丁香精油與茶多酚復(fù)合抗菌液的抑菌活性協(xié)同作用及抗氧化活性

都津銘，張萍，高德*

（1.浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江杭州 310058）（2.浙大寧波理工學(xué)院機(jī)電與能源工程學(xué)院，浙江寧波 315100）

魚產(chǎn)品是人類飲食中重要的蛋白質(zhì)來源，隨著人們對食品品質(zhì)和安全要求的提高，保持其新鮮度和貨架期已成為當(dāng)前亟待解決的問題。微生物腐敗[1]和脂質(zhì)的氧化變化[2]是魚產(chǎn)品腐敗的最主要兩種機(jī)制，因此開發(fā)具有高效抑菌能力和抗氧化性的抗菌劑是魚類保鮮的主要研究方向。丁香精油（Essential Oils，EO）是植物次生代謝產(chǎn)物中對魚類腐敗菌的抑制效果最佳的一種精油[3]，具有高效的抑菌活性[4]。趙冉冉等[5]研究發(fā)現(xiàn)丁香精油對青霉和灰霉的生長抑制時間可達(dá)9 d和8 d。但單一的精油種類在魚產(chǎn)品的實(shí)際應(yīng)用中很少能起到理想的保鮮效果[6]，而且對于不同的革蘭氏陰性菌（大腸桿菌、沙門氏菌和銅綠假單胞菌）和革蘭氏陽性菌（金黃色葡萄球菌、蠟樣芽胞桿菌、糞腸球菌和單增李斯特氏菌），精油對銅綠假單胞菌的抑制作用相對最低[7]。因此將EO與其他天然抗菌劑進(jìn)行復(fù)合，制備高效、廣譜的天然復(fù)合抗菌劑具有更大的研究價值。如Hafsa等[8]研究發(fā)現(xiàn)桉樹精油與殼聚糖的復(fù)合涂層對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌有更好的抗菌活性，而且可以顯著提高純殼聚糖涂層的抗氧化性。黃灑等[9]研究發(fā)現(xiàn)不同的精油之間對金黃色葡萄球菌均有協(xié)同作用。

茶多酚（Tea polyphenols，TP）是茶葉中多羥基酚類化合物的復(fù)合物，具有顯著的抗氧化活性[10]，是一種天然酚類抗氧化劑，且對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均有顯著的抑菌效果[11]，因此是魚類抗菌保鮮領(lǐng)域的良好抗菌劑。藍(lán)蔚青等[12]研究發(fā)現(xiàn)茶多酚具有較強(qiáng)的抗氧化作用。而且茶多酚的抗氧化性高于維生素C[13]。已有研究表明茶多酚與其他天然抗菌劑進(jìn)行復(fù)合，可以起到協(xié)同抑菌、抗氧化作用。如Li等[14]研究的天然防腐劑茶多酚（TP）與殼聚糖復(fù)合使用可以發(fā)揮出協(xié)同作用，比對照組延長紅姑魚片6～8 d的貨架期。唐煜括等[15]從茶多酚與維生素C的混合物中得出2:1的時候?qū)Υ竽c桿菌的協(xié)同作用最強(qiáng)。這些研究為TP與其他天然抗菌劑的復(fù)配提供了良好的參考。

目前國內(nèi)外許多研究主要集中在不同精油之間[16]、精油與其他抗菌劑[17,18]、茶多酚與其他抗菌劑[19]的組合的抑菌協(xié)同作用，而對EO和TP這兩者兼具抗菌性和抗氧化性的天然抗菌劑之間的復(fù)合液對魚類特征腐敗菌[20]的抑制效果研究還鮮有報(bào)道。本文通過制備一系列丁香精油和茶多酚的復(fù)合抗菌劑，考察了丁香精油與茶多酚兩者質(zhì)量比對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的協(xié)同抑菌作用及最佳抑菌濃度的復(fù)合抗菌液對魚類特征腐敗菌的抑菌效果，并對其抗氧化性進(jìn)行了研究，為開發(fā)對抑制魚類特征腐敗菌效果良好的復(fù)合天然抗菌液和魚產(chǎn)品保鮮應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

