辣木籽異硫氰酸酯衍生物抑制結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞的生長和遷移

楊茗茸，楊揚，彭麟杰，毛家英，盛軍,3，解靜,3*，田洋,3*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南昆明 650201）（2.國家辣木加工技術(shù)研發(fā)專業(yè)中心，云南昆明 650201）（3.教育部食藥同源資源開發(fā)與利用工程中心，云南省藥食同源功能食品開發(fā)工程中心，云南昆明 650201）

結(jié)直腸癌作為一種常見的消化道惡性腫瘤，在世界范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅人類健康，其發(fā)病率高居全球第三位，是導(dǎo)致癌癥相關(guān)死亡的第二大病因[1-3]。結(jié)直腸癌主要通過手術(shù)切除和化學(xué)療法治療，但結(jié)腸癌患者的傳統(tǒng)手術(shù)治療大多會出現(xiàn)高復(fù)發(fā)、低預(yù)后的情況[4]，且輔助化療價格昂貴，并易產(chǎn)生毒性及耐藥性[5,6]。因此，探索低毒、高效的抗腫瘤藥物正成為結(jié)腸癌治療研究領(lǐng)域的新熱點。

辣木（Moringa oleiferaLam.）為辣木科辣木屬多年生熱帶喬木。作為一種新開發(fā)利用的食品，近年來，對辣木保健食品開發(fā)及有效成分的提取多有研究。辣木籽是辣木的種子，除了具有豐富的蛋白質(zhì)、油脂、維生素、多糖等營養(yǎng)物質(zhì)[7]，同時富含多種活性成分。研究發(fā)現(xiàn)，辣木籽具有抗氧化[8]、抗菌[9]、抗癌[10]、降血糖血脂[11,12]等作用。

異硫氰酸酯類化合物（Isothiocyanates，ITCs）是廣泛存在于十字花科植物中的一類含硫有機化合物，具有多種生物學(xué)活性[13-15]。大量研究表明，辣木籽異硫氰酸酯化合物具有抗炎[16]、降血壓[17]、抗菌[18]、抗癌[19]等活性。其中，對肝癌Hep 3B細(xì)胞[20]、結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞[21]、人前列腺癌PC-3細(xì)胞[22]的增殖具有抑制作用，也可通過調(diào)節(jié)NF-κB和凋亡相關(guān)因子抑制SH-SY5Y人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞生長[23]。

異硫氰酸酯已被證明是具有活力的天然抗癌產(chǎn)物，但部分異硫氰酸酯由于其獨特的化學(xué)結(jié)構(gòu)，在溫度、pH值、光照、溶劑等因素的影響下易降解[24-26]。此類辣木籽異硫氰酸酯（MITC）對熱不穩(wěn)定[27]，有待優(yōu)化結(jié)構(gòu)。課題組前期對MITC進(jìn)行了結(jié)構(gòu)優(yōu)化，并合成了一系列的MITC衍生物，通過抗癌活性篩選發(fā)現(xiàn)MITC-21的抗癌活性最佳。因此，本研究在前期工作基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討MITC-21對HCT-116細(xì)胞增殖、凋亡和遷移的調(diào)控作用，明確MITC-21抑制HCT-116細(xì)胞生長和遷移的效果，為辣木資源的有效利用及結(jié)腸癌的防治奠定科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品與試劑

人結(jié)腸癌細(xì)胞（HCT-116）、人胃粘膜細(xì)胞（GES-1）、人前列腺癌細(xì)胞（PC-3）、人腎透明細(xì)胞腺癌細(xì)胞（786-O）、人宮頸癌細(xì)胞（Hela）、人乳腺癌細(xì)胞（MDA-MB-231）購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫，MITC、MITC-21由教育部食藥同源資源開發(fā)與利用工程中心提供。F/12培養(yǎng)基，Hyclone公司；胎牛血清，BI公司；Bax、Bcl-2、MMP2、β-tubulin一抗，Abcam公司；噻唑藍(lán)MTT，sigma公司；結(jié)晶紫，阿拉丁生化科技股份有限公司；細(xì)胞凋亡檢測試劑盒，翊圣生物有限公司；RIPA及PMSF，索萊寶生物技術(shù)公司；BCA測定試劑盒，碧云天生物技術(shù)有限公司；超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒，萬類生物科技有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

低速離心機，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；CO2培養(yǎng)箱，德國賓德；多功能酶標(biāo)儀、倒置顯微鏡，上海蔡康光學(xué)儀器有限公司；細(xì)胞計數(shù)器，Count star；Molecular Devices；恒溫金屬浴，上海一恒科技有限公司；電泳儀，北京六一生物科技有限公司；曝光機，科銳；高速冷凍離心機，（CT15RE）Hitachi；流式細(xì)胞儀，BDC6。

