基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可視化及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證益腎補(bǔ)血中藥治療前列腺癌的作用機(jī)制研究?

劉 偉， 劉平安， 楊 磊， 郭 璇△， 李 媛， 唐旖雯， 劉德果

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，長(zhǎng)沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，長(zhǎng)沙 410000)

據(jù)世界衛(wèi)生組織(worldhealth organization，WHO)公布的流行病學(xué)最新數(shù)據(jù)顯示，前列腺癌(prostate cancer，PCa)發(fā)病率高居男性惡性腫瘤的第二位，病死率位居第三位，而多數(shù)患者發(fā)病年齡在55～80周歲之間[1]。在我國(guó)，2007年男性PCa的發(fā)病率為8.31/10萬(wàn)，至2017年其發(fā)病率上升至17.63/10萬(wàn)，10年間每年增長(zhǎng)幅度為21.22%[2]，提示中國(guó)該病的發(fā)病率正持續(xù)快速增長(zhǎng)，而中老年人群(55～80周歲)的年均增長(zhǎng)幅度高達(dá)26.38%[3]，但目前尚無(wú)確切有效的治療手段[4]。諸多研究表明，中醫(yī)藥在改善PCa患者具體癥狀、調(diào)控其精神心理狀態(tài)等方面具有明顯的療效[5]。胡楊等[6]研究表明，中藥可能是通過(guò)多靶點(diǎn)、多通路調(diào)控細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞凋亡治療惡性腫瘤，采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法可將中藥治療疾病的數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化分析。

中醫(yī)古籍并無(wú)本病的記載，但根據(jù)其臨床表現(xiàn)及病機(jī)屬于中醫(yī)學(xué)“癥瘕”“癃閉”“尿血”等范疇[6]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為PCa病在男性之精竅，與腎、脾、肝等臟密切相關(guān)。安婉麗[7]等借助關(guān)聯(lián)規(guī)則分析、復(fù)雜系統(tǒng)熵聚類分析等數(shù)據(jù)挖掘方法，對(duì)治療PCa的方劑進(jìn)行挖掘，其中益腎補(bǔ)血類藥物出現(xiàn)頻次占總藥物頻次的76%，其中尤以淫羊藿、三七、當(dāng)歸等藥物為最。淫羊藿可益精氣、補(bǔ)命門之火，為溫陽(yáng)補(bǔ)腎之要藥；三七可活血祛瘀、益氣通絡(luò)；當(dāng)歸可補(bǔ)血活血，三藥合用溫陽(yáng)活血、扶正祛邪，治療PCa符合《難經(jīng)·五十五難》：“積者，陰氣也”[9]，以及《素問(wèn)·調(diào)經(jīng)論》：“血?dú)庹?，喜溫而惡寒，寒則泣而不能流，溫則消而去之”對(duì)惡性腫瘤的論述。前期臨床研究表明，以益腎補(bǔ)血中藥為主要藥物的方劑，可有效抑制PCa進(jìn)展及轉(zhuǎn)移，但其具體作用機(jī)制尚未明確[10]。為明確益腎補(bǔ)血中藥治療PCa的生物學(xué)機(jī)制，本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法，對(duì)益腎補(bǔ)血中藥治療PCa的的生物學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)及藥效機(jī)制進(jìn)行預(yù)測(cè)，并借助細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，以期對(duì)益腎補(bǔ)血中藥治療PCa的科學(xué)內(nèi)涵進(jìn)行探討，同時(shí)為闡明益腎補(bǔ)血中藥治療PCa的具體機(jī)制提供新思路及新方法。

