產(chǎn)油皮狀絲孢酵母突變株的轉(zhuǎn)錄組分析

許鵬飛, 呂育財(cái),2, 任立偉,2，ZHANG Yaoping, 龔大春,2

(1.三峽大學(xué) 生物與制藥學(xué)院 中國輕工業(yè)功能酵母重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 宜昌 443002; 2.三峽大學(xué) 湖北省生物酵素工程技術(shù)研究中心，湖北 宜昌 443002; 3. DOE-Great Lakes Bioenergy Research Center (GLBRC) University of Wisconsin-Madison, Madison WI 53706,USA)

皮狀絲孢酵母(Trichosporoncutaneum)是一種可以利用葡萄糖、木糖等碳源在胞內(nèi)積累油脂的產(chǎn)油微生物[1-2]，積累的油脂主要成分為甘油三酯(TAG)，其成分與棕櫚油、菜油相似，為C16和C18脂肪酸，可以作為生物柴油的原料[3]。由于微生物油脂產(chǎn)量不高，使得菌種選育成為微生物油脂研究的熱點(diǎn)。劉憲夫[4]利用乙基甲烷磺酸(EMS)誘變小球藻，使油脂產(chǎn)量提高了9.03%；郝冉等[5]利用紫外照射和氮離子注入技術(shù)處理深黃被孢霉，使γ-亞麻酸產(chǎn)量提高了60.27%。與傳統(tǒng)的紫外和化學(xué)誘變技術(shù)相比，常壓室溫等離子體(ARTP)作為一種新型的誘變手段被廣泛應(yīng)用于菌種選育[6-8]，劉冬等[9]通過ARTP誘變紅酵母，油脂產(chǎn)量由1.22 g/L提高到3.96 g/L；Cao等[10]利用ARTP誘變小球藻，誘變菌株的油脂產(chǎn)量提高了16.85%。以上誘變方法都是非理性的研究，要想對(duì)產(chǎn)油微生物進(jìn)行定向的育種還需了解產(chǎn)油途徑中關(guān)鍵基因及代謝途徑。

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序是一種可以了解特定細(xì)胞體內(nèi)RNA總和的技術(shù)，可以用來研究基因的轉(zhuǎn)錄情況和代謝調(diào)控規(guī)律，利用轉(zhuǎn)錄組分析可以探索突變菌株的基因差異表達(dá)情況及產(chǎn)油過程中起關(guān)鍵作用的酶[11-12]。

本研究以皮狀絲孢酵母為研究對(duì)象，利用ARTP對(duì)其進(jìn)行誘變處理，篩選得到油脂高產(chǎn)菌株，再利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)研究高產(chǎn)菌株和原始菌株的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)情況，篩選油脂積累的差異表達(dá)基因和差異表達(dá)酶，以期深入了解微生物油脂積累的基因表達(dá)和代謝調(diào)控，為進(jìn)一步的菌株分子改造提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株

本研究所用皮狀絲孢酵母Trichosporoncuraneum2.571(WT)，中國普通微生物菌種保藏管理中心；突變株A1由ARTP誘變篩選獲得[13]，保存于中國典型微生物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCC M 2018318。

1.2 ARTP誘變

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的皮狀絲孢酵母(WT)，先經(jīng)ARTP誘變處理，然后涂布到芝麻酚抗性平板上培養(yǎng)，挑選生長(zhǎng)旺盛的菌落進(jìn)行孔板培養(yǎng)，再利用尼羅紅熒光染色，選取高熒光強(qiáng)度的菌株，進(jìn)行搖瓶發(fā)酵。

1.3 發(fā)酵培養(yǎng)過程相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)

將兩菌株分別接種到搖瓶中培養(yǎng)，每天取樣檢測(cè)殘?zhí)恰⑸锪亢陀椭a(chǎn)量。

殘?zhí)堑暮浚豪枚趸畻钏?DNS)法[13]檢測(cè)培養(yǎng)基中的殘?zhí)恰?/p>

生物量的測(cè)定：取發(fā)酵液于烘干稱質(zhì)量的離心管中，8 000 r/min離心5 min，棄上清液后加適量去離子水重懸，離心去上清液后放入100 ℃烘箱中，烘干至恒質(zhì)量，計(jì)算生物量。