1.2 實驗方法

1.2.1 辣木籽異硫氰酸酯衍生物制備

加入辣木籽中提取的異硫氰酸酯與3,5-二溴鄰氨基氨基苯甲酸以乙醇作溶劑加入三乙胺催化，在90 ℃條件下反應(yīng)，置于油浴鍋中進(jìn)行，通過薄層層析點板的方法檢測，到產(chǎn)生新物質(zhì)后結(jié)束反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后通過沙漏沖洗法和柱層析法分離出產(chǎn)物后蒸干。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞培養(yǎng)在含有10%胎牛血清和1%雙抗的F/12培養(yǎng)基中，并置于37 ℃，5%的CO2培養(yǎng)箱中，每隔兩天傳代一次。

1.2.3 MTT法檢測細(xì)胞存活率

收集對數(shù)生長期的細(xì)胞，胰蛋白酶消化后計數(shù)，以1×104cells/孔接種于96孔板中，于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～24 h，分別用不同濃度的MITC-21（0、0.5、1、2、4、8和16 μmol/L）處理細(xì)胞24、48、72 h，移除培養(yǎng)基，加入100 μL濃度為0.25 mg/mL的MTT溶液，孵育4 h后終止培養(yǎng)，移除MTT溶液，每孔加入100 μL DMSO，振蕩10 min至結(jié)晶充分溶解，在酶標(biāo)儀OD490nm處檢測各孔的吸光度值，計算細(xì)胞存活率。

1.2.4 克隆形成實驗

收集對數(shù)生長期的HCT-116細(xì)胞，胰蛋白酶消化后計數(shù)，以500 cells/孔接種于6孔板中培養(yǎng)24 h，用不同濃度的MITC-21（0、2和4 μmol/L）處理24、48、72 h，更換正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至空白對照組細(xì)胞生長至80%后，吸棄培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液清洗兩次，甲醇固定10 min，用0.1%結(jié)晶紫染色30 min，洗滌晾干后拍照，并用10%的冰乙酸溶解結(jié)晶紫，在酶標(biāo)儀OD560nm處測量吸光值，計算克隆形成率。

1.2.5 倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化

收集生長狀態(tài)良好的HCT-116細(xì)胞，以適當(dāng)濃度接種于6孔板中培養(yǎng)12～24 h，用不同濃度的MITC-21（0、2和4 μmol/L）處理48 h，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化，并拍照。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

取對數(shù)生長期細(xì)胞接種于6孔板中，每孔2×105cells，過夜貼壁生長，采用不同濃度的MITC-21（0、2和4 μmol/L）處理細(xì)胞24、48、72 h，用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液清洗后，胰蛋白酶消化收集細(xì)胞于離心管中，300 g，4 ℃離心5 min，棄上清液收集細(xì)胞，用PBS清洗2次。使用100 μL 1×Binding Buffer重懸細(xì)胞，加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI Staining Solution，避光、室溫反應(yīng)10～15 min。加入400 μL 1×Binding Buffer，混勻后放置于冰上，樣品在1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.7 細(xì)胞劃痕實驗

取對數(shù)生長期的HCT-116細(xì)胞接種于60 mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，待過夜貼壁生長后，用槍頭對細(xì)胞層劃痕，加入磷酸鹽緩沖液清洗，用不同濃度的MITC-21（0、2和4 μmol/L）處理細(xì)胞，48 h后拍照觀察細(xì)胞劃痕愈合情況。

1.2.8 Western blot法檢測相關(guān)蛋白表達(dá)量

取對數(shù)生長期細(xì)胞接種于60 mm培養(yǎng)皿中，每孔5×105個，于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中過夜貼壁生長，加入不同濃度的MITC-21（0、2和4 μmol/L）處理細(xì)胞48 h，吸棄培養(yǎng)基，用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液清洗后，使用RIPA裂解液和PMSF（RIPA:PMSF=100:1）提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。在質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的聚丙烯酰胺凝膠上分離后，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，用5%的脫脂奶粉在室溫下封閉1 h，與一抗在4 ℃下過夜孵育。第2 d用1×TBST清洗PVDF膜3次，再將PVDF膜與相應(yīng)二抗在室溫下孵育1 h，1×TBST清洗3次，最后用曝光儀曝光顯影。

1.2.9 數(shù)據(jù)處理與分析

使用Graphpad prism、ImageJ、SPSS等軟件進(jìn)行分析統(tǒng)計，組間比較采用單因素方差分析，*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001。

