擬康寧木霉對(duì)甲基橙廢水的酶促降解研究

王海琪，林 斌，潘碩濱，林錦美?

（集美大學(xué) a. 海洋食品與生物工程學(xué)院；b. 港口與環(huán)境工程學(xué)院，廈門(mén) 361021）

甲基橙（methyl orange）因具有顯色劑性質(zhì)且含有偶氮基而可作為偶氮染料。偶氮染料是現(xiàn)在染料市場(chǎng)中品種數(shù)量上最多的一種染料，因其合成簡(jiǎn)單、成本低廉、染色性能突出等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于紡織業(yè)、造紙廠工業(yè)生產(chǎn)中多種天然和合成纖維的染色和印花。偶氮染料通常含有復(fù)雜的芳香環(huán)結(jié)構(gòu)，具有化學(xué)穩(wěn)定性高、生物可降解性低等特點(diǎn)。多數(shù)染料及其代謝中間產(chǎn)物具有突變性、致癌性和其他毒性［1-3］。目前，投放市場(chǎng)的染料全世界多達(dá)30 000多種，每年排放到環(huán)境中的染料就高達(dá)600 000多噸［1-2］。甲基橙作為染料廢水中較難降解的一種偶氮類(lèi)化合物［3］，需要一種經(jīng)濟(jì)高效的染料廢水處理技術(shù)為其解決工業(yè)污染問(wèn)題提供有力支持。相比于物理法和化學(xué)法，生物法具有吸附容量大、選擇性強(qiáng)、效率高、消耗少、費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn)［4-5］。基于此，本研究選取擬康寧木霉菌種（Trichoderma koningii），通過(guò)馴化，先考察氮源、碳源、pH等因素對(duì)該菌種生長(zhǎng)情況和甲基橙脫色率的影響；然后在該菌種生長(zhǎng)的最佳培養(yǎng)條件下提取胞內(nèi)酶后，通過(guò)研究初始甲基橙濃度、pH、反應(yīng)溫度、酶液投加量對(duì)甲基橙酶促降解的單因素和正交試驗(yàn)，得出擬康寧木霉胞內(nèi)酶去除甲基橙廢水的最優(yōu)條件，初步揭示了擬康寧木霉降解甲基橙廢水的較優(yōu)酶促降解條件和機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌種與培養(yǎng)基

本研究所用擬康寧木霉菌種由本實(shí)驗(yàn)室提供，所用培養(yǎng)基為培養(yǎng)真菌常用的土豆培養(yǎng)基（土豆200.0 g/L，葡萄糖25.4 g/L，瓊脂25.4 g/L，磷酸二氫鉀2.1 g/L，硫酸鎂 2.1 g/L）［4］。將擬康寧木霉菌種接種在滅菌后的培養(yǎng)基上，在24℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d。

梯度馴化：在已接種的固體培養(yǎng)基中依次加入一系列不同質(zhì)量濃度的甲基橙放入培養(yǎng)皿中，在24℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行菌種的培養(yǎng)馴化。將每一批從質(zhì)量濃度最高的培養(yǎng)基中選出馴化好的菌種接種入下一批更大質(zhì)量濃度的培養(yǎng)基中，將最終的優(yōu)勢(shì)菌種接種于甲基橙質(zhì)量濃度為100 mg/L的固體培養(yǎng)基中保藏備用［7］。

1.1.2 模擬廢水

甲基橙模擬廢水的配制：稱(chēng)取1 g的甲基橙于1 L的燒杯中，用超純水溶解后倒入1 L容量瓶中定容，配制成1 000 mg/L的樣品溶液備用。

1.1.3 儀器與試劑

主要儀器：可見(jiàn)分光光度計(jì)（WFJ7200）、超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（YXQ-LS-30SI）、智能生化培養(yǎng)箱（PHX）、恒溫振蕩器（SHA-C）、高速冷凍離心機(jī)（Avanti J-26XP）。

主要試劑：葡萄糖（分析純）、磷酸二氫鉀（分析純）、硫酸鎂（分析純）、瓊脂粉、氫氧化鈉（分析純）、硝酸（分析純）、甲基橙、磷酸二氫鈉（分析純）、十二水合磷酸氫二鈉（分析純）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 甲基橙標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

