辣木葉水提物對(duì)H2O2致HepG2細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用

蔡小華，李小偉，李國(guó)坤，蘇立杰，陳驍熠，吳鑫蘭*

（1.廣州醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，廣東廣州 511436）（2.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無(wú)錫 214122）

機(jī)體生長(zhǎng)代謝過(guò)程中產(chǎn)生的自由基具有多種生理功能，如預(yù)防感染、調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)等[1,2]。但是，當(dāng)機(jī)體受到外源性或內(nèi)源性氧化物質(zhì)損傷時(shí)，體內(nèi)自由基產(chǎn)生和清除的動(dòng)態(tài)平衡就會(huì)遭到破壞，從而引起活性氧在體內(nèi)堆積并產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用，這一非正常的生理狀態(tài)即為氧化應(yīng)激。過(guò)多的自由基會(huì)氧化細(xì)胞膜、代謝酶系、蛋白質(zhì)和DNA等物質(zhì)，還會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，對(duì)機(jī)體的細(xì)胞及器官造成損傷[3,4]。越來(lái)越多的證據(jù)已表明，氧化應(yīng)激介導(dǎo)的氧化損傷與許多疾病的發(fā)生有關(guān)，特別是與心血管疾病、糖尿病、神經(jīng)退行性疾病、癌癥等高發(fā)疾病密切相關(guān)[5-7]。這些疾病嚴(yán)重?fù)p害了患者的身體健康，造成了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，并給人口老齡化問(wèn)題帶來(lái)更大的壓力和挑戰(zhàn)。因此，開發(fā)具有清除自由基的功能性食品和藥物日益受到重視[8-10]。

辣木（Moringa oleifera）原產(chǎn)于印度，其屬于辣木科辣木屬多年生植物，具有十分豐富而全面的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。大量研究表明，辣木（包括辣木葉、辣木根和辣木籽等）具有良好的生理活性[11,12]，引起了全世界的廣泛關(guān)注。我國(guó)衛(wèi)生部于2012年批準(zhǔn)辣木葉為新資源食品?，F(xiàn)有的數(shù)據(jù)顯示：辣木葉含有豐富的類黃酮以及多酚類物質(zhì)，使其具有較強(qiáng)的抗氧化活性[13]。例如，Sllih等[14]利用體外實(shí)驗(yàn)對(duì)不同季節(jié)的辣木葉以及同一辣木不同部位葉子的抗氧化活性進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)冬季采收的辣木葉會(huì)比夏季所采收的辣木葉具有更強(qiáng)的抗氧化活性。國(guó)內(nèi)學(xué)者周偉等[15]利用乙醇對(duì)辣木葉的抗氧化活性物質(zhì)進(jìn)行提取并用體外化學(xué)方法評(píng)價(jià)其抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)辣木葉醇提物對(duì)DPPH、ABTS和OH自由基均具有較好的清除效果。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于辣木葉抗氧化活性主要是利用體外化學(xué)方法進(jìn)行研究。但是，體外化學(xué)方法缺乏生物相關(guān)性、生物的復(fù)雜機(jī)制、作用因素和體內(nèi)代謝等方面的條件。因此，本研究旨在以過(guò)氧化氫（hydrogen peroxide，H2O2）誘導(dǎo)氧化損傷的人體肝癌細(xì)胞（HepG2 cell）為模型，從細(xì)胞水平上測(cè)定辣木葉的細(xì)胞水平抗氧化能力，在細(xì)胞層面上進(jìn)一步豐富辣木葉抗氧化活性的評(píng)價(jià)結(jié)果。本文以細(xì)胞的存活率、細(xì)胞內(nèi)主要的抗氧化酶中的超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（Glutathione Peroxidase，GSH-Px）的活力，以及非酶系統(tǒng)中的丙二醛（Malonaldehyde，MDA）的含量變化來(lái)評(píng)價(jià)辣木葉的抗氧化能力，從而為辣木葉的功能性食品開發(fā)及其抗氧化作用機(jī)制研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