2 結(jié)果與討論

2.1 MITC-21對HCT-116細(xì)胞存活率的影響

MITC、MITC-21結(jié)構(gòu)式如圖1a所示。首先采用MTT法對MITC-21進(jìn)行抗癌活性篩選。研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，MITC-21劑量為10 μmol/L時，PC-3細(xì)胞、HCT-116細(xì)胞、Hela細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞的存活率受到其顯著抑制，且抑制率分別為18.72%（p<0.01）、59.87%（p<0.001）、54.4%（p<0.001）和53.87%（p<0.001）（表1）。結(jié)果表明，MITC-21具有一定的抗癌活性，且其對結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞的抗癌活性最為顯著。因此，在后續(xù)的實驗中，進(jìn)一步探究MITC-21對HCT-116細(xì)胞生長和遷移的抑制作用。

圖1 辣木籽異硫氰酸酯及衍生物對HCT-116細(xì)胞及GES-1細(xì)胞存活率的影響Fig.1 Effects of Moringa oleifera seeds isothiocyanate and its derivatives on the survival rate of HCT-116 cells and IEC-6 cells

表1 辣木籽異硫氰酸酯衍生物對5種癌細(xì)胞存活率的影響Table 1 Effect of Moringa oleifera seeds isothiocyanate derivatives on the survival rate of five kinds of cancer cells

為了進(jìn)一步研究MITC-21抑制HCT-116細(xì)胞生長是否具有時間和劑量依賴性，采用不同濃度的MITC-21（0、0.5、1、2、4、8和16 μmol/L）處理結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞24、48和72 h，并使用MTT法檢測細(xì)胞存活率。研究發(fā)現(xiàn)，隨著MITC-21濃度的增加，細(xì)胞存活率逐漸降低，并且在MITC-21處理HCT-116細(xì)胞24 h后，細(xì)胞存活率從100.00%降低到84.84%、83.98%、67.86%（p<0.001）、54.09%（p<0.001）、49.68%（p<0.001）和36.42%（p<0.001）；處理48 h后細(xì)胞存活率從100.00%降低到86.09%（p<0.05）、70.90%（p<0.001）、59.14%（p<0.001）、56.90%（p<0.001）、32.24%（p<0.001）和22.03%（p<0.001）；處理72 h后細(xì)胞存活率從100.00%降低到94.21%（p<0.001）、93.68%（p<0.001）、85.25%（p<0.001）、72.49%（p<0.001）、69.07%（p<0.001）和42.94%（p<0.001）（圖1b）。三個時間段的半致死劑量（IC50）分別為6.79μmol/L、3.71 μmol/L、1.13 μmol/L。結(jié)果表明，MITC-21呈時間和劑量依賴性的方式顯著抑制HCT-116細(xì)胞存活率。為了研究MITC-21對正常細(xì)胞是否具有毒性，使用相同劑量的MITC-21處理人胃粘膜細(xì)胞（GES-1）。研究發(fā)現(xiàn)，MITC-21對GES-1細(xì)胞的存活率沒有太大影響，且細(xì)胞存活率分別為100.00%、101.78%、100.42%、99.01%、97.02%、91.85%（p<0.05）、85.28%（p<0.001）（圖1c）。以上結(jié)果表明，MITC-21具有顯著抑制HCT-116細(xì)胞生長的作用，且對正常細(xì)胞無毒。

2.2 MITC-21對HCT-116細(xì)胞克隆形成的影響

當(dāng)單個細(xì)胞在體外增殖6代以上，其后代所組成的細(xì)胞群體，稱為集落或克隆。細(xì)胞克隆形成實驗是檢測細(xì)胞增殖能力的有效方法之一[28]，通過計算克隆形成率，來測定細(xì)胞的增殖能力。已有研究表明，辣木籽異硫氰酸酯能顯著抑制皮膚癌A431細(xì)胞克隆形成，5 μmol/L處理細(xì)胞48 h后克隆形成率降低到48.54%（p<0.001）[29]。本研究通過克隆形成實驗評價MITC-21對HCT-116細(xì)胞集落形成的影響。綜合24、48和72 h半致死劑量（IC50），選擇具有抑制細(xì)胞生長效果且濃度小于或接近半致死劑量的2和4 μmol/L進(jìn)行后續(xù)實驗。結(jié)果如圖2所示，采用不同劑量的MITC-21（0、2和4 μmol/L）處理HCT-116細(xì)胞24 h后，與對照組相比，細(xì)胞克隆形成率分別降低到53.95%（p<0.01）和46.16%（p<0.01）；處理48 h后，與對照組相比，細(xì)胞克隆形成率分別降低到68.36%（p<0.05）和49.51%（p<0.01）；處理72 h后，與對照組相比，細(xì)胞克隆形成率分別降低到42.22%（p<0.001）和35.79%（p<0.001）。結(jié)果表明，MITC-21具有顯著抑制HCT-116細(xì)胞克隆形成的作用。