1 材料與方法

1.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)部分

1.1.1 篩選益腎補(bǔ)血中藥有效活性成分與藥物靶點(diǎn)基因 本研究借助中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)(TCMSP)(http://tcmspw.com/)及中醫(yī)藥綜合數(shù)據(jù)庫(kù)(TCMID)(http://www.megabionet.org/tcmid/)等檢索3味經(jīng)典益腎補(bǔ)血中藥(淫羊藿、三七、當(dāng)歸)的藥物有效活性成分與藥物靶點(diǎn)基因。TCMID數(shù)據(jù)庫(kù)作為備用數(shù)據(jù)庫(kù)，若藥物未收錄在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)時(shí)采用此數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行篩選[11]。篩選標(biāo)準(zhǔn)為OB>30%，DL>0.18，HL>4 h。之后選擇TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)的“Related Targets”模塊，得到上述藥物的所有藥物靶點(diǎn)基因。

1.1.2 獲取PCa疾病靶點(diǎn)基因 以“Prostate cancer”為關(guān)鍵詞，在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//www.genecards.org)以及在線人類孟德?tīng)栠z傳數(shù)據(jù)庫(kù)(OMIM)(https：//omim.org/)中進(jìn)行檢索。在完成關(guān)鍵詞檢索后將上述2個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)獲得的PCa相關(guān)基因進(jìn)行合并，剔除重復(fù)項(xiàng)后建立“PCa疾病靶點(diǎn)基因數(shù)據(jù)庫(kù)”備用。將上述藥物的靶點(diǎn)基因與PCa疾病靶點(diǎn)基因進(jìn)行映射，獲得益腎補(bǔ)血中藥治療PCa的靶點(diǎn)基因。

1.1.3 “藥物-疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 借助Cytoscape 3.6.1軟件將益腎補(bǔ)血中藥治療PCa的靶點(diǎn)基因和步驟1.1.2篩選獲得的藥物活性成分進(jìn)行映射，構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)；借助STRING平臺(tái)(https：//string-db.org)及CentiScape插件對(duì)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間的關(guān)系進(jìn)行分析，構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)，展示其中的關(guān)鍵靶基因。

1.1.4 基因功能注釋(gene ontology,GO) 和京都基因與基因組百科全書(shū)(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)富集分析 借助Enrichr數(shù)據(jù)庫(kù)，經(jīng)校正后P值(Adjusted P-value)<0.01、關(guān)聯(lián)度(Degree)>15的作用進(jìn)行GO富集分析及KEGG富集分析，進(jìn)而預(yù)測(cè)益腎補(bǔ)血中藥治療PCa的可能藥效機(jī)制。

1.2 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證部分

1.2.1 細(xì)胞系與細(xì)胞培養(yǎng) 人PCa LNCaP細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)(目錄號(hào)：TCHu173)。LNCaP細(xì)胞于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱環(huán)境中用含10%胎牛血清的McCoy's5A培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.2 藥物制備與給藥 本研究所使用的益腎補(bǔ)血中藥(淫羊藿、三七、當(dāng)歸)全部購(gòu)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房，均為道地藥材，按1∶1∶1的比例分別取15 g，將所有中藥加入10倍量的水煎煮2次，每次1.5 h。過(guò)濾，濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，按照生藥劑量使終末濃度為1.5 g/ml(1倍等效人體劑量)，調(diào)整pH7.2，過(guò)0.22 μm濾膜除菌，-20 ℃冰箱保存。實(shí)驗(yàn)前加入McCoy's5A培養(yǎng)基中，稀釋至所需要濃度。研究組將人PCa LNCaP細(xì)胞共設(shè)置4組，分別為模型組、中藥高劑量組、中藥中劑量組、中藥低劑量組，其中模型組為PCa LNCaP細(xì)胞給予等濃度的McCoy's5A培養(yǎng)基，中藥高、中、低劑量組分別為PCa LNCaP細(xì)胞給予3.0 g/ml/d(2倍等效人體劑量)、1.5 g/ml/d(1倍等效人體劑量)、0.75 g/ml/d(0.5倍等效人體劑量)的益腎補(bǔ)血中藥培養(yǎng)基。各組細(xì)胞均于干預(yù)72 h后進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.3 細(xì)胞增殖測(cè)定 利用Kit-8 細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑(cell counting kit-8，CCK8)[12]測(cè)定益腎補(bǔ)血中藥對(duì)LNCaP細(xì)胞增殖及活力的影響。具體步驟為：將LNCaP細(xì)胞懸浮于含10%胎牛血清的培養(yǎng)基中，接種于96孔板(2000細(xì)胞每孔)中，進(jìn)行培養(yǎng)24 h(37 ℃，5% CO2)后，加入10 μl不同濃度的益腎補(bǔ)血中藥培養(yǎng)基，同時(shí)添加10 μl CCK8溶液。孵育4 h后利用Spectra Max吸光度讀取器檢測(cè)在450 nm處的吸光度。

