貴州傳統(tǒng)香禾糯酒成分分析及其酒體抗氧化活性評(píng)價(jià)

付平，吳天祥,2*，吳力亞，李鳳蘭，李潮云

（1.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州貴陽(yáng) 550025）（2.貴州食品工程職業(yè)學(xué)院食品工程系，貴州清鎮(zhèn) 551400）

香禾糯（Oryza sativa L.），國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)譯名為“Kam Sweet Rice”，是貴州省黔東南州山區(qū)特殊生態(tài)類型珍稀水稻品種，聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織稱其為世界“特產(chǎn)稻”（Specialty Rice）[1]。香禾糯生長(zhǎng)于陰、涼、爛、銹的山地水田中，無(wú)需施加化肥，以傳統(tǒng)生態(tài)農(nóng)業(yè)稻-鴨-魚模式種植，有“一畝稻花十里香，一家烹食十戶香”的稱贊，被譽(yù)為“糯中之王”[2]。2009年香禾糯榮獲國(guó)家地理標(biāo)志保護(hù)產(chǎn)品“黎平香禾糯”的榮譽(yù)稱號(hào)[3]。香禾糯經(jīng)過(guò)“糯禾改秈稻”、大量勞動(dòng)力進(jìn)城務(wù)工、外來(lái)文化沖擊與當(dāng)?shù)啬贻p群體對(duì)于自身民族文化認(rèn)同感下降等原因造成黎平縣、從江縣為主要種植產(chǎn)區(qū)的香禾糯種植面積從新中國(guó)成立占比80%、82%分別下降到2015年的2%、6%，黔東南苗族侗族自治州在2015年的香禾糯品種相比于1981年的香禾糯品種減少了71.9%[4]。

目前，關(guān)于香禾糯研究主要側(cè)重于遺傳學(xué)、民族學(xué)、生態(tài)學(xué)，然而對(duì)于挖掘香禾糯的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、開發(fā)副產(chǎn)品、提升經(jīng)濟(jì)效益的研究較少[2,5-9]。傳統(tǒng)香禾糯酒的釀造特點(diǎn)，結(jié)合了發(fā)酵酒與蒸餾酒的釀造工藝，從而具備了白酒主體風(fēng)格以及發(fā)酵酒對(duì)于營(yíng)養(yǎng)成分保留的特征。香禾糯酒口感綿柔醇厚、甘甜細(xì)膩與傳統(tǒng)白酒入口辛辣形成鮮明對(duì)比，適合初飲者、女性消費(fèi)者和當(dāng)?shù)芈糜尉皡^(qū)游客的飲用，在黎平縣十分暢銷，具有較大的市場(chǎng)潛力。如何實(shí)現(xiàn)拓展香禾糯原料深加工，擺脫香禾糯單一的銷售方式，提高香禾糯種植農(nóng)戶的經(jīng)濟(jì)收益以及緩解香禾糯品種與種植面積遞減趨勢(shì)是迫切解決的問題。

本文通過(guò)探究傳統(tǒng)香禾糯酒的基本理化指標(biāo)、微量元素含量、氨基酸含量、揮發(fā)性風(fēng)味組分以及體外抗氧化能力并與巖洞當(dāng)?shù)匕拙七M(jìn)行對(duì)比。進(jìn)而挖掘香禾糯酒的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值與功能活性，為開發(fā)香禾糯酒提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

香禾糯酒、普通白酒，均購(gòu)自巖洞鎮(zhèn)；苯酚、福林酚、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼DPPH、2,2-連氮基-雙-(3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽ABTS，購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司；其余試劑均為分析純，購(gòu)于國(guó)內(nèi)試劑公司。

1.2 儀器與設(shè)備

752N型紫外可見分光光度計(jì)，上海儀電分析儀器有限公司；PHS-3C型PH計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；X2型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（ICP-MS），賽默飛世爾科技有限公司；S-433D型氨基酸自動(dòng)分析儀，塞卡姆公司；HP6890/5975C型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS），安捷倫公司。