丁香精油（分析純，≥80%）購自上海麥克林生化科技有限公司；茶多酚（97%）購自上海麥克林生化科技有限公司；氯化鈉（分析純）購自上海麥克林生化科技有限公司；大腸桿菌ATCC25922、金黃色葡萄球菌ATCC25923、銅綠假單胞菌ATCC9027、副溶血性弧菌ATCC17802均購自上海魯微科技有限公司；肉湯瓊脂培養(yǎng)基（分析純）購自杭州微生物試劑有限公司；2,2-聯(lián)苯基-1-苦肼基（分析純）購自上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司；無水乙醇（分析純）購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 主要儀器設(shè)備

AL104型電子分析天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；US-300T型超聲波均化器，上海生析超聲儀器有限公司；LRH-250F型生化培養(yǎng)箱，上海慧泰儀器制造有限公司；BGLL-230BE型電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海本亭儀器有限公司；SPH-211B型標(biāo)準(zhǔn)型大容量恒溫培養(yǎng)搖床，上海世平實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；LDZX-50L型立式高壓蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 復(fù)合抗菌液的制備

茶多酚溶液濃度的配制：將1.5 g茶多酚溶于水中定容至50 g，密封磁力攪拌30 min，制成3%的茶多酚溶液，再用無菌蒸餾水稀釋成質(zhì)量濃度為0.1%、0.2%、0.4%、0.8%、1.6%的溶液。

丁香精油濃度的配制：先將丁香精油用無水乙醇按質(zhì)量比1:2溶解，再按所需的濃度用水具體稀釋成質(zhì)量濃度為0.1%、0.2%、0.4%、0.8%、1.6%的溶液。

復(fù)合抗菌液濃度的配制：按m(EO)：m(TP)=1：1、1：2、2：1配制總質(zhì)量濃度為0.1%、0.2%、0.4%、0.8%、1.6%的復(fù)合抗菌液。

1.3.2 菌懸液的配制

采用麥?zhǔn)媳葷岱╗21]，將斜面菌種接種于LB培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中活化24 h，接種在LB瓊脂平板上，平板劃線后倒置與37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，挑取典型菌落加入培養(yǎng)基中，并依次做10倍遞增稀釋，將菌懸液稀釋至比色濁度，配制成菌液濃度為100～300 cfu/mL左右的稀釋液作為試驗(yàn)用菌液。

1.3.3 最小抑菌濃度的測定

采用二倍稀釋法[22]測定茶多酚、精油及其混合物[m(EO)：m(TP)=1：1、1：2、2：1]的 最 小 抑 菌 濃 度（minimum inhibitory concentration，MIC）。取26支滅菌試管并編號，純精油抗菌液記為E，純茶多酚抗菌液記為T，不同質(zhì)量百分比的丁香精油/茶多酚復(fù)合抗菌液分別記為E/T（1：1）、2E/T（1：2）、E/2T（2：1）。將1.6%的E、T、E/T、E/2T、2E/T各1 mL加入試管中，然后分別加入1 mL液體培養(yǎng)基中，順序?qū)?yīng)分別記為E-1.6、T-1.6、E/T-1.6、E/2T-1.6、2E/T-1.6，混合均勻；從E-1.6號試管中吸取1 mL混合溶液加入E-0.8號試管，再加入等體積的液體培養(yǎng)基，混合均勻，以此類推二倍梯度稀釋四次，在最后編號的試管中加入1 mL滅菌生理鹽水和等體積的液體培養(yǎng)基，作為空白對照。其它抗菌液組重復(fù)上述操作。在所有試管中分別加入200 μL活化菌懸液，塞上棉塞，在37 ℃培養(yǎng)16 h，觀察試管中是否變渾濁，若變渾濁則表明有菌落形成，從沒有明顯菌落生長的試管中吸取200 μL液體，涂布在平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h，觀察是否有菌落長出，確定樣品溶液MIC。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)2個重復(fù)，取平均值。