分光光度法測(cè)定色度：取質(zhì)量濃度為50 mg/L的甲基橙溶液于紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)上，在250～600 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，甲基橙的最大吸收波長(zhǎng)為463 nm。

取上述配制的甲基橙溶液分別制成0、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00 mg/L的甲基橙溶液，待溶液充分混勻后測(cè)定吸光度。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)見(jiàn)圖1。

圖1 甲基橙的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig. 1 The standard curve of methyl orange

在甲基橙的最大吸收波長(zhǎng)463 nm下測(cè)定每批處理前、后溶液的吸光度值A(chǔ)0、A。

標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的計(jì)算公式如下：

式（1）中，A為吸附染料后溶液的吸光度，A0為吸附染料前溶液的吸光度。

1.2.2 模擬廢水樣的預(yù)處理及測(cè)定

將震蕩后的水樣通過(guò)0.45 μm濾膜過(guò)濾，水樣的吸光度測(cè)定步驟同1.2.1所述。

1.2.3 擬康寧木霉酶的提?。?］

胞內(nèi)酶提?。壕? 000 r/min離心15 min，收集菌體。將收集到的菌體用pH 7.0的0.05 mol/L 磷酸鹽緩沖溶液（Na2HPO4-NaH2PO4）洗滌3次，離心收集菌體。以1.0 g 濕菌體添加3 mL磷酸鹽緩沖液的比例，將菌體懸浮于緩沖溶液中，置于冰浴中用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)的中粗探頭處理10 次，每次1 min，功率為300 W，破碎時(shí)間為5 s，間隔5 s。最后離心除去細(xì)胞碎片，得到胞內(nèi)酶液。

1.2.4 擬康寧木霉生長(zhǎng)前期處理甲基橙廢水可行性試驗(yàn)

菌種培養(yǎng)條件的探索：在含有甲基橙的液體培養(yǎng)基150 mL中接種馴化完畢的擬康寧木霉菌，在30℃、140 r/min的恒溫振蕩器內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)過(guò)程中測(cè)定吸光度并計(jì)算脫色率［9-10］。

1.2.5 擬康寧木霉酶處理甲基橙廢水單因素試驗(yàn)

分別從甲基橙濃度、pH、溫度、酶投加量4個(gè)因素探討對(duì)擬康寧木霉酶促降解的影響［11-12］。

1.2.6 擬康寧木霉酶促降解正交試驗(yàn)

為了尋求最佳配比關(guān)系，本次正交試驗(yàn)采用L9（33）的標(biāo)準(zhǔn)表，即三因素、三水平，共需完成9次試驗(yàn)。9組試驗(yàn)分別于最佳甲基橙質(zhì)量濃度的條件下反應(yīng)4 h后，測(cè)其吸光度并計(jì)算脫色率［13-14］。

1.2.7 擬康寧木霉菌酶促降解最適試驗(yàn)

在正交試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取最佳的酶液投加量、水浴溫度、pH、甲基橙初始質(zhì)量濃度進(jìn)行反應(yīng)，每隔一段時(shí)間檢測(cè)吸光度并計(jì)算去除率，觀察染料處理情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 氮源（甲基橙）對(duì)擬康寧木霉培養(yǎng)過(guò)程脫色與生長(zhǎng)量的影響

培養(yǎng)基中甲基橙質(zhì)量濃度分別為10、30、50、70、100、150 mg/L，接種后培養(yǎng)72 h，取出測(cè)定吸光度與菌種重量，并計(jì)算甲基橙脫色率。由圖2可知：當(dāng)甲基橙初始質(zhì)量濃度為10～30 mg/L時(shí)，擬康寧木霉菌對(duì)甲基橙廢水的脫色效果逐漸增加；30 mg/L時(shí)甲基橙脫色率達(dá)到最大，脫色率可達(dá)74.53%，同時(shí)菌重也達(dá)到最大；30 mg/L后脫色效果逐漸下降。

圖2 氮源對(duì)擬康寧木霉生長(zhǎng)前期脫色率與生長(zhǎng)量的影響Fig. 2 Effects of nitrogen source on decolorization rate and growth amount of Trichoderma koningii in early growth period