1.3 傳統(tǒng)香禾糯泡酒釀造工藝流程

操作要點(diǎn)，首先將精選大米蒸煮，取出攤涼冷卻至30 ℃左右，加入1%酒曲于28 ℃發(fā)酵14 d，通過(guò)蒸餾得到普通白酒；其次進(jìn)行香禾糯醪液的制作，先將香禾糯用水浸泡12 h，待其瀝干，蒸煮至熟而不爛，內(nèi)無(wú)生心，攤涼至30 ℃左右，加入0.16%甜酒曲于28 ℃發(fā)酵48 h。將得到醪液與白酒按1:1的比例混合陳釀半年，得到成品香禾糯酒。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 酒精度的測(cè)定

參照趙旭[10]的方法進(jìn)行蒸餾測(cè)定。

1.4.2 總糖的測(cè)定

參考郭雷[11]運(yùn)用苯酚-硫酸法測(cè)定總糖，略有改動(dòng)。

1.4.3 總酸、氨基酸態(tài)氮的測(cè)定

參考《黃酒》GB/T 13662-2018法[12]進(jìn)行測(cè)定。

1.4.4 可溶性固形物的測(cè)定

參考趙旭[10]的方法進(jìn)行測(cè)定。

1.4.5 蛋白質(zhì)的測(cè)定

參考李志江[13]和Konstantinos等[14]的考馬斯亮藍(lán)G-250蛋白質(zhì)測(cè)定方法。

1.4.6 總多酚的測(cè)定

參考張強(qiáng)[15]用福林酚比色法測(cè)定總多酚。

1.4.7 總黃酮的測(cè)定

參考王佳麗[16]用硝酸銀顯色法測(cè)定總黃酮。

1.4.8 微量元素含量的測(cè)定

運(yùn)用ICP-MS對(duì)酒樣中的Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Zn、Se、Cd、Pb礦物元素含量進(jìn)行分析檢測(cè)，首先精確稱取15 g酒樣于250 mL的蒸餾燒瓶?jī)?nèi)，使其在250 ℃的加熱套，受熱蒸發(fā)至1～2 mL，待冷卻后向其加入10 mL的硝酸，直至保留少量液體到近干，待冷卻后用純凈水多次沖洗蒸餾燒瓶，于25 mL的棕色容量瓶?jī)?nèi)保存[17]。最后進(jìn)樣檢測(cè)，用ICP-MS Data Cal軟件對(duì)得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

1.4.9 氨基酸含量的測(cè)定

采用氨基酸自動(dòng)分析儀對(duì)酒樣中的天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、賴氨酸、精氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸等氨基酸及其衍生氨基酸的測(cè)定。儀器的保留時(shí)間重現(xiàn)性CV0.3%（精氨酸），峰面積重現(xiàn)性CV1.0%（甘氨酸，組氨酸），檢出限3 pmol（信噪比為2，天冬氨酸）。

1.4.10 揮發(fā)性風(fēng)味組分的測(cè)定

采用GC-MS聯(lián)用儀對(duì)酒樣中的各揮發(fā)性風(fēng)味組分的含量進(jìn)行測(cè)定。取混勻樣品2 mL，置于固相微萃取儀采樣瓶中，插入裝有2 cm～50/30 μm DVB/CAR/PDMS StableFlex纖維頭的手動(dòng)進(jìn)樣器，在60 ℃的平板加熱條件下頂空萃取60 min時(shí)間后，移出萃取頭并立即插入氣相色譜儀進(jìn)樣口（溫度250 ℃）中，熱解析1 min進(jìn)樣。爾后，對(duì)總離子流圖中的各峰經(jīng)質(zhì)譜計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索及核對(duì)Nist17和Wiley275標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖，確定了檢測(cè)到揮發(fā)性化學(xué)成分，用峰面積歸一化法測(cè)定了各化學(xué)成分的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.4.11 DPPH自由基清除能力的測(cè)定