1.3.4 協(xié)同效應(yīng)試驗(yàn)

根據(jù)MIC實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定的最小抑菌濃度，以純精油和茶多酚抗菌液為對照組，將復(fù)合抗菌液（E/T、E/2T、2E/T）作為實(shí)驗(yàn)組。分別向4.5 mL的不同抗菌液中加入0.5 mL菌懸液，攪拌2 min，混合均勻，然后每組吸取0.5 mL注入到瓊脂LB培養(yǎng)基中，于37 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 h，計(jì)算活菌落數(shù)，每種抗菌液平行做三組求平均。各抗菌液成分配比表如表1。

表1 抗菌液成分配比表Table 1 Composition ratio table of antimicrobial solution

1.3.5 抑菌圈試驗(yàn)

按m(EO):m(TP)=2:1配制總質(zhì)量濃度分別為0.4%、0.6%、0.8%和1.0%的的復(fù)合抗菌液，分別記為2E/T-0.4、2E/T-0.6、2E/T-0.8、2E/T-1.0。

改進(jìn)了Kalemba[24]的抑菌圈法，將25 g LB液體培養(yǎng)基粉末和15 g瓊脂LB固體培養(yǎng)基粉末分別加到蒸餾水中定容至1 L，然后分裝于錐形瓶中，置于高溫滅菌鍋中，高溫滅菌30 min，冷卻到45 ℃后將大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和副溶血性弧菌放入LB液體培養(yǎng)液中進(jìn)行活化培養(yǎng)，于37 ℃搖床中培養(yǎng)24 h，另外將固體培養(yǎng)基置于45 ℃恒溫箱內(nèi)備用。

向各培養(yǎng)皿內(nèi)注入15 mL～20 mL的固體培養(yǎng)基（約45 ℃），然后取活化好的菌懸液等量加入培養(yǎng)皿中，待其冷卻凝固。

用濾紙（直徑15 mm）浸泡不同濃度的復(fù)合抗菌液，濾掉多余的液體，然后放在培養(yǎng)基表面，然后放置在恒溫（37 ℃）搖床中培養(yǎng)12 h。最后用十字交叉法觀察透明抑菌圈直徑，并用游標(biāo)卡尺記錄，每組各做3個平行樣最后取平均。

判定標(biāo)準(zhǔn)：抑菌圈大小與濾紙直徑的差>9 mm（極度敏感）；7～9 mm（高度敏感）；4～6 mm（中度敏感）；1～3 mm（低度敏感）；<1 mm（不敏感），抑菌圈直徑與抑菌活性成正比。

1.3.6 抑菌持久性試驗(yàn)

選用最小抑制濃度的復(fù)合抗菌液探究其抑菌持久性，用抑菌圈法將該復(fù)合抗菌液分別用濾紙片法貼于培養(yǎng)基表面，觀察每天不同特征菌的抑菌圈大小變化。

1.3.7 抗氧化性試驗(yàn)

老福沒把這個消息告訴母親，怕她受刺激血壓升高影響健康，母親問他找到小宋沒有，他含糊地回答說還沒有，會找到的，讓母親放心。晚上他睡不著，煙缸里堆滿了煙頭，屋里的煙味嗆得他自己都睜不開眼睛。

1.3.7.1 DPPH自由基清除率的測定

參考符群等[25]的方法，略有改動。配制質(zhì)量濃度為0.2%、0.4%、0.6%、0.8%及1%的2E/T復(fù)合抗菌液。配制0.1 mmol/L的DPPH無水乙醇溶液，量取3 mL于試管中，加入1 mL不同配比的復(fù)合抗菌液，立即混勻，于室溫條件下避光放置30 min，在517 nm波長下測定吸光值A(chǔ)i；取3 mL無水乙醇和1 mL不同配比的復(fù)合抗菌液混合于室溫條件下避光放置30 min，于517 nm波長下測定吸光值A(chǔ)j；以無水乙醇代替復(fù)合抗菌液，加入3 mL DPPH無水乙醇測定吸光值A(chǔ)0，每組平行3次。DPPH自由基清除率（K）的計(jì)算公式如下：