擬康寧木霉在低質(zhì)量濃度甲基橙的情況下，可以將甲基橙作為自身氮源轉(zhuǎn)化利用，對(duì)甲基橙的脫色效果較佳；但過(guò)高質(zhì)量濃度的甲基橙對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)存在較大的阻礙作用，當(dāng)甲基橙的質(zhì)量濃度達(dá)到100 mg/L以后，菌量的減少量放緩，擬康寧木霉生長(zhǎng)受到限制。故取甲基橙質(zhì)量濃度為30 mg/L作為較佳的氮源。

2.2 碳源(葡萄糖)對(duì)擬康寧木霉培養(yǎng)過(guò)程脫色與生長(zhǎng)量的影響

制備含甲基橙質(zhì)量濃度為30 mg/L的培養(yǎng)基6份，分別加入葡萄糖使其質(zhì)量濃度為10、15、20、25、30、40 g/L，同2.1處理后計(jì)算脫色率。由圖3可知，脫色率隨葡萄糖質(zhì)量濃度的增大呈S型，當(dāng)質(zhì)量濃度增大至25 g/L后趨于穩(wěn)定，菌體干重隨著葡萄糖質(zhì)量濃度的增大而上升。據(jù)推測(cè)，隨著培養(yǎng)基中葡萄糖的質(zhì)量濃度增加引起擬康寧木霉酶的碳氮比變化，酶的產(chǎn)生受到抑制，導(dǎo)致脫色率降低。故設(shè)定葡萄糖質(zhì)量濃度為25 g/L作為最佳碳源濃度［15］。

圖3 碳源對(duì)擬康寧木霉生長(zhǎng)前期脫色及生長(zhǎng)量的影響Fig. 3 Effects of carbon sources on decolorization and growth of Trichoderma koningii in early growth period

2.3 pH對(duì)擬康寧木霉培養(yǎng)過(guò)程脫色與生長(zhǎng)量的影響［16］

分別配制pH為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、8.0、8.5含甲基橙濃度為30 mg/L的培養(yǎng)基7份，接種馴化后的擬康寧木霉，同2.1處理并計(jì)算甲基橙脫色率。由圖4可知：隨著pH增加，染料脫色效果顯著提高，菌量也逐漸增加；當(dāng)pH為6.5時(shí)，脫色率達(dá)到最大，菌量趨于平緩；當(dāng)pH大于6.5時(shí)，甲基橙脫色率逐漸下降，到pH為8.5時(shí)達(dá)到最低，菌量也隨之下降。故選取擬康寧木霉生長(zhǎng)pH為6.0～6.5。

圖4 pH對(duì)擬康寧木霉生長(zhǎng)前期脫色率與生長(zhǎng)量的影響Fig. 4 The influence of pH on decolorization rate and growth amount of Trichoderma koningii in early growth period

2.4 甲基橙質(zhì)量濃度對(duì)擬康寧木霉酶促降解效果的影響

配制甲基橙質(zhì)量濃度分別為20、40、60、80、100、120 mg/L的磷酸鹽緩沖溶液，預(yù)熱10 min后取3.0 mL 加入0. 3 mL粗酶液，在溫度30℃水浴中反應(yīng)4 h，終止酶反應(yīng)后測(cè)定甲基橙吸光度，并計(jì)算脫色率。由圖5可知，隨著甲基橙濃度的升高，擬康寧木霉胞內(nèi)酶的酶促降解效果降低。這可能是因?yàn)榧谆荣|(zhì)量濃度增加，擬康寧木霉胞內(nèi)酶受到抑制，酶促降解受到影響，甲基橙去除率逐漸下降。在低濃度情況下甲基橙的去除效率相對(duì)較高，故選取30 mg/L作為甲基橙反應(yīng)的質(zhì)量濃度。

圖5 甲基橙濃度對(duì)擬康寧木霉酶促降解效果的影響Fig. 5 Effects of methyl orange concentration on enzymatic degradation of Trichoderma koningii

2.5 pH對(duì)擬康寧木霉酶促降解效果的影響

配制含甲基橙質(zhì)量濃度為30 mg/L的磷酸鹽緩沖溶液，使其pH分別為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，同2.4處理并計(jì)算甲基橙脫色率。由圖6可知：隨著時(shí)間的推移，pH較低時(shí)，甲基橙的脫色率不高；pH在5.0～7.0時(shí)，酶促降解效果逐漸增加，pH為7.0時(shí)，脫色率最大；當(dāng)pH大于7.0時(shí)，去除率逐漸下降，當(dāng)pH為8.5時(shí)，脫色率達(dá)到最低。過(guò)高、過(guò)低的pH都會(huì)影響酶的穩(wěn)定性，進(jìn)而使酶遭到不可逆性的破壞。故選取擬康寧木霉胞內(nèi)酶在偏中性的條件下反應(yīng)［17］。