GSH-Px檢測(cè)試劑盒、總SOD活性檢測(cè)試劑盒、MDA檢測(cè)試劑盒、二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度測(cè)定試劑盒、細(xì)胞裂解液，碧云天生物技術(shù)公司；PBS緩沖液、DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胰蛋白酶溶液、青霉素/鏈霉素（即雙抗）、胎牛血清，美國(guó)GIBCO公司；四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT），美國(guó)Amresco公司；二甲基亞砜（DMSO）溶液，美國(guó)Sigma公司；30% H2O2溶液，市售分析純；新鮮辣木葉，廈門天竺實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司；HepG2細(xì)胞，華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院提供。

1.2 儀器與設(shè)備

Multiskan FC酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo公司；SKE-14S超聲均質(zhì)機(jī)，寧波市鄞州碩利儀器有限公司；FD-1A-80真空冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；DK-8D恒溫水浴箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；Allegra X-22R離心機(jī)，上海賓智生物科技有限；MF52-LED倒置顯微鏡，廣州市明美光電技術(shù)有限公司；BNP-80C CO2培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；SW-CJ-1FD超凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 辣木葉水提物的制備

采用臺(tái)式真空冷凍干燥機(jī)對(duì)新鮮辣木葉進(jìn)行冷凍，冷凍干燥條件為：溫度-80 ℃，工作壓力3 MPa，干燥時(shí)長(zhǎng)1 d。干燥完成后，將辣木葉進(jìn)行研磨粉碎過(guò)篩后，按以下條件進(jìn)行超聲浸提：時(shí)間30 min、浸提溫度70 ℃、浸提料液比1:40，制得浸提液后趁熱過(guò)濾備用。

1.3.2 細(xì)胞的培養(yǎng)

（1）從液氮罐中取出待復(fù)蘇的肝癌細(xì)胞，立即放入37 ℃的恒溫水浴鍋中，左右快速擺動(dòng)使其在2 min內(nèi)迅速溶解，取出后用75%的酒精棉球擦拭凍存管外壁的水漬并進(jìn)行消毒處理，放入超凈工作臺(tái)待用。

（2）將溶解后的細(xì)胞凍存液快速吸入工作臺(tái)中已準(zhǔn)備好的離心管中，加入2 mL DMEM完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清及1%雙抗溶液），800 r/min離心5 min。

（3）棄去上清，向離心管中加入5 mL完全細(xì)胞培養(yǎng)基，輕輕吹打均勻后用移液槍轉(zhuǎn)移到滅菌過(guò)的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，移入37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

（4）待細(xì)胞生長(zhǎng)較滿，約長(zhǎng)到培養(yǎng)瓶底部面積的80%～90%左右即可進(jìn)行傳代，棄去培養(yǎng)瓶上清液后加入1 mL胰酶到培養(yǎng)瓶中，消化2 min，棄去瓶中的胰酶后加入3 mL的完全細(xì)胞培養(yǎng)基并用移液槍將細(xì)胞緩慢地吹打下來(lái)并充分混勻，轉(zhuǎn)移到離心管中800 r/min離心5 min，棄去上清加入3 mL培養(yǎng)基，混勻后取3個(gè)培養(yǎng)瓶每個(gè)培養(yǎng)瓶中吸入1 mL細(xì)胞懸液，再加入3 mL培養(yǎng)基，重新放回到培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。傳代幾次待細(xì)胞生長(zhǎng)穩(wěn)定后即可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 H2O2誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞氧化損傷模型建立

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，使用含有10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液稀釋成1×105cells/mL；在96孔板每個(gè)孔中加入100 μL細(xì)胞懸液，置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，棄去上清液，用PBS潤(rùn)洗兩次，加入100 μL濃度分別為100、200、300、400、500、600、800 μmol/L用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基稀釋的H2O2溶液到板孔中，每組溶液設(shè)置6個(gè)復(fù)孔[16]。另設(shè)調(diào)零組：不加細(xì)胞培養(yǎng)，加入100 μL無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基；空白對(duì)照組：加細(xì)胞培養(yǎng)24 h，棄去上清后加入100 μL無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基。棄去上清液，用PBS潤(rùn)洗兩次，加入用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基配制的0.5 mg/mL的MTT溶液100 μL，繼續(xù)放入培養(yǎng)箱4 h后，吸盡上清，用PBS潤(rùn)洗兩遍，再向每孔加入100 μL的DMSO，酶標(biāo)儀中37 ℃孵育10 min，在570 nm下測(cè)量96孔板的吸光值。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度，使用較為接近半數(shù)抑制濃度的H2O2濃度作為接下來(lái)的造模試劑[17]。根據(jù)以下公式計(jì)算細(xì)胞存活率：

