黃芪甲苷對鎘聯(lián)合高脂高糖致糖尿病小鼠胰臟損傷的保護(hù)作用

龔頻，劉萌，裴舒亞，楊倩，楊文娟，陳福欣

（1.陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，陜西西安 710021）（2.西安科技大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，陜西西安 710054）

隨著人民生活水平的提升及生活方式的改變，糖尿病患者的數(shù)量逐年增加，且有極高的患病率、致殘率和死亡率，已成為嚴(yán)重威脅人類健康的疾病之一。最新數(shù)據(jù)表明，截至到2015年全球有超過4億1500萬人患有糖尿?。―iabetic Mellitus，DM），預(yù)計在2040年將增加到6億4200萬人，中國DM患者人數(shù)最多為1億960萬[1]。流行病學(xué)的調(diào)查結(jié)果顯示，在中國成年人中，DM總患病率為10.9%[2]。糖尿病的病因十分復(fù)雜，迄今為止尚不清楚，它可以引起心、腦、肝、腎、胰臟等多種器官的損傷，嚴(yán)重危害人類的健康。

重金屬鎘（Cadmium，Cd）被廣泛的應(yīng)用于染料、電池等行業(yè)，但鎘的毒性較大，被國際癌癥機(jī)構(gòu)列為Ⅰ類致癌物。鎘的生物半衰期為10～30年，易于在生物體內(nèi)富集，特別是在肝臟、腎臟以及骨骼中富集，從而引起機(jī)體出現(xiàn)健康損害甚至中毒。日常生活中鎘暴露主要來自于食物、水源以及香煙燃燒[3,4]。流行病學(xué)研究表明，鎘暴露與糖尿病的發(fā)生發(fā)展存在密切的關(guān)聯(lián)[5-7]，但是鎘暴露對糖尿病狀態(tài)下的胰臟的損傷作用報道較少。同時，研究顯示，高血糖所致的氧化應(yīng)激是導(dǎo)致糖尿病胰島素抵抗的原因之一。高血糖使機(jī)體內(nèi)部血糖持續(xù)增高，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)，大量活性氧簇（ROS）被聚積，胰臟處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，易激活多個損傷機(jī)制而破壞其結(jié)構(gòu)和功能[8]。

目前，關(guān)于糖尿病的治療主要包括注射胰島素及口服降糖藥，如磺酰脲類，雙胍類，α-葡萄糖苷酶抑制劑和格列奈類，但糖尿病患者長期服用會使機(jī)體產(chǎn)生耐藥性且對肝臟，腎臟等器官造成損傷[9]。與化學(xué)藥物相比，傳統(tǒng)中藥大多來源于自然界，且一般都含有多種藥理作用，很多中藥材有藥食同源的功效，對機(jī)體的毒副作用相對較低，因此，從天然產(chǎn)物中篩選和發(fā)現(xiàn)降血糖活性成分成為糖尿病新藥研發(fā)的重要方向[10,11]。

黃芪是蒙古黃芪、膜莢黃芪的根，性味微溫、甘，在中國被廣泛用于治療消渴癥及其并發(fā)癥，黃芪具有補(bǔ)氣升陽、固表止汗、利水消腫、托毒生肌等功效，《神農(nóng)本草經(jīng)》有云：“主諸熱黃疸，腸澼泄痢，逐水，下血閉，惡瘡疽蝕火瘍?！薄｜S芪甲苷（Astragaloside IV，AS-IV）是其重要的功效成分之一。黃芪甲苷的主要藥理作用包括增強(qiáng)免疫力、抗炎、抗氧化、抗病毒等，在臨床上被用于治療腎病、糖尿病、心腦血管等疾病[12]，已有研究表明黃芪甲苷可以降低血糖水平，改善胰島素抵抗，降低氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)，從而起到保護(hù)作用[13,14]，但是黃芪甲苷對鎘誘導(dǎo)的糖尿病小鼠的胰臟損傷的保護(hù)作用尚未見報道。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

SPF級雄性昆明小鼠[許可證號：SCXK(陜)2017-003]，購自西安交通大學(xué)實驗動物中心；黃芪甲苷購于源葉科技有限公司，純度大于99%，其結(jié)構(gòu)式如圖1所示。氯化鎘（CdCl2）購自天津市福晨化學(xué)試劑廠，生理鹽水購自西安京西雙鶴藥業(yè)有限公司；其他試劑均為分析純。