圖2 辣木籽異硫氰酸酯衍生物對HCT-116細(xì)胞克隆形成率的影響Fig.2 Effect of Moringa oleifera seeds isothiocyanate derivatives on the colony formation rate of HCT-116 cells

2.3 MITC-21對HCT-116細(xì)胞形態(tài)的影響

細(xì)胞發(fā)生凋亡時，會出現(xiàn)細(xì)胞體積縮小，連接消失，與周圍的細(xì)胞脫離等形態(tài)學(xué)變化。采用不同劑量的MITC-21（0、2和4 μmol/L）處理HCT-116細(xì)胞48 h后，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。如圖3所示，顯微鏡下觀察到對照組細(xì)胞長勢較好，細(xì)胞緊密排列，脫落細(xì)胞較少，MITC-21處理細(xì)胞48 h后的細(xì)胞出現(xiàn)變圓、皺縮，脫落細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)液中，隨著MITC-21濃度的升高，培養(yǎng)液中脫落細(xì)胞越來越多，貼壁細(xì)胞變得更加稀疏，間隙增大，體積縮小，細(xì)胞碎片較多。以上結(jié)果表明，MITC-21能夠使HCT-116細(xì)胞形態(tài)發(fā)生非正常改變，初步提示MITC-21能夠引起細(xì)胞的凋亡。

圖3 辣木籽異硫氰酸酯衍生物對HCT-116細(xì)胞形態(tài)的影響Fig.3 Effect of Moringa oleifera seeds isothiocyanate derivatives on morphology of HCT-116 cells

2.4 MITC-21對HCT-116細(xì)胞凋亡的影響

細(xì)胞凋亡（或程序性細(xì)胞死亡）在動物的發(fā)育過程中起著關(guān)鍵作用，是由基因控制的細(xì)胞自主、有序的死亡，參與了組織的形成重塑[30]。甘輝云等[31]研究發(fā)現(xiàn)，2.5 μmol/L苯乙基異硫氰酸酯處理Hep-2細(xì)胞后凋亡率與空白對照組比較無明顯差異（p>0.05），5.0 μmol/L組相較空白對照組組有顯著差異（p<0.05）。為了進(jìn)一步證實MITC-21是否引起HCT-116細(xì)胞凋亡，采用流式細(xì)胞術(shù)評價MITC-21對HCT-116細(xì)胞凋亡的影響。如圖4所示，MITC-21處理24 h后，細(xì)胞凋亡率分別從20.00%增加到24.85%（p<0.01）和26.02%（p<0.001）；處理48 h后，細(xì)胞凋亡率分別從14.97%增加到21.60%（p<0.001）和22.78%（p<0.001）；處理72 h后，細(xì)胞凋亡率分別從33.40%增加到48.78%（p<0.001）和52.12%（p<0.001）。隨著MITC-21劑量的增加，細(xì)胞凋亡率顯著增加，并呈現(xiàn)出一定的時間依賴性。以上結(jié)果表明，MITC-21具有誘導(dǎo)結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞凋亡的作用。

圖4 辣木籽異硫氰酸酯衍生物對HCT-116細(xì)胞凋亡的影響Fig.4 Effect of Moringa oleifera seeds isothiocyanate derivatives on apoptosis of HCT-116 cells

2.5 MITC-21對HCT-116細(xì)胞遷移的影響

遷移是腫瘤細(xì)胞生長過程中必不可少的環(huán)節(jié)之一，對于腫瘤的發(fā)展至關(guān)重要，也是惡性腫瘤細(xì)胞共同的特征[32]。因此，采用細(xì)胞劃痕愈合實驗探討MITC-21對HCT-116細(xì)胞遷移能力的影響。Chou等[33]研究表明，異硫氰酸苯乙酯以劑量依賴的方式減少GBM 8401細(xì)胞的遷移，并通過抑制uPA、Rho A和RAS，抑制MMP-2、-7和-9基因的表達(dá)。在本文研究中發(fā)現(xiàn)，MITC-21（0、2和4 μmol/L）處理HCT-116細(xì)胞48 h后，細(xì)胞劃痕愈合率分別從61.53%降低到32.89%（p<0.01）和24.30%（p<0.001）（圖5）。與對照組相比，隨著MITC-21劑量的增加，細(xì)胞劃痕愈合率逐漸降低，細(xì)胞遷移顯著減少。結(jié)果表明MITC-21顯著抑制結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞遷移。