參考JIANG等[18]、楊祖滔等[19]的方法略有改動(dòng)，以0.1 mg/mL的Vc溶液作為陽(yáng)性對(duì)照，上述實(shí)驗(yàn)均設(shè)3組水平。

式中：

A1——樣品測(cè)定管吸光度；

A2——樣品本底管吸光度；

加快推進(jìn)全市基礎(chǔ)行業(yè)和優(yōu)勢(shì)行業(yè)的轉(zhuǎn)型升級(jí)和提質(zhì)增效。發(fā)揮百色鋁產(chǎn)業(yè)優(yōu)勢(shì)，合理開發(fā)利用鋁土礦資源，著力構(gòu)建鋁產(chǎn)業(yè)鏈和配套產(chǎn)業(yè)鏈。加快淘汰冶煉行業(yè)落后產(chǎn)能、改造提升技術(shù)裝備水平；整合全市礦產(chǎn)資源，發(fā)展鋁銅深加工行業(yè)。全面提升鋁加工行業(yè)的整體競(jìng)爭(zhēng)力，加快發(fā)展高性能、綠色環(huán)保的精細(xì)化工產(chǎn)品和高端化工新材料產(chǎn)品。加強(qiáng)與貴州、云南區(qū)域間的電力合作，實(shí)現(xiàn)優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，降低工業(yè)用電成本。提升改造傳統(tǒng)建材行業(yè)，突破發(fā)展新興建材行業(yè)。

A0——空白對(duì)照液吸光度。

1.4.12 ABTS自由基清除能力的測(cè)定

參考方晟等[20,21]方法略有改動(dòng)，以1 mg/mL的Vc溶液稀釋100倍作為陽(yáng)性對(duì)照，上述實(shí)驗(yàn)均設(shè)3組水平。

式中：

A1——樣品測(cè)定管吸光度；

A2——樣品本底管吸光度；

A0——空白對(duì)照液吸光度。

參考李清清等[22]的方法，以1 mg/mL的Vc溶液作為陽(yáng)性對(duì)照，上述實(shí)驗(yàn)均設(shè)3組水平。

式中：

A1——樣品測(cè)定管吸光度；

A2——樣品本底管吸光度；

A0——空白對(duì)照液吸光度。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

2 結(jié)果與討論

2.1 香禾糯酒基本理化指標(biāo)

通過(guò)測(cè)定香禾糯酒基本理化指標(biāo)可知，香禾糯酒酒度為29.00% vol，酒度適宜稍偏低，適飲消費(fèi)者群體相比普通白酒更廣；香禾糯酒總酸含量適當(dāng)，酸味能賦予酒體層次感，使酒體口感更加豐富；香禾糯酒含有0.20 g/L的氨基酸態(tài)氮、13.70 g/L的非糖可溶性固形物、46.30 g/L的總糖、0.35 g/L的蛋白質(zhì)，以及含有0.27 g/L的多酚和0.0026 g/L黃酮，表明香禾糯酒營(yíng)養(yǎng)較為豐富，且含有一定黃酮、多酚等抗氧化功能活性成分，基本理化指標(biāo)與黃酒相似[23]。其原因可能是，香禾糯酒將發(fā)酵的香禾糯醪液轉(zhuǎn)移到普通白酒，從而使普通白酒度被稀釋，達(dá)到降度的作用。同時(shí)，加入的香禾糯醪液，能賦予普通白酒更加豐富的口感、風(fēng)味，以及多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)與抗氧化功能活成分。