1.2.4 細(xì)胞周期測(cè)定(PI法[13]) 各組細(xì)胞在干預(yù)72 h后采集LNCaP細(xì)胞，以800 r/min離心5 min，采集沉淀物棄上清液，洗滌后加入預(yù)冷75%乙醇進(jìn)行固定，之后添加400 μl溴化乙錠(PI，50 μg/mL)，100 μl RNase A(100 μg/mL)，4 ℃避光孵育30 min。以標(biāo)準(zhǔn)程序用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，結(jié)果用細(xì)胞周期擬和軟件ModFit分析。

1.2.5 細(xì)胞凋亡測(cè)定(Annexin V&PI雙染色法[14]) 各組細(xì)胞在干預(yù)72 h后采集LNCaP細(xì)胞，洗滌后用100 ul的標(biāo)記溶液重懸細(xì)胞，室溫下避光孵育10～15 min。再次離心后取沉淀細(xì)胞加入熒光(SA-FLOUS)溶液4 ℃下孵育20 min，避光并不時(shí)振動(dòng)。以標(biāo)準(zhǔn)程序用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，結(jié)果用細(xì)胞周期擬和軟件ModFit分析。

1.2.6 Western blotting 從各組的人PCa LNCaP細(xì)胞中提取蛋白裂解物，利用放射免疫沉淀分析(radio immunoprecipitation assay,RIPA)蛋白裂解液進(jìn)行裂解、高速(12000 r/min)離心15 min,用移液器抽取上清液，以蛋白質(zhì)定量(bicinchoninic acid,BCA)法對(duì)蛋白濃度進(jìn)行測(cè)定。完成上樣步驟后進(jìn)行電泳(濃縮膠電壓設(shè)置80V，跑至分離膠時(shí)更換為120V，條帶進(jìn)行至尾部時(shí)停止)。5%胎牛血清白蛋白37 ℃封閉1.5 h，洗膜后滴加蛋白依賴性激酶-4(cyclin-dependent kinases-4,CDK4)、CDK6、BCL2-Associated X的蛋白質(zhì)(Bax)、B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(Bcl-2)以及間接靶點(diǎn)蛋白依賴性激酶-2(cyclin-dependent kinases-2,CDK2)、細(xì)胞周期蛋白D1(cycline D1)及細(xì)胞周期蛋白E1(cycline E1)，一抗4 ℃孵育過(guò)夜，二抗37 ℃孵育1.5 h最后顯影，顯影結(jié)果用Image Lab軟件進(jìn)行灰度值分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 益腎補(bǔ)血中藥治療PCa靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)結(jié)果

2.1.1 藥物篩選結(jié)果 表1示，獲取益腎補(bǔ)血中藥共374個(gè)化合物成分，其中淫羊藿130個(gè)，三七119個(gè)，當(dāng)歸125個(gè)。以O(shè)B>30%，DL>0.18，HL>4 h為條件進(jìn)行篩選，去重后共獲得24個(gè)益腎補(bǔ)血中藥主要活性成分。選取“Related Targets”模塊，獲得1620個(gè)淫羊藿、716個(gè)三七、865個(gè)當(dāng)歸的活性成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)基因，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道篩選后獲得益腎補(bǔ)血中藥藥物靶點(diǎn)共198個(gè)。