圖5 辣木籽異硫氰酸酯衍生物對HCT-116細(xì)胞遷移的影響Fig.5 Effect of Moringa oleifera seeds isothiocyanate derivatives on migration of HCT-116 cells

2.6 MITC-21對HCT-116細(xì)胞凋亡及遷移蛋白表達(dá)的影響

細(xì)胞凋亡可受內(nèi)源性線粒體途徑誘導(dǎo)，在細(xì)胞凋亡途徑中，Bcl-2和Bax是兩個主要的相關(guān)蛋白，線粒體膜的完整性嚴(yán)格受到Bcl-2蛋白家族的調(diào)控，Bcl-2屬原癌基因，定位于線粒體膜上，阻止線粒體外膜的透化，高表達(dá)的Bcl-2可抑制細(xì)胞凋亡。Bax促進(jìn)線粒體外膜的透化，具有促凋亡作用，Bax/Bcl-2比值的變化對決定細(xì)胞凋亡或存活至關(guān)重要[34,35]。劉海彬等[36]研究發(fā)現(xiàn)縮氨基硫脲-喹唑啉衍生物通過誘導(dǎo)Bax的激活，抑制Bcl-2的活性，誘導(dǎo)A549細(xì)胞的凋亡。為進(jìn)一步證實MITC-21是否通過調(diào)控Bax及Bcl-2蛋白表達(dá)誘導(dǎo)HCT-116細(xì)胞凋亡，將MITC-21（0、2和4 μmol/L）處理HCT-116細(xì)胞48 h后，通過蛋白印跡法檢測凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2的表達(dá)情況。結(jié)果如圖6a和6b所示，與對照組相比，MITC-21（4μmol/L）增加了促凋亡蛋白Bax的表達(dá)水平，降低了抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)水平，并顯著增加Bax/Bcl-2的比例。結(jié)果表明MITC-21調(diào)控了HCT-116細(xì)胞中Bax及Bcl-2蛋白的表達(dá)，這可能導(dǎo)致了線粒體膜完整性的破壞，從而促進(jìn)HCT-116細(xì)胞凋亡。在Liu等[37]的研究中得到相似的結(jié)果，異硫氰酸苯乙酯能通過線粒體介導(dǎo)的Bax/Bcl-2途徑誘導(dǎo)IPEC-J2細(xì)胞凋亡。MMP2是基質(zhì)金屬蛋白酶家族成員，當(dāng)被細(xì)胞外蛋白酶分解后發(fā)生激活、降解和重塑細(xì)胞外基質(zhì)，參與腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲[38,39]。端傳友[40]通過檢測MMP-2在86例結(jié)腸癌組織及正常結(jié)腸組織中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌組織中MMP-2表達(dá)水平及陽性率均顯著高于正常結(jié)腸組織，提示MMP-2高表達(dá)與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。通過MITC-21（0、2和4 μmol/L）處理HCT-116細(xì)胞48 h，采用蛋白印跡法檢測遷移相關(guān)蛋白MMP2的表達(dá)情況，結(jié)果如圖6a和b所示，與對照組相比，MITC-21（4 μmol/L）顯著降低MMP2蛋白表達(dá)水平，表明MITC-21可通過抑制HCT-116細(xì)胞中遷移蛋白MMP2的表達(dá)進(jìn)而抑制細(xì)胞的遷移。

圖6 辣木籽異硫氰酸酯衍生物對HCT-116細(xì)胞凋亡及遷移蛋白的影響Fig.6 Effects of Moringa oleifera seeds isothiocyanate derivatives on apoptosis and migration protein of HCT-116 cells

綜上所述，Bax/Bcl-2、MMP2檢測結(jié)果與流式細(xì)胞術(shù)及細(xì)胞劃痕愈合結(jié)果相一致，進(jìn)一步驗證了MITC-21對細(xì)胞凋亡和細(xì)胞遷移的調(diào)控效應(yīng)。

3 結(jié)論

本研究以結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞為研究對象，通過MTT實驗、克隆形成實驗、流式細(xì)胞術(shù)、劃痕愈合實驗和蛋白印跡法，檢測經(jīng)不同濃度的MITC-21處理后的HCT-116細(xì)胞增殖、凋亡和遷移的變化情況。結(jié)果表明MITC-21具有抑制HCT-116細(xì)胞增殖和遷移并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，同時可調(diào)控Bax/Bcl-2比率和MMP2蛋白的表達(dá)水平。本研究確定了MITC-21具有良好的抗腫瘤效果，可為辣木資源的有效利用及結(jié)直腸癌的防治提供理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。