表1 香禾糯酒的基本理化指標(biāo)Table 1 Physico chemical indexes of Kam sweet rice wine

2.2 香禾糯酒與普通白酒微量元素含量的對(duì)比

從圖1結(jié)果可以看出，香禾糯酒中錳、鐵、鎳、鋅等人體必需的微量元素以及硒3.15 μg/L含量要明顯高于普通白酒[24]。對(duì)于鉛、鎘等對(duì)人體有害的重金屬元素，兩種酒樣中鉛、鎘含量，均符合且遠(yuǎn)低于國(guó)家要求標(biāo)準(zhǔn)鉛含量（以Pb計(jì)，<0.50 mg/L）和鎘含量（以Cd計(jì)，<0.05 mg/L）。其原因是，香禾糯酒以普通白酒為基酒，將香禾糯米發(fā)酵形成的醪液中的錳、鐵、鎳、鋅等人體必需微量元素，轉(zhuǎn)移到香禾糯酒中，從而使香禾糯酒中必需微量元素多于普通白酒。這與柴東方等[25]在測(cè)得香禾糯中富含多種必需微量元素相符。香禾糯生長(zhǎng)于山區(qū)水田，生態(tài)環(huán)境優(yōu)良，不施加化肥，環(huán)境中所含的有害重金屬低，從而鉛、鎘等有害重金屬元素含量極低。

圖1 兩種不同酒中各元素的含量Fig.1 The content of each element in two different wines

2.3 香禾糯酒與普通白酒的氨基酸種類及含量測(cè)定結(jié)果

圖2 氨基酸離子圖譜Fig.2 Amino acid ion profile

由上表的結(jié)果可知，香禾糯酒中檢測(cè)到14種氨基酸，其中必需氨基酸有蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸等6種必需氨基酸，必需氨基酸總含量為24.64 mg/100 g，總氨基酸含量為139.24 mg/100 g；普通白酒中共測(cè)出2種氨基酸含量為6.24 mg/100 g，1種必需氨基酸甲硫氨酸含量為0.39 mg/100 g[26]，表明香禾糯酒中氨基酸的種類與含量均高于普通白酒。原因是香禾糯在發(fā)酵過(guò)程中，由于細(xì)菌、霉菌和酵母菌等微生物分泌的蛋白酶，將香禾糯中大分子蛋白質(zhì)分解為小分子的肽鏈與氨基酸，以及微生物在生長(zhǎng)代謝與自溶產(chǎn)生氨基酸，通過(guò)香禾糯醪液轉(zhuǎn)移到香禾糯酒中。相比之下普通白酒經(jīng)過(guò)蒸餾，造成大量的氨基酸減損[27]。普通白酒經(jīng)過(guò)蒸餾，大量營(yíng)養(yǎng)成分未能得到保留，只有較少部分營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在蒸餾時(shí)同乙醇或水汽化到酒里，解釋了普通白酒含有少量氨基酸的原因，與張莊英等[28]研究不同香型白酒中游離氨基酸含量較少的結(jié)果相符。普通白酒僅含有較少氨基酸，根據(jù)釀造工藝在向其加入1:1比例的香禾糯醪液后，普通白酒中氨基酸被稀釋變得更少，氨基酸含量不能達(dá)到儀器檢測(cè)限。從而解釋普通白酒中檢測(cè)到少量的脯氨酸和甲硫氨酸而香禾糯酒中未檢測(cè)到這兩種氨基酸。

表2 香禾糯酒與普通白酒中所含的氨基酸（mg/100 g）Table 2 Amino acids contained in Kam sweet rice wine and Baijiu

2.4 揮發(fā)性風(fēng)味組分的測(cè)定結(jié)果

通過(guò)GC-MS檢測(cè)分析得到香禾糯酒與普通白酒中各檢測(cè)到45與48種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，普通白酒比香禾糯酒多檢測(cè)出4種揮發(fā)性風(fēng)味成分，分別為戊酸乙酯、乙酸己酯、(Z)-2-庚醛、反-2-壬烯醛，香禾糯酒比普通白酒多檢測(cè)到1種糠醛。其原因可能是，雖然普通白酒中檢測(cè)到的揮發(fā)性風(fēng)味成分比香禾糯酒多，但其所占的百分含量都較低，最高百分含量0.031%，最低百分含量?jī)H有0.004%。根據(jù)釀造工藝將香禾糯發(fā)酵醪液與普通白酒按1:1的比例勾調(diào)陳釀，使普通白酒中微量的揮發(fā)性成分被稀釋，其含量占比更低，故達(dá)不到儀器的最低檢測(cè)限。香禾糯酒中檢出的糠醛可能來(lái)自于香禾糯發(fā)酵過(guò)程中氨基酸和脂質(zhì)降解形成[29]，跟隨香禾糯醪液轉(zhuǎn)移到香禾糯酒中，適當(dāng)?shù)目啡┖磕苜x予酒杏仁香[30]。