表1 益腎補(bǔ)血中藥的主要有效活性成分

2.2 PCa 疾病靶點(diǎn)基因獲取

圖1示，在GeneCards及OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)檢索關(guān)鍵詞“Prostate cancer”，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道共篩選出2829個(gè)PCa疾病靶點(diǎn)基因。將益腎補(bǔ)血中藥的藥物靶點(diǎn)基因與 PCa 疾病靶點(diǎn)基因進(jìn)行映射，共獲得148個(gè)益腎補(bǔ)血中藥治療PCa的靶點(diǎn)基因。

注：益腎補(bǔ)血中藥活性成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)基因與 PCa 相關(guān)基因有148個(gè)共同靶基因

2.3 “藥物-疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)與PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

圖2示，將益腎補(bǔ)血中藥與對(duì)應(yīng)活性成分(Ingredient_Drug)、活性成分與關(guān)鍵靶基因(Ingredient_Target)、關(guān)鍵靶基因與疾病靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)關(guān)系(Disease_Target)及屬性導(dǎo)入到Cytoscape，構(gòu)建“藥物-疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)。使用CentiScape插件計(jì)算藥物活性成分DC，節(jié)點(diǎn)的DC越大提示該節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中權(quán)重越大。其中Quercetin(槲皮素)為71，luteolin(木犀草素)為47，keampferol(山奈酚)為31，Anhydroicaritin(脫水淫羊藿素)為27，8-Isopentenyl-kaempferol為12，位于前五位，提示益腎補(bǔ)血中藥具有較顯著的抗氧化應(yīng)激、調(diào)控細(xì)胞周期、促進(jìn)細(xì)胞凋亡以及調(diào)節(jié)免疫功能作用，與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致[17，18]。

注：粉紅色菱形為疾病，黃色三角形為益腎補(bǔ)血中藥，紅色長(zhǎng)方形為益腎補(bǔ)血中藥活性成分，藍(lán)色橢圓形為關(guān)鍵靶基因，灰色連線代表各節(jié)點(diǎn)間相互關(guān)系

圖3示，基于PPI關(guān)系，研究構(gòu)建了益腎補(bǔ)血中藥潛在靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)，得到Degree≥50的蛋白有40個(gè)，包括AKT1、IL6、VEGFA、CASP3、JUN、EGFR、MAPK1、MYC、MAPK8、CDK2、Bax、ESR1、CCND1、MMP9、CXCL8、IL1B、FOS、CDK4、CCL2、MMP2、IL10、MAPK14、RELA、AR、BCL2(Bcl-2)、CASP8、CyclinD1、ICAM1、IL4、SERPINE1、STAT1、HMOX1、IL2、SPP1、CDKN1A、HIF1A、NOS3、KDR、MDM2、VCAM1。

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 GO生物過(guò)程與KEGG通路富集分析

圖4示，為更進(jìn)一步研究益腎補(bǔ)血中藥治療 PCa 的作用機(jī)制，筆者對(duì)前述步驟篩取的核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析。通過(guò)GO功能富集分析筆者共富集到包括“regulation of apoptotic process”“cyclin-dependent protein serine/threonine kinase regulator activity”“regulation of cell proliferation”在內(nèi)的涉及細(xì)胞周期、凋亡、增殖等生物學(xué)過(guò)程的114個(gè)GO條目，經(jīng)校正排序后對(duì)位于前20的生物過(guò)程進(jìn)行條形圖展示。

圖4 關(guān)鍵靶點(diǎn)基因GO功能富集分析

圖5示，基于KEGG富集結(jié)果，剔除重復(fù)數(shù)據(jù)及與 PCa 無(wú)關(guān)的信號(hào)通路，最終確定34條信號(hào)通路，經(jīng)校正排序后對(duì)位于前20的生物過(guò)程進(jìn)行條形圖展示。