圖6 pH對(duì)擬康寧木霉酶促降解效果的影響Fig. 6 Effects of pH on enzymatic degradation of Trichoderma koningii

2.6 溫度對(duì)擬康寧木霉酶促降解效果的影響

配制pH為7.0的含甲基橙質(zhì)量濃度為30 mg/L的磷酸鹽緩沖溶液，取3.0 mL加入0.3 mL粗酶液，分別在溫度為20、25、30、35、40、45℃的水浴中反應(yīng)，同2.4處理并計(jì)算脫色率。如圖7可見(jiàn)：當(dāng)反應(yīng)溫度小于30℃時(shí)，隨著時(shí)間的推移和溫度的增加，染料脫色效果顯著提高，反應(yīng)溫度大于35℃后，脫色率急劇下降；溫度在25～35℃時(shí)，脫色率較高，在25℃時(shí)達(dá)到最大。以上結(jié)論說(shuō)明，擬康寧木霉的酶促降解必須在適宜的溫度范圍內(nèi)才能擁有較高的酶活力，溫度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致酶失活，溫度過(guò)低容易使酶的活性受到抑制，影響甲基橙的去除效果，而該酶能在25～35℃范圍內(nèi)保持較高的脫色率，說(shuō)明該酶能在較寬的溫度范圍內(nèi)保持較高的活性。

圖7 溫度對(duì)擬康寧木霉酶促降解的影響Fig. 7 The effects of temperature on enzymatic degradation of Trichoderma koningii

2.7 酶液投加量對(duì)擬康寧木霉酶促降解效果的影響

預(yù)熱2.6中含甲基橙質(zhì)量濃度為30 mg/L的磷酸鹽緩沖液3.0 mL，分別加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL粗酶液，并在25℃水浴中反應(yīng)，同2.4處理并計(jì)算脫色率。如圖8所示，隨著時(shí)間的推移，甲基橙的脫色率逐漸提高。當(dāng)酶液投加量增多時(shí)，甲基橙的脫色率趨于穩(wěn)定，甚至出現(xiàn)下滑。根據(jù)米曼公式，酶促反應(yīng)速率和酶濃度成正比，適當(dāng)增加酶液投加量可以提高擬康寧木霉對(duì)甲基橙的去除效果，但酶液投加過(guò)多會(huì)使擬康寧木霉的降解酶趨于飽和，因營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的限制，各降解酶之間的競(jìng)爭(zhēng)加大，使得脫色率無(wú)法提升，甚至有所降低。

圖8 酶液投加量對(duì)擬康寧木霉酶促降解的影響Fig. 8 The effects of the dosage of enzyme solution on enzymatic degradation of Trichoderma koningii

2.8 擬康寧木霉酶促降解正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定了酶液投加量、溫度、pH為正交試驗(yàn)的因素，設(shè)定了3個(gè)水平進(jìn)行酶促反應(yīng)，以脫色率為指標(biāo)進(jìn)行考察。

由表2可知，將影響酶促降解效果的因素按從大到小排列，酶液投加量＞反應(yīng)溫度＞pH。由極差分析可知最優(yōu)條件：酶液投加量為0.6 mL，反應(yīng)溫度為25℃，pH為 7.0。

表2 擬康寧木霉酶促降解正交試驗(yàn)表Tab. 2 Orthogonal experimental table for enzymatic degradation of Trichoderma pseudokoningii

2.9 擬康寧木霉酶促降解最適反應(yīng)條件

在酶液投加量為0.6 mL，水浴溫度為25℃，pH為7.0，甲基橙初始濃度為30 mg/L的情況下反應(yīng)，每隔一段時(shí)間檢測(cè)吸光度并計(jì)算甲基橙脫色率，觀察染料處理情況。由圖9可知，在最適條件下擬康寧木霉對(duì)甲基橙的酶促降解效果明顯，甲基橙的脫色率最高可達(dá)到85.48%。

圖9 最適條件下甲基橙酶促降解試驗(yàn)Fig. 9 Enzymatic degradation of methyl orange under optimal conditions