圖3 香禾糯酒總離子流圖Fig.3 Total ion current diagram of Kam sweet rice wine

圖4 普通白酒總離子流圖Fig.4 Total ion current diagram of Baijiu

醇類作為香禾糯酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的主體成分，香禾糯酒中有14種醇總百分含量為92.84%，普通白酒中有13種醇總百分含量為92.97%，醇類化合物能使酒體豐滿，有些醇類能予以酒甘甜的口感，同時(shí)也是酯類化合物的前驅(qū)物質(zhì)[31]；酯類作為主要呈香呈味組分香禾糯酒中有16種總百分含量為3.88%，普通白酒中有18種總百分含量為4.02%，雖然占比不高但卻尤為關(guān)鍵，是區(qū)分各種香型酒的特征成分。如濃香型白酒的主體香是己酸乙酯，清香型白酒特有的重要香氣成分辛酸乙酯[32]；醛類香禾糯酒中有6種總百分含量為0.50%，普通白酒中有8種總百分含量為0.26%，其來(lái)源可能來(lái)自香禾糯原料及酒曲或醇類氧化、氨基酸與還原糖的美拉德反應(yīng)[33]；酸類可以賦予酒體更加厚重、豐富、協(xié)調(diào)和調(diào)節(jié)香氣，同時(shí)也是脂類的前驅(qū)物質(zhì)，在香禾糯酒中有5種總百分含量為0.23%，普通白酒中有5種總百分含量為0.22%；香禾糯酒和普通白酒中烷烴類與酮類種類及含量都較少對(duì)酒體風(fēng)味貢獻(xiàn)也少，各都有2種總百分含量為0.04%、0.02%和0.03%、0.03%。

圖5 兩種酒中揮發(fā)性組分對(duì)比Fig.5 Comparison of volatile components in two wines

表3 揮發(fā)性風(fēng)味成分Table 3 Volatile flavor components

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2.5 DPPH自由基清除能力的測(cè)定結(jié)果

由圖6的DPPH自由的清除能力的測(cè)定結(jié)果表明，香禾糯酒的DPPH自由基清除率與0.1 mg/mL Vc的清除能力相接近，在添加到1.8 mL時(shí)清除率達(dá)95.68%，且兩者的清除率顯著高于普通白酒的清除率，說(shuō)明普通白酒DPPH自由基清除率較弱。其原因可能是白酒經(jīng)過(guò)高溫蒸餾，在蒸餾前積累的功能活性成分損耗。而香禾糯酒中包含未經(jīng)蒸餾的香禾糯發(fā)酵醪液，醪液中富含黃酮、多酚等功能活性成分，因而在DPPH自由基清除能力試驗(yàn)中表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化能力。

圖6 香禾糯酒、普通白酒、Vc清除DPPH自由基的能力Fig.6 The ability of Kam sweet rice wine, Baijiu, and Vc to scavenge DPPH free radicals

2.6 ABTS自由基清除能力的測(cè)定結(jié)果

由圖7的ABTS自由基清除能力的測(cè)定結(jié)果，香禾糯酒在稀釋10倍后與稀釋100倍Vc 1 mg/mL以及普通白酒，在添加相同體積下的ABTS自由基清除率表明，在添加0.1 mL到0.9 mL階段香禾糯酒的ABTS自由基清除率要高于Vc和普通白酒，后趨于穩(wěn)定，最大清除率達(dá)到83.20%且在稀釋10倍后，高于普通白酒49.27%的最大清除率。香禾糯酒在稀釋10倍后與普通白酒相比，仍然表現(xiàn)出較強(qiáng)ABTS自由基清除能力的原因，極有可能是因?yàn)橄愫膛歹惨汉械目寡醭煞?，遷移到香禾糯酒中而表現(xiàn)出相比于普通白酒較強(qiáng)ABTS自由基清除能力。