圖5 關(guān)鍵靶點(diǎn)基因 KEGG通路富集分析

2.5 益腎補(bǔ)血中藥干預(yù)人PCa LNCaP細(xì)胞增殖、凋亡及周期情況

為進(jìn)一步評(píng)估益腎補(bǔ)血中藥對(duì)人PCa LNCaP細(xì)胞增殖、凋亡及周期的具體作用，筆者設(shè)置不同劑量的益腎補(bǔ)血中藥干預(yù)人PCa LNCaP細(xì)胞。藥物干預(yù)72 h后結(jié)果表明，益腎補(bǔ)血中藥能有效抑制人PCa LNCaP細(xì)胞的增殖并促進(jìn)PCa LNCaP細(xì)胞凋亡(圖6 A，B)。益腎補(bǔ)血中藥誘導(dǎo)的人PCa LNCaP細(xì)胞凋亡率(壞死細(xì)胞+凋亡細(xì)胞/細(xì)胞總數(shù))在不同劑量的培養(yǎng)下呈現(xiàn)累積趨勢(shì)，在益腎活血中藥分別處于低、中、高劑量時(shí)，分別為模型組LNCaP細(xì)胞凋亡(9.88%)的1.50倍(14.82%)、1.62倍(16.05%)以及2.18倍(21.56%)(P<0.01)(具體見(jiàn)圖6C、D)。同時(shí)隨著藥物濃度上升，LNCaP細(xì)胞周期阻滯及細(xì)胞凋亡高峰隨之上升，經(jīng)干預(yù)后各組LNCaP細(xì)胞的周期分布存在顯著差異(P<0.05)，在益腎活血中藥分別處于低、中、高劑量時(shí)，較模型組LNCaP細(xì)胞在G0/G1段分別增加11.63%、17.99%和26.32%，S段減少9.36%、12.80%、16.59%，G2/M段減少2.27%、5.19%、9.73%(具體見(jiàn)圖6E、F)。

注：A.各組PCa LNCaP細(xì)胞增殖情況；B.與模型組比較：*P<0.05；與中藥低劑量組比較：**P<0.05；與中藥中劑量組比較：***P<0.05；C.各組PCa LNCaP細(xì)胞凋亡情況；D.與模型組比較：*P<0.05；與中藥低劑量組比較：**P<0.05；與中藥中劑量組比較：***P<0.05；E.各組PCa LNCaP細(xì)胞周期測(cè)定；F.與模型組比較：*P<0.05；與中藥低劑量組比較：**P<0.05；與中藥中劑量組比較：***P<0.05

2.5 益腎補(bǔ)血中藥對(duì)人PCa LNCaP細(xì)胞增殖、凋亡及周期相關(guān)蛋白表達(dá)的抑制作用呈劑量依賴性

圖7示，為驗(yàn)證上述網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果，通過(guò)Western blot法對(duì)調(diào)控人PCa LNCaP細(xì)胞周期及凋亡相關(guān)蛋白進(jìn)行驗(yàn)證，包括細(xì)胞周期及凋亡直接靶點(diǎn)Bax、Bcl-2、CDK2、CDK4、CDK6、Cyclin D1及Cycline E1，筆者設(shè)置不同劑量的益腎補(bǔ)血中藥干預(yù)人 PCa LNCaP細(xì)胞72 h后，觀察調(diào)控人 PCa LNCaP細(xì)胞周期及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的動(dòng)態(tài)變化。結(jié)果提示，CDK2、CDK4、CDK6、Bax、Bcl-2、Cycline E1等蛋白隨益腎補(bǔ)血中藥劑量而出現(xiàn)不同程度的降低，但cycline D1蛋白呈相反趨勢(shì)改變，提示益腎補(bǔ)血中藥對(duì)人 PCa LNCaP細(xì)胞周期及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的抑制作用呈劑量依賴性。