1.3.4 MTT法檢測(cè)辣木葉水提物對(duì)細(xì)胞增殖的影響

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，使用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液稀釋成1×105cells/mL；在96孔板每個(gè)孔中加入100 μL細(xì)胞懸液，置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，棄去上清液，用PBS潤(rùn)洗兩次，加入100 μL濃度分別為100、200、400、500、600、800、1000 μg/mL用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基稀釋的辣木葉水提物到板孔中（作為藥物處理組），每組溶液設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。同上，另設(shè)調(diào)零組（不加HepG2細(xì)胞，只加等量的DMEM培養(yǎng)液）和空白對(duì)照組。棄去上清液，用PBS潤(rùn)洗兩次，加入用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基配制的0.5 mg/mL的MTT溶液，繼續(xù)放入培養(yǎng)箱4 h后，吸盡上清，用PBS潤(rùn)洗兩遍，再向每孔加入100 μL的DMSO，酶標(biāo)儀中37 ℃孵育10 min，在570 nm下測(cè)量每孔的吸光值，計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.3.5 MTT法檢測(cè)辣木葉水提物對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用

參照1.3.4方法將細(xì)胞均勻的接種到96孔板中。細(xì)胞隨機(jī)分為8組：空白對(duì)照組、調(diào)零組（不加HepG2細(xì)胞，只加等量的DMEM培養(yǎng)液）、H2O2模型組、不同濃度辣木水提物保護(hù)組（100、200、400、500、600 μg/mL）。按照上述分組，培養(yǎng)24 h后棄去上清，用PBS潤(rùn)洗兩次。在保護(hù)組加入100 μL不同濃度辣木水提物，在空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和H2O2模型組的每個(gè)孔中加入100 μL無(wú)血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，將96孔板轉(zhuǎn)移至37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)24 h后棄去上清，用PBS潤(rùn)洗兩次。在H2O2模型組和保護(hù)組中加入100 μL H2O2（400 μmol/L，用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基稀釋）溶液；在空白對(duì)照組、調(diào)零組中加入100 μL無(wú)血清的DMEM高糖培養(yǎng)基。將96孔板轉(zhuǎn)移至37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)4 h，棄去上清，用PBS潤(rùn)洗兩次。加入用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基配制的0.5 mg/mL的MTT溶液100 μL，繼續(xù)放入培養(yǎng)箱4 h后，吸盡上清，用PBS潤(rùn)洗兩遍，再向每孔加入100 μL的DMSO，酶標(biāo)儀中37 ℃孵育10 min，在570 nm下測(cè)量每孔的吸光值，計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.3.6 辣木葉水提物對(duì)H2O2誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞抗氧化酶活力相關(guān)指標(biāo)的影響

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，每孔細(xì)胞濃度為2.5×105cells/mL，接種體積為每孔1 mL，培養(yǎng)24 h后，按照空白對(duì)照組、調(diào)零組（不加HepG2細(xì)胞，只加等量的DMEM培養(yǎng)液）、H2O2模型組、不同濃度辣木水提物保護(hù)組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。各保護(hù)組分別加入1 mL濃度為100、200、400、500、600 μg/mL辣木水提物預(yù)處理24 h，空白對(duì)照組、調(diào)零組、H2O2模型組加入等體積的無(wú)血清的DMEM高糖培養(yǎng)基處理24 h。棄去上清液，用PBS潤(rùn)洗兩次，各保護(hù)組以及H2O2模型組再加入1 mL H2O2（400 μmol/L，用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基稀釋）干預(yù)4 h；空白對(duì)照組、調(diào)零組中加入等體積無(wú)血清的DMEM高糖培養(yǎng)基進(jìn)行處理。干預(yù)結(jié)束后用PBS清洗2次，然后每孔加入150 μL細(xì)胞裂解液，用細(xì)胞刮刀將每孔中細(xì)胞全部刮凈后收集到離心管中，12000 g離心10 min，取上清液備用[18]。參照相關(guān)試劑盒要求，測(cè)定細(xì)胞所含的BCA蛋白濃度、所含MDA水平、SOD活性、GSH-Px活性等相關(guān)氧化損傷的指標(biāo)[19,20]。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析