圖1 黃芪甲苷的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structure of astragaloside IV

1.2 實驗動物與模型建立

雄性昆明小鼠50只，體重20.00±2.00 g，實驗前適應(yīng)性飼養(yǎng)3～5 d，自由取食飲水。將小鼠隨機(jī)分為5組，每組10只。模型構(gòu)建參考本實驗之前的實驗方法[15]，具體如表1所示。

表1 糖尿病小鼠模型構(gòu)建方法Table 1 Construction method of diabetic mouse model

空白組每天給予普通飼料，同時，腹腔注射0.9%的生理鹽水。除空白組以外，模型組和保護(hù)組給予高脂高糖飼料喂養(yǎng)，同時，給予腹腔注射1.00 mg/kg氯化鎘，構(gòu)建糖尿病小鼠模型。每周檢測小鼠空腹血糖變化。處理8周后，當(dāng)模型組和保護(hù)組小鼠血糖≥11.10 mmol/L時，認(rèn)為模型構(gòu)建成功。

實驗用的高脂高糖飼料所用的配方為：普通飼料粉末40.00%～50.00%、脂肪（熟豬油）20.00%～25.00%、食用白砂糖20.00%、雞蛋8.00%～12.00%、食用鹽<5.00%。

模型構(gòu)建成功后，保護(hù)組胃飼不同劑量的黃芪甲苷，分別為低劑量組：20.00 mg/kg，中劑量組40.00 mg/kg，高劑量組60.00 mg/kg每日上午給藥1次，模型組和空白組均灌胃0.9%的生理鹽水，連續(xù)處理4周。

整個飼養(yǎng)過程中保持溫度、光照、濕度等環(huán)境條件平行，每日供應(yīng)飲食、飲水總量一致，末次處理前，禁食12 h，斷頸處死，取新鮮胰臟組織，生理鹽水沖洗干凈后，于-80 ℃冷凍保存，用于檢測鎘致糖尿病小鼠胰臟組織的指標(biāo)變化。

1.3 氧化損傷指標(biāo)測定

胰腺組織加入適量冷裂解液研磨勻漿，制備成10%的組織勻漿，3000 r/min低溫離心10 min后取上清液，蛋白測定采用考馬斯亮藍(lán)法、丙二醛（MDA）含量用硫代巴比妥酸法[6]測定、組織中的酶抗氧化劑活性SOD用聯(lián)苯三酚自氧化法[12]測定、用DTNB（5,5’-二硫代雙，2-硝基苯甲酸）法[14]測定還原型谷胱甘肽（GSH）的生成量。

1.4 胰臟超微結(jié)構(gòu)觀察

胰臟組織用戊二醇預(yù)固定后，用1%的鋨酸進(jìn)行后固定，常規(guī)乙醇和丙酮梯度脫水，環(huán)氧樹脂618浸透、包埋、聚合，半薄切片（厚度1 μm）定位，超薄切片（厚度50～70 nm），醋酸鈾和枸櫞酸鉛電子染色，Hitachi7500型透射電子顯微鏡觀察拍照。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)分析用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件，實驗數(shù)據(jù)以x±s表示。計量資料組間比較采用單因素方差分析。統(tǒng)計學(xué)上p<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 2型糖尿?。═2DM）小鼠模型的確認(rèn)

根據(jù)課題組之前的方法構(gòu)建糖尿病小鼠模型，如表2所示，鎘聯(lián)合高脂高糖處理8周，除空白組以外，其他四組的血糖均大于11.10 mmol/L，表明糖尿病小鼠模型構(gòu)建成功；給予黃芪甲苷4周處理后，結(jié)果表明不同劑量黃芪甲苷處理能夠顯著的降低小鼠血糖值（p<0.05，p<0.01），表明黃芪甲苷對糖尿病小鼠具有一定的保護(hù)作用。謝春英[16]研究了黃芪甲苷對高血糖小鼠的降血糖作用，結(jié)果顯示黃芪甲苷具有降血糖作用，這與本實驗結(jié)果一致。