1.3.7.2 ABTS自由基清除率的測定

參考孫世利等[26]的方法略有改動，配制終濃度為7.4 mmol/L ABTS和2.6 mmol/L過硫酸鉀的混合液，室溫避光條件下靜置過夜（12 h），制得ABTS自由基儲存液，使用時用75%乙醇稀釋至734 nm處吸光度為0.70（±0.05）的應(yīng)用液。0.1 mL樣品待測液加入3.9 mL ABTS應(yīng)用液，充分混合后置于室溫下避光反應(yīng)6 min后測定其在734 nm處的吸光度（10 min內(nèi)吸光度穩(wěn)定），以蒸餾水代替樣品液作為空白對照。每組平行3次。

ABTS自由基清除率/%=[(A對照-A樣品)/A對照]×100%

1.3.8 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)結(jié)果采用SPSS 26進(jìn)行方差分析，顯著性取p<0.05。采用Microsoft Excel 2016作圖，所有的數(shù)據(jù)均至少重復(fù)3次進(jìn)行，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同抗菌液對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度

不同抗菌液對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2和3所示。由表2可知，純精油組對大腸桿菌的最小抑菌濃度大于0.8%，T、E/T和E/2T抗菌液對大腸桿菌的最小抑菌濃度均為0.4%，2E/T抗菌液對大腸桿菌的最小抑菌濃度為0.2%。顯然2E/T組對大腸桿菌的抑制作用最強(qiáng)。

表2 不同抗菌液對大腸桿菌的最小抑菌濃度結(jié)果Table 2 Results of the minimum inhibitory concentration of different antibacterial solutions to E. coli

由表3可知，E、T、E/T、E/2T抗菌液對對金黃色葡萄球菌的最小抑制濃度均為0.4%，而2E/T抗菌液對金黃色葡萄球菌的最小抑制濃度為0.2%。由表2和表3可知，丁香精油抗菌液對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌效果最差，T、E/T和E/2T抗菌液的抑菌效果相似，2E/T抗菌液的抑菌效果最好；并且抗菌液對金黃色葡萄球菌的抑制效果要好于對大腸桿菌的抑制效果，這與劉倩等[6]的研究結(jié)果一致。劉倩等得出精油對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的MIC分別為0.5%和0.3%，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果接近。綜合考慮，確定丁香精油/茶多酚復(fù)合抗菌液的最小抑菌濃度為0.4%，而且當(dāng)E:T=2:1時，復(fù)合抗菌液的最小抑菌濃度為0.2%。

表3 不同抗菌液對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度結(jié)果Table 3 Results of the minimum inhibitory concentration of different antibacterial solutions to S. aureus

2.2 精油與茶多酚對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的協(xié)同抑菌作用

選擇濃度為0.4%的抗菌液，考察丁香精油和茶多酚的協(xié)同抑菌效果，不同抗菌液的抑菌率及其協(xié)同系數(shù)結(jié)果列入表4和圖1。由表4可知，復(fù)合抗菌液對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制作用明顯好于單一抗菌液，其中抑菌率最高的2E/T抗菌液對兩種菌株的抑菌率分別為98.74%和74.81%。由抑菌率的結(jié)果可知，抗菌液對大腸桿菌的抑菌率明顯高于對金黃色葡萄球菌的抑菌率，即對大腸桿菌的殺菌效果要優(yōu)于對金黃色葡萄球菌的殺菌效果，這與上述最小抑菌濃度的實(shí)驗(yàn)結(jié)果不一致。這可能是因?yàn)榇竽c桿菌的對數(shù)生長期比金黃色葡萄球菌的短[27]，由于最小抑菌濃度實(shí)驗(yàn)的抑菌處理時間（24 h）大于協(xié)同效應(yīng)實(shí)驗(yàn)的時間（14 h），早期被殺死的大腸桿菌在抗菌液的抑菌性減弱后（抗菌液的抑菌性隨時間而變化）再次繁殖，從而導(dǎo)致最小抑菌濃度的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與抑菌率實(shí)驗(yàn)結(jié)果相悖。