圖7 香禾糯酒、普通白酒、Vc清除ABTS自由基的能力Fig.7 The ability of Kam sweet rice wine, Baijiu and Vc to scavenge ABTS free radicals

2.7 OH自由基清除能力的測(cè)定結(jié)果

由圖8結(jié)果顯示，在OH自由基清除能力對(duì)比上，香禾糯酒、Vc 1 mg/mL和普通白酒在相同添加的體積下，Vc清除OH自由基清除率最高，在添加到0.6 mL時(shí)清除率趨于平穩(wěn)，最大清除率為99.44%；香禾糯酒的由基清除率在添加體積0.9 mL后清除率顯現(xiàn)出較為平緩的趨勢(shì)，最大清除率達(dá)到97.17%，且顯著高于普通白酒。通過(guò)OH自由基清除能力試驗(yàn)，進(jìn)一步驗(yàn)證了香禾糯醪液中的抗氧化組分，在轉(zhuǎn)移到普通白酒后，兩者通過(guò)陳釀半年得到香禾糯酒，而表現(xiàn)出較強(qiáng)抗氧化能力。

圖8 香禾糯酒、普通白酒、Vc清除OH自由基的能力Fig.8 The ability of Kam sweet rice wine, Baijiu, and Vc to scavenge ·OH radicals

通過(guò)對(duì)3種自由基的清除能力的測(cè)定，表明香禾糯酒有一定的自由基清除能力，這可能與酒中測(cè)出的黃酮[34]、多酚[35]等功能活性成分有關(guān)，與郭睿等[36]研究黃酒具有較強(qiáng)的抗氧化能力的結(jié)論基本相符。其原因可能是普通白酒經(jīng)過(guò)高溫蒸餾，造成其營(yíng)養(yǎng)成分與功能活性物質(zhì)例如酚類、黃酮類損耗。相比之下香禾糯酒中含有香禾糯醪液，香禾糯醪液將本身具有較強(qiáng)抗氧化能力的酚類與黃酮類帶到酒中，使香禾糯酒表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化能力，從而解釋了香禾糯酒對(duì)3種自由基的清除能力強(qiáng)于普通白酒。

3 結(jié)論

針對(duì)當(dāng)下人們對(duì)酒的需求是降度、健康、營(yíng)養(yǎng)、低耗糧、低耗能的的背景下，香禾糯酒正好吻合形勢(shì)需求。香禾糯酒不僅保留了蒸餾酒的主體風(fēng)味特征，而且兼有發(fā)酵酒對(duì)于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及功能活性成分的保留優(yōu)勢(shì)。試驗(yàn)結(jié)果表明，香禾糯酒在揮發(fā)性風(fēng)味成分上與普通白酒相似，兩者各檢測(cè)到45與48種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。其酒體基本理化指標(biāo)、營(yíng)養(yǎng)成分都與發(fā)酵型黃酒十分接近。香禾糯酒中氨基酸種類與含量、必需微量元素含量均高于普通白酒。在香禾糯酒中檢測(cè)到黃酮、多酚等抗氧化功能活性物質(zhì)，通過(guò)測(cè)定DPPH自由基、ABTS自由基和OH自由基3種自由基清除能力試驗(yàn)，驗(yàn)證了香禾糯酒的抗氧化能力顯著高于普通白酒。后期研究將對(duì)香禾糯酒揮發(fā)性風(fēng)味的主成分進(jìn)行分析，以及體內(nèi)抗氧化活性試驗(yàn)，進(jìn)一步檢驗(yàn)其抗氧化能力。為挖掘香禾糯酒營(yíng)養(yǎng)價(jià)值與功能活性價(jià)值，開發(fā)香禾糯原料深加工提供數(shù)據(jù)支撐。