表2 不同處理時長不同組別血糖值Table 2 Blood glucose levels for different treatment periods

2.2 黃芪甲苷對糖尿病小鼠胰臟氧化指標(biāo)的影響

MDA是ROS生成脂質(zhì)過氧化的終末產(chǎn)物，可加速生物膜損傷，其含量能間接反映膜系統(tǒng)受損程度和細(xì)胞受自由基攻擊的程度，被認(rèn)為是評估氧化應(yīng)激的良好標(biāo)記物[17]。如圖2所示，空白組MDA的含量為0.50 mmol/L protein，糖尿病小鼠MDA含量為空白組MDA含量的1.90倍，顯著高于空白組MDA的含量（p<0.01）。相比于糖尿病小鼠組，黃芪甲苷低劑量保護(hù)組、中劑量保護(hù)組、高劑量保護(hù)組MDA含量分別為糖尿病小鼠組MDA含量的82.10%（p<0.05），68.40%（p<0.01）、58.90%（p<0.01），呈劑量依賴型趨勢。鎘雖然不是氧化還原金屬元素，但是大量文獻(xiàn)報道鎘能夠加劇體內(nèi)的氧化應(yīng)激狀態(tài)，本研究結(jié)果表明，鎘誘導(dǎo)的糖尿病小鼠胰臟的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增強(qiáng)，MDA含量增多，導(dǎo)致細(xì)胞代謝紊亂，最終引起胰臟功能失調(diào)。攝入黃芪甲苷能夠減輕小鼠胰臟的脂質(zhì)過氧化程度，減少MDA的含量，保護(hù)胰臟免受自由基的損傷。李竹青[18]研究了黃芪甲苷對糖尿病大鼠早期腎臟損傷的保護(hù)作用，結(jié)果顯示不同劑量黃芪甲苷保護(hù)組MDA含量均顯著降低。說明了黃芪甲苷可以降低MDA的含量，緩解氧化損傷，從而起到保護(hù)作用。

圖2 黃芪甲苷對糖尿病小鼠MDA水平的影響Fig.2 Effects of astragaloside IV on MDA levels in diabetic mice

如圖3所示，空白組的SOD含量為1.12 U/mg protein，糖尿病小鼠組SOD含量僅為空白組的48.10%，顯著低于空白組（p<0.01）。與糖尿病組相比，黃芪甲苷保護(hù)組中SOD活性大大提升，其中，中劑量保護(hù)組、高劑量保護(hù)組SOD活性分別達(dá)到了糖尿病組的1.52倍（p<0.05）、1.72倍（p<0.01）。體內(nèi)SOD的活性對于維持機(jī)體氧化-還原的動態(tài)平衡至關(guān)重要，SOD活力的下降會導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的增強(qiáng)，結(jié)果表明，鎘誘導(dǎo)的糖尿病小鼠模型中，小鼠胰臟SOD活性下降，自由基過度產(chǎn)生，脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增強(qiáng)，從而損傷了胰臟，黃芪甲苷的保護(hù)，能夠緩解機(jī)體SOD水平的下降，提高胰臟的抗氧化能力，減少胰臟的損傷。韓冬等[19]研究黃芪甲苷對實驗性糖尿病大鼠肝臟組織的保護(hù)作用，發(fā)現(xiàn)中、高劑量黃芪保護(hù)組SOD活性均高于模型組。提示黃芪甲苷對實驗性糖尿病大鼠具有保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與其能有效改善肝臟組織抗氧化酶活性、降低氧化應(yīng)激損傷有關(guān)，與我們的研究結(jié)果一致，說明黃芪甲苷能夠緩解機(jī)體SOD水平的下降，提高機(jī)體抗氧化能力，緩解機(jī)體損傷。

圖3 黃芪甲苷對糖尿病小鼠SOD水平的影響Fig.3 Effects of astragaloside IV on SOD levels in diabetic mice