表4 不同抗菌液對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的協(xié)同效果和抑菌率大小Table 4 Synergistic effects and bacteriostatic rate of different antibacterial solutions against E. coli and S. aureus

圖1 不同抗菌液對大腸桿菌（a）和金黃色葡萄球菌（b）的殺菌效果Fig.1 The bactericidal effect of different antibacterial solutions on E. coli (a) and S. aureus (b)

由表4可知，EO與TP復(fù)合對大腸桿菌具有較強(qiáng)的協(xié)同作用，而對金黃色葡萄球菌僅在2E/T時具有協(xié)同效應(yīng)，推測其協(xié)同抗菌的原因可能是丁香精油與茶多酚均能通過破壞細(xì)胞壁而影響細(xì)胞膜的通透性達(dá)到共同抑菌的作用[28]。與E/T、E/2T抗菌液相比，相同總濃度下，丁香精油含量更高的2E/T復(fù)合抗菌液對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的協(xié)同系數(shù)和抑菌率更高。因此，本實(shí)驗(yàn)將2E/T作為抑制腐敗菌種的最佳復(fù)合抗菌液。任艷麗等[29]通過三因素二次通用旋轉(zhuǎn)設(shè)計(jì)計(jì)算出茶多酚（2.78%）、丁香精油（0.66%）和乳酸鏈球菌素（0.033%）進(jìn)行復(fù)合得到的防腐液抑菌效果最佳，與本文協(xié)同抗菌結(jié)果不同的是，當(dāng)乳酸鏈球菌素存在時，其復(fù)合抗菌液中茶多酚的含量最高，這可能是因?yàn)槿樗徭溓蚓靥峁┝溯^高的抑菌作用而導(dǎo)致對丁香精油的含量降低。Wang等[30]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)茶多酚和曲酸按1:1復(fù)合時，兩者對魚類腐敗菌種具有較強(qiáng)的協(xié)同抑菌作用。Sharma等[31]研究發(fā)現(xiàn)香茅精油、曲松精油、長葉精油和黃花精油之間對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌均具有協(xié)同抑制作用，且可以顯著降低它們的活性劑量，但未對精油與茶多酚的協(xié)同作用進(jìn)行研究。

2.3 不同濃度的復(fù)合抗菌液對魚類特征腐敗菌的抑菌效果

不同濃度的復(fù)合抗菌液對副溶血性弧菌（V.Parahemolyticus）、銅綠假單胞菌（P. aeruginosa）、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈大小如表5和圖2所示。

圖2 不同濃度復(fù)合抗菌液對副溶血性弧菌（a）、銅綠假單胞菌（b）、大腸桿菌（c）和金黃色葡萄球菌（d）的抑菌圈大小Fig.2 The zone of bacteriostatic circle of V. Parahemolyticus (a),P. aeruginosa (b), E. coli (c) and S. aureus (d) under different concentrations of compound antibacterial solutions