所有測(cè)定實(shí)驗(yàn)均重復(fù)至少三次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）表示。數(shù)據(jù)通過(guò)IBM SPSS Statistics 19.0進(jìn)行單因素方差分析，并以Duncans多重比較法進(jìn)行顯著性差異的分析，不同的字母表示了不同組別之間存在顯著性差異（p<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度辣木葉水提物對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響

本實(shí)驗(yàn)中辣木葉水提物的制備采用超聲輔助水提法進(jìn)行制備。據(jù)報(bào)道，辣木葉水提物主要的活性成分為多酚和黃酮，其含量如表1所示，不同的提取條件會(huì)略有差異[21]。本實(shí)驗(yàn)采用MTT法來(lái)測(cè)定不同濃度的辣木葉水提物對(duì)細(xì)胞存活率的影響。實(shí)驗(yàn)中選取了不同濃度的辣木葉水提物（100 μg/mL、200 μg/mL、400 μg/mL、500 μg/mL、600 μg/mL、800 μg/mL、1000 μg/mL），分別測(cè)定了其對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響。由圖1可以看出，與正常的細(xì)胞相比，低濃度辣木葉水提物HepG2細(xì)胞的存活率影響并不明顯（對(duì)HepG2細(xì)胞的抑制率≤6%）；但在較高濃度時(shí)，即辣木葉水提物的濃度為800 μg/mL和1000 μg/mL時(shí)，HepG2細(xì)胞的存活率與對(duì)照組相比具有明顯的下降趨勢(shì)（p<0.05），此時(shí)細(xì)胞的存活率僅為86.80%和84.08%，對(duì)細(xì)胞的存活率有比較明顯的抑制作用。因此，為了盡可能避免辣木葉水提物本身對(duì)細(xì)胞造成的毒性干擾作用，后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用低濃度的辣木葉水提物（≤600 μg/mL）進(jìn)行干預(yù)實(shí)驗(yàn)。

表1 辣木葉水提物的主要抗氧化活性成分[21]Table 1 The main antioxidant components of the aqueous extract of Moringa oleifera leaves[21]

圖1 辣木葉水提物對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響Fig.1 Effect of the aqueous extract of Moringa oleifera leaves on the viability of HepG2 cells

2.2 不同濃度H2O2對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響

H2O2是一種重要的活性氧分子，它形成的超氧陰離子自由基能使細(xì)胞膜上的脂質(zhì)物質(zhì)和蛋白發(fā)生氧化反應(yīng)，還能與胞內(nèi)的鐵離子反應(yīng)生成·OH等自由基，造成細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)和組織損傷，因此常作為體外氧化應(yīng)激損傷的造模藥物[22]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)添加0～800 μmol/L H2O2不同濃度的H2O2對(duì)HepG2細(xì)胞進(jìn)行氧化損傷，篩選合適的H2O2劑量建立氧化損傷模型。由圖2可知，加入H2O2后其對(duì)細(xì)胞造成明顯的損傷，隨著H2O2濃度的增加，HepG2細(xì)胞的存活率顯著下降。尤其是在高濃度的H2O2（即800 μmol/L）作用下，細(xì)胞存活率只有空白對(duì)照組的21.00%。

在利用H2O2建立氧化損傷細(xì)胞模型中，過(guò)高濃度的H2O2對(duì)細(xì)胞造成會(huì)促使細(xì)胞發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的損傷，不利于后期藥物對(duì)其進(jìn)行修復(fù)。因此，研究多數(shù)選擇細(xì)胞半數(shù)抑制濃度附近的H2O2劑量來(lái)建立氧化損傷模型[23,24]。例如，Yi等人[25]發(fā)現(xiàn)H2O2對(duì)HepG2細(xì)胞半抑制濃度為500 μmol/L，后續(xù)實(shí)驗(yàn)利用500 μmol/L H2O2誘導(dǎo)建立氧化應(yīng)激細(xì)胞模型。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，可計(jì)算出細(xì)胞半數(shù)抑制濃度為408.73 μmol/L，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇使用濃度為400 μmol/L的H2O2對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理建立氧化損傷模型。

圖2 H2O2對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響Fig.2 Effect of H2O2 on the viability of HepG2 cells