注：A.Western blot結(jié)果；B.與模型組比較：*P<0.05；與中藥低劑量組比較：**P<0.05；與中藥中劑量組比較：***P<0.05

3 討論

現(xiàn)階段隨著對(duì)PCa的研究不斷取得進(jìn)展，其龐雜的發(fā)病及治療機(jī)制逐漸被揭示，PCa的發(fā)生機(jī)制主要包括腫瘤雄激素受體機(jī)制、干細(xì)胞形成機(jī)制、細(xì)胞周期調(diào)控以及炎性刺激相關(guān)機(jī)制等[15]。但在 PCa 的治療上，針對(duì)本病的靶點(diǎn)藥物仍處于探索階段，較長(zhǎng)時(shí)間的去勢(shì)治療易致本病轉(zhuǎn)化為激素非依賴性PCa，同時(shí)易出現(xiàn)各類臨床不良反應(yīng)且易復(fù)發(fā)[16]。中醫(yī)藥在改善PCa患者具體癥狀、調(diào)控其精神心理狀態(tài)等方面具有明顯的療效，運(yùn)用中藥治療PCa在某些方面具有一定優(yōu)勢(shì)[17，18]。然而，中藥存在多有效成分、多靶點(diǎn)的特征，各藥物活性成分間相互交集及作用形成了龐雜的相互作用網(wǎng)絡(luò)，所以給研究者探究其治療有效成分及相關(guān)機(jī)制造成了較大困難。

在本研究中，選取臨床治療PCa較常用3味藥物淫羊藿、三七、當(dāng)歸。何華瓊等[19]研究表明，淫羊藿能夠有效抑制PCa細(xì)胞增殖，其機(jī)制可能為淫羊藿可抑制雄激素受體信號(hào)通路中的雄激素受體(AR)磷酸化，同時(shí)促進(jìn)蛋白酪氨酸磷酸酶基因(PTEN)表達(dá)，將PCa細(xì)胞的增殖阻滯于S期。倪曉辰等[20]研究證實(shí)，三七總皂苷可顯著抑制PCa細(xì)胞增殖及遷移，同時(shí)可下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP2)、血管細(xì)胞黏附分子-1(VCAM-1)等因子表達(dá)。胡楊等[6]研究結(jié)果顯示，當(dāng)歸提取物可有效提升機(jī)體免疫力，抑制PCa細(xì)胞增殖，促進(jìn)PCa細(xì)胞凋亡，抑制其遷移等多方面起到抗腫瘤治療效果。借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，構(gòu)建益腎補(bǔ)血中藥治療PCa的“藥物-疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果顯示益腎補(bǔ)血中藥存在多有效成分、多靶點(diǎn)、多通路以及整體調(diào)控效應(yīng)，能夠介由調(diào)控細(xì)胞凋亡信號(hào)通路、P53信號(hào)通路、PI3K/Akt信號(hào)通路、腫瘤壞死(TNF)信號(hào)通路等發(fā)揮對(duì)PCa的治療效應(yīng)，而上述信號(hào)通路對(duì)調(diào)控細(xì)胞周期、凋亡有著重要作用，與GO富集分析結(jié)果一致。