由表5和圖2可知，隨著復(fù)合抗菌液總濃度的提高，對所有菌種的抑制能力均逐漸增大。復(fù)合抗菌液總質(zhì)量濃度在0.4%時對四種菌種的抑制效果均為低度敏感，而在0.6%甚至更高濃度的情況下，對魚產(chǎn)品特征腐敗菌（銅綠假單胞菌和副溶血性弧菌）的抑菌效果都已經(jīng)達(dá)到了極度敏感，推測其原因可能是因?yàn)椴瓒喾涌梢砸种沏~綠假單胞菌中蛋白質(zhì)的合成與表達(dá)，影響了酶的催化活性及其細(xì)胞結(jié)構(gòu)的組成，導(dǎo)致細(xì)菌喪失正常的生理活性[32]，而且EO和TP均可以破壞副溶血性弧菌細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，使其細(xì)胞的通透性增加，從而影響細(xì)胞結(jié)構(gòu)的新陳代謝活動導(dǎo)致其死亡[33]。復(fù)合抗菌液對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果均處于中等敏感級別，且對大腸桿菌的抑菌效果好于對金黃色葡萄球菌的抑菌效果，與抑菌率實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，兩者抑菌觀察時間接近。余小亮等[19]研究發(fā)現(xiàn)茶多酚與肉桂精油按1:1復(fù)合時獲得的復(fù)合抗菌液濃度在0.4%～1.0%時，對金黃色葡萄球菌的抑制能力也處于中度敏感級別，與本實(shí)驗(yàn)中丁香精油/茶多酚復(fù)合抗菌液對金黃色葡萄球菌的抑菌效果相似。綜合考慮，2E/T抗菌液的質(zhì)量濃度為0.6%時，抑菌效果最佳。

表5 復(fù)合抗菌液的濃度對不同菌種抑菌圈大小的影響Table 5 Effect of concentration of compound antimicrobial solution on the size of inhibition zone of different bacterial species

2.4 復(fù)合抗菌液對不同菌種的抑菌持久性結(jié)果

最佳協(xié)同比下，質(zhì)量濃度為0.6%的復(fù)合抗菌液對不同菌種的生長抑制曲線如圖3所示。由圖3可知，隨著培養(yǎng)時間的延長，2E/T-0.6對所有菌種的抑制曲線均是先增后減。復(fù)合抗菌液對銅綠假單胞菌的抑制性最強(qiáng)，在36 h達(dá)到最大值30 mm，至72 h才對其失去效力。其次是副溶血性弧菌，在24 h達(dá)到抑菌圈最大值，然后抑菌能力開始逐漸下降，直至60 h時對副溶血性弧菌失去效力。復(fù)合抗菌液對金黃色葡萄球菌抑制效果最大的時候也是在第24 h，然后逐漸下降至60 h時失去效力。復(fù)合抗菌液對大腸桿菌的抑制能力在12 h達(dá)到最高，且僅在前16 h左右的時間段時，大腸桿菌的抑菌圈略大于金黃色葡萄球菌，這與協(xié)同效應(yīng)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相符。因此2EO/T-0.6對銅綠假單胞菌具有最高的抑菌效力，對副溶血性弧菌的抑制效果次之，對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制效果相對較弱；對銅綠假單胞菌、副溶血性弧菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的有效抑菌時間分別為72 h、60 h、60 h和48 h。由此發(fā)現(xiàn)2E/T-0.6復(fù)合抗菌液對銅綠假單胞菌的抑制效果最好，推測原因可能是因?yàn)閺?fù)合抗菌液中的多酚對銅綠假單胞菌的細(xì)胞膜蛋白破壞程度更強(qiáng)，因?yàn)槎喾宇惪咕鷦Σ煌?xì)菌的抑制能力大小取決于細(xì)菌對多酚的耐受力，而細(xì)菌對多酚的耐受力又取決于細(xì)菌的種類和多酚的結(jié)構(gòu)[34,35]。茶多酚的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)主要為多酚基及多環(huán)結(jié)構(gòu)，它對生物大分子如脂類、蛋白質(zhì)、碳?xì)浠衔锖秃怂嵊懈叨鹊挠H和力，以致可以破壞細(xì)菌細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)[36]。儀淑敏等[37]也研究證實(shí)了茶多酚使破壞銅綠假單胞菌的代謝發(fā)生紊亂，顯著破壞銅綠假單胞菌的膜蛋白。劉文偉等[38]研究發(fā)現(xiàn)茶多酚對副溶血性弧菌的抑制效果約為36 h，由此可知，茶多酚與丁香精油進(jìn)行復(fù)合后，其協(xié)同效應(yīng)顯著提高了抗菌液對副溶血性弧菌的抑制時長。

圖3 最佳協(xié)同比下復(fù)合抗菌液對不同菌種的生長抑制曲線Fig.3 Growth inhibition curves of different antibacterial solution on different strains under optimal synergetic ratio

