是與鎳柱填料結(jié)合富集后表現(xiàn)出一定程度的血凝活性。

畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)能高效分泌蛋白，并且適合在發(fā)酵罐中高密度生長(zhǎng)，大規(guī)模發(fā)酵［21-22］。有研究與我們的結(jié)果類似，顯示在畢赤酵母中重組表達(dá)獲得的H7抗原在溶液狀態(tài)也不表現(xiàn)出血凝活性，但是仍然具備在小鼠中誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性抗體的功能［23］。另有研究顯示，畢赤酵母系統(tǒng)中1 L培養(yǎng)基可以純化出200 mg H5的HA胞外結(jié)構(gòu)域蛋白，用該蛋白免疫雞可以保護(hù)其不受H5N1禽流感病毒的感染［24］。因此，本課題的后續(xù)研究有潛力實(shí)現(xiàn)H3抗原的大規(guī)模表達(dá)生產(chǎn)，助力疫苗研發(fā)。