如圖4所示，糖尿病小鼠GSH含量低于空白組（p<0.05），僅為空白組的44.40%，黃芪甲苷保護(hù)組GSH的含量明顯高于糖尿病小鼠，呈劑量依賴趨勢，高劑量保護(hù)組的效果最明顯，為糖尿病小鼠組的2.00倍（p<0.01）。實驗表明，鎘在小鼠胰臟中聚集，導(dǎo)致大量自由基的產(chǎn)生，抑制了機(jī)體的抗氧化水平，導(dǎo)致氧化應(yīng)激損傷，GSH的含量作為衡量細(xì)胞氧化還原狀態(tài)的一個重要指標(biāo)，可以通過直接供H+拮抗氧自由基毒性，清除體內(nèi)的氧自由基，減少胰臟的氧化損傷[20]。

圖4 黃芪甲苷對糖尿病小鼠GSH水平的影響Fig.4 Effects of AstragalosideIV on GSH levels in diabetic mice

在機(jī)體正常的代謝過程中，氧化還原處于動態(tài)平衡。鎘暴露聯(lián)合高脂高糖處理誘導(dǎo)小鼠糖尿病發(fā)生，加劇了其氧化應(yīng)激反應(yīng)，產(chǎn)生大量氧氮自由基，攻擊脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA等大分子，產(chǎn)生MDA等脂質(zhì)過氧化物、蛋白質(zhì)羰基化產(chǎn)物（PCO）等，破壞細(xì)胞膜系統(tǒng)，損傷胰臟的抗氧化系統(tǒng)，破壞其正常的生理功能。SOD和GSH能夠清除自由基，減少對胰臟的損傷。黃芪甲苷是一種羊毛酯醇形的四環(huán)三萜皂苷，是黃芪藥材的主要有效成分之一。Cao等[21]報道黃芪甲苷可通過內(nèi)源性抗氧化劑清除活性氧。黃芪甲苷處理可降低MDA含量，提高谷胱甘肽過氧化物酶和SOD水平。Lv等[22]報道黃芪甲苷可以降低2型糖尿病小鼠肝臟中的糖原磷酸酶和葡萄糖-6-磷酸酶水平，降低血糖和甘油三酯水平，改善胰島素抵抗。因此，黃芪甲苷通過清除自由基，減少自由基對胰臟的損傷，同時通過改善胰島素抵抗，維持胰島素與胰高血糖素分泌的平衡，提高胰島素的分泌質(zhì)量，防止因血糖水平不穩(wěn)定而導(dǎo)致機(jī)體代謝紊亂，胰臟受到損傷而進(jìn)入惡性循環(huán)。

2.3 黃芪甲苷對糖尿病小鼠胰臟超微結(jié)構(gòu)的影響

如圖5所示，與空白組比，糖尿病小鼠組胰島細(xì)胞中的分泌顆粒體密度顯著減少、線粒體體密度也相應(yīng)減少，胞核及核內(nèi)染色質(zhì)幾乎完全溶解消失。與糖尿病小鼠組相比，黃芪甲苷組能夠顯著對抗鎘聯(lián)合高脂高糖所致胰島細(xì)胞的損害，分泌顆粒體密度、線粒體體密度明顯增高，表明鎘聯(lián)合高脂高糖對小鼠胰臟亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)造成了損傷，而黃芪甲苷的作用能夠在一定程度上緩解這種變化。黃芪甲苷可顯著提高實驗性糖尿病模型大鼠胰島素分泌水平、ISI，降低HOMA-IR，提示黃芪甲苷對實驗性糖尿病大鼠胰腺組織具有保護(hù)作用。肖徐陽[23]研究了黃芪甲苷對糖尿病小鼠肝臟、胰臟組織不同程度損傷的緩解作用，結(jié)果顯示，黃芪甲苷保護(hù)組小鼠肝臟、胰臟組織損傷均得到不同程度的緩解，說明黃芪甲苷能夠顯著改善糖尿病小鼠損傷。

圖5 黃芪甲苷對糖尿病小鼠胰臟保護(hù)作用研究Fig.5 Protective effect of astragaloside IV on pancreas of diabetic mice

3 結(jié)論

本研究實驗結(jié)果證實，糖尿病的發(fā)病機(jī)制與氧化應(yīng)激有著密切的聯(lián)系，黃芪甲苷可能是通過清除過量產(chǎn)生的自由基，減少氧化應(yīng)激對胰臟的損傷，從而起到一定的保護(hù)作用。但糖尿病的作用機(jī)制非常復(fù)雜，有待進(jìn)一步研究。