2.3 辣木葉水提物對(duì)氧化損傷HepG2細(xì)胞的保護(hù)作用

采用400 μmol/L的H2O2對(duì)HepG2細(xì)胞進(jìn)行氧化損傷建模后，添加0～600 μg/mL不同濃度的辣木葉水提物進(jìn)行干預(yù)實(shí)驗(yàn)，研究辣木葉對(duì)氧化損傷HepG2細(xì)胞的保護(hù)作用。如圖3所示，與沒(méi)有經(jīng)400 μmol/L H2O2處理的空白對(duì)照組相比，用H2O2處理過(guò)的模型組細(xì)胞存活率顯著降低（p<0.05）。在加入不同濃度的辣木葉水提物后，受氧化損傷的HepG2細(xì)胞存活率顯著上升，且隨著辣木水提物濃度的升高，細(xì)胞的存活率也逐漸升高。特別是當(dāng)辣木葉水提物濃度達(dá)到500和600 μg/mL時(shí)，HepG2細(xì)胞存活率恢復(fù)到接近正常組的水平，存活率將近100%。

圖3 辣木葉水提物對(duì)H2O2誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞存活率的影響Fig.3 Effect of the aqueous extract of Moringa oleifera leaves on viability of HepG2 cells with damage induced by H2O2

細(xì)胞存活率是反映外界環(huán)境對(duì)細(xì)胞損傷程度的最直觀指標(biāo)。氧化應(yīng)激的環(huán)境能導(dǎo)致胞內(nèi)活性氧水平的升高，對(duì)HepG2細(xì)胞造成氧化損傷進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[26,27]。細(xì)胞存活率越高，說(shuō)明HepG2細(xì)胞受到的氧化損傷越小。因此，細(xì)胞的存活率經(jīng)常被用來(lái)反應(yīng)天然活性成分的抗氧化能力。例如，Zhang等[22]發(fā)現(xiàn)大米蛋白水解物可將H2O2損傷細(xì)胞的存活率從50%提高到90%，說(shuō)明該大米蛋白水解物具有較強(qiáng)的抗氧化活性。本研究中，對(duì)HepG2細(xì)胞添加100～600 μg/mL的辣木葉水提物進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)后，HepG2細(xì)胞存活率從50.12%提高到60%～99.51%。由此可知，一定濃度范圍內(nèi)的辣木葉水提物對(duì)H2O2誘導(dǎo)損傷的HepG2細(xì)胞有良好的保護(hù)作用，能緩解H2O2對(duì)HepG2細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷。

2.4 辣木葉水提物對(duì)氧化損傷HepG2細(xì)胞內(nèi)SOD的作用效果

SOD是一類具有特殊生理活性的物質(zhì)，也是生物體內(nèi)清除自由基的最主要的物質(zhì)之一。SOD作為機(jī)體內(nèi)清除自由基的第一道防線，主要清除細(xì)胞內(nèi)的超氧陰離子自由基，催化其發(fā)生歧化反應(yīng)，將超氧化物轉(zhuǎn)化為H2O2和H2O，進(jìn)而達(dá)到保護(hù)細(xì)胞免受自由基損傷的目的[28,29]。SOD在生物體內(nèi)的水平高低也是反映生物體衰老與死亡的一個(gè)直觀指標(biāo)，其活力水平反應(yīng)機(jī)體清除氧自由基的能力高低[30]。

結(jié)果如圖4所示，與空白對(duì)照組細(xì)胞SOD活力（138.84 U/mg蛋白）相比，用400 μmol/L H2O2處理后的氧化應(yīng)激模型組細(xì)胞的SOD活力下降明顯（48.78 U/mg蛋白），下降幅度非常大。這表明該濃度下的H2O2能破壞細(xì)胞的氧化調(diào)節(jié)系統(tǒng)，降低胞內(nèi)抗氧化酶系的活力，致使胞內(nèi)的氧化動(dòng)態(tài)平衡失衡，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生不可逆的氧化損傷。同時(shí)，這也進(jìn)一步證明本實(shí)驗(yàn)氧化應(yīng)激細(xì)胞模型成功構(gòu)建。與模型組相比，不同劑量的辣木葉水提物對(duì)細(xì)胞進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)后，能夠顯著地抑制H2O2所引起的細(xì)胞SOD含量的降低（p<0.05）。辣木葉水提物的加入，使細(xì)胞的SOD活力從模型組的48.78 U/mg蛋白升高至59.63～116.62 U/mg蛋白，提高幅度為22.24%～139.07%，且提高水平呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系。這表明辣木葉水提物能顯著緩解H2O2所引起HepG2胞內(nèi)SOD水平的降低，進(jìn)而發(fā)揮抗氧化應(yīng)激功能。