正常的細(xì)胞均有一定的生命周期，而細(xì)胞凋亡是正常細(xì)胞出現(xiàn)程序性死亡的過(guò)程，其對(duì)生物的正常新陳代謝起到至關(guān)重要的作用，如果細(xì)胞周期及凋亡程序發(fā)生異常，將造成機(jī)體細(xì)胞新陳代謝紊亂，最終可能導(dǎo)致發(fā)生癌變[21]?；贙EGG通路富集分析結(jié)果表明，益腎補(bǔ)血中藥能夠介由多條信號(hào)通路調(diào)控細(xì)胞周期及其凋亡。其中細(xì)胞凋亡信號(hào)通路可激活腫瘤壞死因子α(TNFα)因子，經(jīng)端激酶(JUK)磷酸化后與游離的組織蛋白酶(Cathepsin)、Bcl-2或Bcl-xl特異性結(jié)合，從而抑制細(xì)胞凋亡；腫瘤壞死(TNF)信號(hào)通路又稱為腫瘤壞死信號(hào)通路，與PCa的發(fā)生發(fā)展有緊密關(guān)聯(lián)，其可經(jīng)由級(jí)聯(lián)反應(yīng)激活半胱天冬酶-8(Caspase-8)，Caspase-8又被稱為細(xì)胞生命周期的“開(kāi)關(guān)”，在細(xì)胞周期及凋亡中扮演著關(guān)鍵角色[22]；磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)通路AKT，可磷酸化細(xì)胞程序性死亡蛋白(Bad)，進(jìn)而抑制Bad結(jié)合Bcl-2最終抑制細(xì)胞凋亡。此外，其亦可經(jīng)由磷酸化P21及P27調(diào)節(jié)細(xì)胞周期Cyclin及CDK家族蛋白[23]；P53是PI3K/AKT信號(hào)通路的下游蛋白，其可調(diào)控Bax、Bcl-2等蛋白的表達(dá)并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，最終阻斷腫瘤的發(fā)生[24]。由上述可知，益腎補(bǔ)血中藥可通過(guò)多條通路對(duì)細(xì)胞周期及凋亡進(jìn)行調(diào)控，最終發(fā)揮對(duì)PCa的治療效應(yīng)。同時(shí)本研究結(jié)果表明，益腎補(bǔ)血中藥可促進(jìn)PCa LNCaP細(xì)胞在DNA合成前期(G1期)-DNA合成期(S期)細(xì)胞周期停滯，最終阻斷或減慢細(xì)胞LNCaP增殖，顯示出其在LNCaP細(xì)胞周期進(jìn)程中的抗增殖作用，但其具體機(jī)制仍需進(jìn)一步證實(shí)。