2.5 抗氧化性試驗(yàn)結(jié)果

2.5.1 2E/T-0.6對DPPH自由基的清除能力

抗氧化性的大小可以用抗氧化物質(zhì)監(jiān)測體系中（DPPH）的自由基清除能力來反應(yīng)和表征。濃度對2E/T復(fù)合抗菌液DPPH自由基清除率的影響結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，復(fù)合抗菌液的DPPH自由基清除率隨著濃度的增加而緩慢增加，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.6%時，達(dá)到86.68%，濃度進(jìn)一步增加后，DPPH自由基清除率基本穩(wěn)定不變。孫偉等[39]研究發(fā)現(xiàn)丁香精油的抗氧化作用在80%左右。余小亮等[19]研究的茶多酚與肉桂精油按1:1配制的復(fù)合保鮮劑（6 μg/mL）的DPPH清除率為66.23%，由此可知，該復(fù)合抗菌液具有更強(qiáng)的抗氧化性，推測原因可能是TP在發(fā)揮抗氧化作用后產(chǎn)生的游離基與精油相互作用產(chǎn)生新的酚類物質(zhì)繼續(xù)發(fā)揮作用，從而增強(qiáng)了DPPH自由基的清除效果[32]。

圖4 不同總濃度的復(fù)合抗菌液對DPPH自由基清除率的影響Fig.4 Effect of different total concentration of compound antibacterial solutions on DPPH free radical clearance rate

2.5.2 2E/T-0.6對ABTS自由基的清除能力

ABTS易被氧化劑氧化成綠色的ABTS+，而當(dāng)有抗氧化物存在時，ABTS+的形成就會被抑制，且在734 nm處有最大吸收值，因此在734 nm處測定吸光度即可計(jì)算出抗氧化物的總抗氧化能力[40]。濃度對2E/T復(fù)合抗菌液ABTS自由基清除率的影響結(jié)果如圖5所示。由圖5可知，復(fù)合抗菌液的ABTS自由基清除率隨著濃度的增加而緩慢增加，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.6%時，達(dá)到81.26%，繼續(xù)增加濃度，ABTS自由基清除率基本保持不變，無顯著性差異。韋芳媚等[41]研究發(fā)現(xiàn)0.6%的茶多酚對ABTS自由基清除率在80%左右，因此本文的復(fù)合抗菌液可以增強(qiáng)茶多酚的抗氧化能力。

圖5 不同總濃度的復(fù)合抗菌液對ABTS自由基清除率的影響Fig.5 Effect of different total concentration of compound antibacterial solutions on ABTS free radical clearance rate

3 結(jié)論

本研究以丁香精油與茶多酚為原料，得到一系列的復(fù)合抗菌液。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)丁香精油與茶多酚的質(zhì)量比為2:1時，兩者協(xié)同作用最佳，對大腸桿菌的協(xié)同系數(shù)為4.46，對金黃色葡萄球菌的協(xié)同系數(shù)為1.04，且2E/T復(fù)合抗菌液的MIC為0.2%。該復(fù)合抗菌液對養(yǎng)殖魚產(chǎn)品的特征腐敗菌種（銅綠假單胞菌和副溶血性弧菌）具有良好的抑制作用。當(dāng)復(fù)合抗菌液的質(zhì)量濃度為0.6%，對銅綠假單胞菌和副溶血性弧菌的抑制時間分別為72 h和60 h。復(fù)合抗菌液具有很好的抗氧化性能，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.6%，DPPH自由基清除率可達(dá)86.68%，ABTS自由基清除率可達(dá)81.26%，下一步將通過探討不同菌種在復(fù)合抗菌液處理下的代謝變化、膜結(jié)構(gòu)變化和蛋白質(zhì)表達(dá)等揭示復(fù)合抗菌液對腐敗菌種的抑菌機(jī)理，并將其應(yīng)用于魚類抗菌保鮮領(lǐng)域。