圖4 辣木葉水提物對(duì)H2O2誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞SOD活力的影響Fig.4 Effect of the aqueous extract of Moringa oleifera leaves on SOD activity in HepG2 cells induced by H2O2

2.5 辣木葉水提物對(duì)氧化損傷HepG2細(xì)胞內(nèi)的GSH-Px活力的影響

GSH-Px是機(jī)體內(nèi)重要的過(guò)氧化物分解酶，能催化GSH將H2O2等過(guò)氧化物還原成無(wú)毒的羥基化合物，從而保護(hù)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能免受過(guò)氧化物的干擾和破壞[30,31]。GSH-Px的含量高低反映了細(xì)胞中自由基的數(shù)量多少：自由基含量越低，其對(duì)細(xì)胞的毒害作用就越小，機(jī)體受到的氧化損傷就越低[32]。

如圖5所示，與正常對(duì)照組相比，加入H2O2后細(xì)胞的GSH-Px酶活性呈現(xiàn)顯著下降（p<0.05），其酶活力值僅為正常對(duì)照組的50.42%。這表明該濃度下的H2O2對(duì)細(xì)胞造成了較為嚴(yán)重的氧化損傷，細(xì)胞內(nèi)的抗氧化酶GSH-Px的活性被破壞。當(dāng)采用不同濃度的辣木葉水提物對(duì)細(xì)胞進(jìn)行預(yù)孵育處理后，細(xì)胞GSH-Px含量顯著上升（p<0.05）。與模型組相比，不同濃度辣木葉水提物使細(xì)胞GSH-Px含量提高了20.77%～151.74%。此外，隨著辣木葉水提物濃度的升高，GSH-Px的水平也越來(lái)越接近正常水平。這說(shuō)明辣木葉水提物起可提高GSH-Px的活性，從而有利于催化GSH對(duì)氫過(guò)氧化物的還原反應(yīng)，阻斷體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化，保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷的作用。

圖5 辣木葉水提物對(duì)H2O2誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞GSH-Px活力的影響Fig.5 Effect of the aqueous extract of Moringa oleifera leaves on GSH-Px activity in HepG2 cells induced by H2O2

2.6 辣木葉水提物對(duì)H2O2誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞MDA水平的影響

機(jī)體存在天然的氧化調(diào)控系統(tǒng)，在正常狀態(tài)下能夠抵抗一定程度的外界氧化應(yīng)激刺激，維持機(jī)體氧化應(yīng)激的動(dòng)態(tài)平衡，從而避免外界對(duì)機(jī)體造成的氧化損傷[33]。但是，當(dāng)氧化應(yīng)激程度較為強(qiáng)烈，且機(jī)體的抗氧化系統(tǒng)不足以彌補(bǔ)時(shí)，細(xì)胞膜上不飽和脂肪酸首先會(huì)發(fā)生氧化反應(yīng)。而MDA則是細(xì)胞膜上的脂類被氧化后所生成的重要代謝產(chǎn)物。它的產(chǎn)生可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞代謝和功能障礙，甚至死亡[34,35]。MDA作為一種對(duì)機(jī)體有毒性和副作用的分子，其在細(xì)胞中的含量可以反映機(jī)體中脂質(zhì)過(guò)氧化的程度，從而能夠間接地反映細(xì)胞的氧化損傷程度[36,37]。因此，MDA的測(cè)定可用來(lái)對(duì)氧自由基介導(dǎo)的細(xì)胞損傷進(jìn)行評(píng)價(jià)。