2.10 擬康寧木霉酶處理甲基橙模擬廢水機(jī)理初步探索

真菌是通過(guò)自由基過(guò)程實(shí)現(xiàn)對(duì)污染物的化學(xué)轉(zhuǎn)化的，自由基反應(yīng)具有高度非特異性?；瘜W(xué)物的降解過(guò)程是準(zhǔn)一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程。利用McKinney模式，在好氧反應(yīng)過(guò)程中，基質(zhì)的代謝過(guò)程是被基質(zhì)的量所控制的，并且基質(zhì)的代謝速度遵循一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)［18-20］。

對(duì)于一級(jí)動(dòng)力學(xué)反應(yīng)：

兩邊積分有：lnC0/C=kt+b（k為反應(yīng)常數(shù)，C、C0分別表示t、t0時(shí)刻基質(zhì)濃度）。

以ln（C0/Ci）對(duì)t作圖，得到一直線(xiàn)，由此來(lái)驗(yàn)證擬康寧木霉菌降解甲基橙廢水反應(yīng)為一級(jí)動(dòng)力學(xué)反應(yīng)（圖10）。

圖10 擬康寧木霉菌降解甲基橙模擬廢水動(dòng)力學(xué)模型Fig. 10 Kinetic model of simulated wastewater degradation by Trichoderma koningii

根據(jù)最佳條件下試驗(yàn)所得結(jié)果，以ln(C/C0)對(duì)t回歸，得

根據(jù)式（2），可以估計(jì)擬康寧木霉菌將甲基橙完全降解所需要的時(shí)間，以及降解到某一時(shí)刻甲基橙的質(zhì)量濃度。擬康寧木霉菌處理甲基橙模擬廢水的動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果與數(shù)據(jù)表明，擬康寧木霉菌處理甲基橙廢水屬于一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)。

3 討論

本文在較佳培養(yǎng)條件下培養(yǎng)出擬康寧木霉，提取其胞內(nèi)酶，通過(guò)研究初始甲基橙濃度、pH、反應(yīng)溫度、酶液投加量對(duì)甲基橙酶促降解的單因素和正交試驗(yàn)，得出擬康寧木霉胞內(nèi)酶去除甲基橙廢水的最優(yōu)條件：酶液投加量為0.6 mL，反應(yīng)溫度為25℃，pH為 7.0。在最優(yōu)條件下進(jìn)行的最適試驗(yàn)中甲基橙去除率可以達(dá)到85.48%，屬于一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，相對(duì)于目前國(guó)內(nèi)外報(bào)道的各種微生物應(yīng)用于染料降解的脫色效率，本文的脫色效果較明顯，為染料廢水的酶促降解條件提供了參考。國(guó)外已有利用其他木霉降解亞甲基藍(lán)等染料的研究，但利用擬康寧木霉對(duì)偶氮染料脫色方面的研究較少，因此本研究有一定創(chuàng)新性。文中酶促降解的模擬廢水相對(duì)于實(shí)際生活的廢水存在成分簡(jiǎn)單、污染物質(zhì)過(guò)于單一等情況，下一步可通過(guò)改變馴化與培養(yǎng)條件使其擴(kuò)展到吸附或降解其他污染物質(zhì)，并對(duì)該菌的胞內(nèi)酶降解其他偶氮染料的條件和機(jī)理進(jìn)行試驗(yàn)，擴(kuò)大其廣譜性。最終把研究結(jié)果推廣應(yīng)用于實(shí)際，還需利用傅氏轉(zhuǎn)換紅外線(xiàn)光譜分析儀（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)T-IR）、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（liquid chromatography mass spectrometry，LC-MS）等技術(shù)分析該菌株胞內(nèi)酶使甲基橙偶氮鍵斷裂產(chǎn)生的芳香胺類(lèi)降解產(chǎn)物如4-氨基甲基偶氮苯、2，4-二氨基甲苯等［21-23］，進(jìn)一步推測(cè)甲基橙的酶促降解途徑，為從試驗(yàn)研究到工業(yè)化應(yīng)用該菌種提供可靠的試驗(yàn)依據(jù)和相應(yīng)的技術(shù)參考，實(shí)現(xiàn)該菌種處理相關(guān)染料廢水的規(guī)模化應(yīng)用。