為進(jìn)一步明確益腎補(bǔ)血中藥治療PCa的關(guān)鍵靶點(diǎn)，筆者對(duì)獲得的有效成分-疾病靶點(diǎn)進(jìn)行PPI分析，得到Degree≥50的關(guān)鍵蛋白有40個(gè)，其中調(diào)控細(xì)胞周期及凋亡的蛋白，包括CDK2、CDK4、CDK6、Bax、Bcl-2、cycline D1及cycline E1等。CDK家族蛋白即細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶蛋白的簡(jiǎn)稱，Cyclin家族蛋白為細(xì)胞周期調(diào)控蛋白，其準(zhǔn)確調(diào)節(jié)著細(xì)胞周期，維持細(xì)胞更新?lián)Q代的正常運(yùn)行[21]。CDK可特異性結(jié)合cyclin產(chǎn)生異二聚體，形成cyclin-CDK聚合體，借助CDK的活化作用，發(fā)揮對(duì)不同細(xì)胞周期的推進(jìn)及轉(zhuǎn)化功能，而其中cycline D與cycline E家族蛋白作用恰恰相反[21，22]。如CyclinE-CDK2為生物細(xì)胞自G1期進(jìn)入S期不可替代的激酶聚合體，其經(jīng)由對(duì)下游眾多底物的磷酸化機(jī)制使細(xì)胞啟動(dòng)DNA合成程序，最終推進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入S期。本研究亦證實(shí)，益腎補(bǔ)血中藥可隨劑量增加下降人PCa LNCaP細(xì)胞中CDK2、CDK4、CDK6及Cycline E1的蛋白表達(dá)，cycline D1蛋白呈相反趨勢(shì)改變，與其調(diào)控細(xì)胞周期特性一致。Bcl-2蛋白對(duì)調(diào)控生物細(xì)胞凋亡至關(guān)重要，其通過(guò)改變細(xì)胞線粒體包膜的通過(guò)率進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞凋亡，一旦Bcl-2蛋白過(guò)度表達(dá)，激活細(xì)胞程序性死亡程序，同時(shí)拮抗抑癌基因最終阻斷細(xì)胞凋亡[25]。Chandrasekar等[26]研究結(jié)果顯示，PCa患者的腫瘤組織及癌旁組織中的Bcl-2蛋白及相關(guān)mRNA表達(dá)異常，同時(shí)伴隨疾病分期進(jìn)展其含量上升，Bcl-2調(diào)控的細(xì)胞凋亡機(jī)制在PCa發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色。Bax為Bcl-2蛋白家族里促進(jìn)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白，能夠使細(xì)胞內(nèi)線粒體包膜通透率改變，并促進(jìn)產(chǎn)生相關(guān)凋亡因子，造成腫瘤細(xì)胞凋亡[27]。現(xiàn)階段，已有學(xué)者在研究通過(guò)激活Bax途徑進(jìn)而治療腫瘤，其可能成為治療腫瘤重要的新靶點(diǎn)[28]。筆者在使用益腎補(bǔ)血中藥干預(yù)人PCa LNCaP細(xì)胞過(guò)程中，Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá)隨中藥劑量增加而下降，表明益腎補(bǔ)血中藥能夠促進(jìn)LNCaP細(xì)胞凋亡，從而治療PCa。結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果，益腎活血中藥的有效成分，能夠特異性作用在調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡及周期相關(guān)蛋白上。如益腎補(bǔ)血中藥的有效成分Quercetin(槲皮素)，在“藥物-疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的預(yù)測(cè)結(jié)果中，顯示Quercetin能夠和CDK2、CDK4、CDK6、Bax、Bcl-2、cycline D1及cycline E1等靶點(diǎn)存在關(guān)聯(lián)。同時(shí)喬慧敏等[29]研究結(jié)果顯示，Quercetin可明顯下調(diào)Bcl-2、CDK6、cycline D等蛋白抑制腫瘤細(xì)胞增殖，調(diào)控腫瘤細(xì)胞周期，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。luteolin(木犀草素)主要以糖苷的形式存在于多種中藥中，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果表明，其與cycline E、Bax等存在關(guān)聯(lián)。易均路等[30]研究證實(shí)，luteolin可顯著阻滯細(xì)胞周期抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。由此可見(jiàn)，益腎補(bǔ)血中藥中的有效成分能夠作用于調(diào)控細(xì)胞周期及凋亡的上游相關(guān)信號(hào)通路，某些有效成分甚至能夠直接作用于細(xì)胞周期及凋亡相關(guān)靶點(diǎn)，最終發(fā)揮抑制 PCa 細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)對(duì)益腎補(bǔ)血中藥治療PCa進(jìn)行初步研究，益腎補(bǔ)血中藥可有效抑制PCa進(jìn)展及轉(zhuǎn)移。但受中藥多有效成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)限制，其更進(jìn)一步的藥效機(jī)制仍需更進(jìn)一步的研究探討。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于系統(tǒng)生物學(xué)理論，通過(guò)虛擬計(jì)算、分子組學(xué)分析等研究方法，對(duì)“藥物-疾病-靶點(diǎn)”進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及機(jī)制整合，將中藥信息和知識(shí)進(jìn)行可視化，具備系統(tǒng)性及整體性的顯著特征，與中醫(yī)學(xué)的整體觀念以及辨證論治基本原則存在諸多類似之處[10]。本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)益腎補(bǔ)血中藥治療PCa的作用機(jī)制進(jìn)行預(yù)測(cè)，并借助細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，明確益腎補(bǔ)血中藥治療PCa具有多有效成分、多通路、多靶點(diǎn)協(xié)同作用機(jī)制的特點(diǎn)，其能夠經(jīng)由調(diào)控多條信號(hào)通路，調(diào)控腫瘤細(xì)胞周期及凋亡，這對(duì)逆轉(zhuǎn)PCa病理、防治PCa具有較重要的意義。