通過(guò)MDA試劑盒測(cè)定了辣木葉水提物對(duì)細(xì)胞內(nèi)MDA含量的影響，結(jié)果如圖6所示。H2O2處理的模型對(duì)照組細(xì)胞產(chǎn)生的MDA水平在所有組別細(xì)胞中是最高的，與空白對(duì)照組相比升高了108.11%（p<0.05），增幅非常明顯。然而，當(dāng)不同濃度的辣木葉水提物加入到細(xì)胞并經(jīng)過(guò)預(yù)孵育處理后，細(xì)胞內(nèi)的MDA水平相比于模型對(duì)照組有了顯著的降低，其下降幅度為12.51%～34.04%，且呈現(xiàn)劑量效應(yīng)。這表明HepG2細(xì)胞經(jīng)H2O2處理后細(xì)胞膜發(fā)生了較嚴(yán)重的損傷，而辣木葉水提物能顯著緩解活性氧對(duì)細(xì)胞膜脂質(zhì)氧化損傷的影響，能減輕自由基對(duì)機(jī)體的氧化應(yīng)激損傷，進(jìn)而能提高機(jī)體對(duì)外界氧化應(yīng)激的調(diào)控能力。這與之前辣木葉水提物能緩解H2O2所引起的細(xì)胞存活率降低、GSH-Px和SOD等酶類水平下降的結(jié)果相一致。

圖6 辣木葉水提物對(duì)H2O2誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞MDA濃度的影響Fig.6 Effect of the aqueous extract of Moringa oleifera leaves on MDA content in HepG2 cells induced by H2O2

目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者均已通過(guò)體外化學(xué)方法分析了辣木葉水提物、醇提物以及乙酸乙酯提取物等不同方法提取物的抗氧化活性[38,39]。例如，國(guó)內(nèi)學(xué)者陳慶鑰等[40]利用超聲波輔助提取辣木葉總黃酮并測(cè)定其DPPH自由基的清除能力，發(fā)現(xiàn)其具有較強(qiáng)的抗氧化活性，其清除DPPH自由基的能力隨著濃度的升高而增強(qiáng)；國(guó)外學(xué)者Garcia-Beltran等[41]同樣發(fā)現(xiàn)辣木葉水提物和醇提物均具有較強(qiáng)的自由基清除能力，且具有劑量依賴效應(yīng)。本研究從細(xì)胞層面上，發(fā)現(xiàn)了辣木葉水提物具有較強(qiáng)的抗氧化活性，其抗氧化活性具有劑量依賴效應(yīng)，與上述研究結(jié)果一致。辣木葉水提物中主要含有黃酮、多酚、多糖、蛋白質(zhì)等成分[38]。其中，研究認(rèn)為，辣木葉水提物中的抗氧化活性成分主要為多酚及黃酮[21]。因此，辣木葉水提物對(duì)H2O2誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用，可能的原因是其具有較為豐富的多酚及黃酮物質(zhì)。

目前，在細(xì)胞氧化應(yīng)激模型建立后，針對(duì)天然活性物質(zhì)抗氧化能力的評(píng)價(jià)指標(biāo)主要有細(xì)胞內(nèi)主要抗氧化酶酶活力的變化（如SOD、GSH-Px、過(guò)氧化氫酶等）和非酶系統(tǒng)相關(guān)產(chǎn)物的含量變化（如MDA和GSH等）[42]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)辣木葉水提物可降低胞內(nèi)MDA水平，提高GSH-Px和SOD等酶類的活性，表明辣木葉水提物可能通過(guò)減輕細(xì)胞膜脂質(zhì)的氧化程度、提高胞內(nèi)抗氧化物酶系的活力等途徑提高機(jī)體的抗氧化能力，從而增強(qiáng)對(duì)外界氧化應(yīng)激的調(diào)控。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以辣木葉水提物為研究對(duì)象，以H2O2誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞構(gòu)建氧化應(yīng)激損傷模型，分別從細(xì)胞存活率、胞內(nèi)MDA水平和抗氧化酶系活力等方面探討辣木葉水提物對(duì)氧化應(yīng)激損傷的修復(fù)作用。結(jié)果表明：辣木葉水提物能顯著緩解H2O2引起的HepG2細(xì)胞存活率的降低和胞內(nèi)MDA水平的升高，提高抗氧化酶GSH-Px和SOD的活力，從而提高細(xì)胞抗氧化能力。以上研究表明，辣木葉水提物具有較強(qiáng)的細(xì)胞抗氧化活性，這為后續(xù)辣木葉對(duì)細(xì)胞抗氧化的作用機(jī)制研究提供了基礎(chǔ)，也為辣木葉抗氧化功能產(chǎn)品的開發(fā)提供理論依據(jù)。