油脂產(chǎn)量的測(cè)定：將烘干的菌體1 g加入8 mL 8 moL/L的鹽酸，搖勻后室溫靜置1 h，再沸水浴10 min，冷卻后再沸水浴5 min。待溫度下降后，加入氯仿和甲醇溶液進(jìn)行多次萃取，將收集到的氯仿層蒸發(fā)除去氯仿，得到微生物油脂，再計(jì)算油脂的產(chǎn)量。

1.4 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及分析

1.4.1 樣品準(zhǔn)備

將WT和A1菌株劃線到Y(jié)PD平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)2 d，挑取單菌落接種到種子液培養(yǎng)18 h后進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)至第9 天時(shí)取樣，用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

1.4.2 總RNA提取和檢測(cè)

利用Total RNA Extractor (Trizol)試劑盒提取總RNA、Qubit2.0檢測(cè)RNA濃度、瓊脂糖凝膠檢測(cè)RNA完整性以及基因組污染情況。

1.4.3 cDNA文庫構(gòu)建和測(cè)序

使用VAHTSTMmRNA-seq V2 Library Prep Kit for Illumina?試劑盒進(jìn)行文庫構(gòu)建，采用Illumina HiseqTM進(jìn)行高通量測(cè)序，得到的原始圖像數(shù)據(jù)文件經(jīng)CASAVA堿基識(shí)別分析轉(zhuǎn)化為原始測(cè)序序列。文庫構(gòu)建及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序工作均委托上海生工公司完成。

1.4.4 基因功能注釋、分類

通過NCBI的核酸序列數(shù)據(jù)庫(NT)、非冗余蛋白序列數(shù)據(jù)庫(NR)、基因直系同源關(guān)系注釋系統(tǒng)(KOG)、注釋的蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(Swiss-Prot)、保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫(CDD)、基因本體論(GO)、京都基因和基因組百科全書(KEGG)來注釋樣品的基因[14]。

1.4.5 差異表達(dá)基因分析

先采用TMM對(duì)read count數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，之后用DEGseq進(jìn)行差異分析[15]。為了得到顯著差異的基因，將篩選條件設(shè)為：q值<0.05 且差異倍數(shù)(|log2FoldChange|)>2，來比較誘變菌株和原始菌株間的差異表達(dá)基因。對(duì)得到的差異表達(dá)的基因功能進(jìn)行GO富集和KEGG代謝通路富集，并挑選與脂肪酸積累相關(guān)的候選基因。

1.4.6 差異表達(dá)基因RT-PCR驗(yàn)證

挑選與油脂合成相關(guān)的上調(diào)基因，使用 Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)合適引物，利用UNIQ-10 柱式 Trizol 總RNA抽提試劑盒提取酵母總RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。再通過StepOne Plus型熒光定量PCR儀擴(kuò)增相應(yīng)基因。以actin為內(nèi)參基因，計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 誘變結(jié)果

ARTP誘變儀通過高純He產(chǎn)生活性粒子來作用于微生物，使微生物的基因和細(xì)胞膜發(fā)生改變，從而影響微生物的代謝過程。通過ARTP誘變處理皮狀絲孢酵母并通過高通量篩選，從誘變庫中篩選得到一株較原始菌株有較大提高的誘變菌株A1，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知：與原始菌株相比，菌株A1的生物量、油脂產(chǎn)量分別提高了41.7%、103.1%，油脂含量從39.3%提高到56.5%，誘變效果顯著?？梢夾RTP產(chǎn)生的活性粒子，能有效作用于酵母細(xì)胞基因，從而篩選出高產(chǎn)的突變菌株。

圖1 原始菌株(WT)與突變菌株(A1)油脂產(chǎn)量對(duì)比

2.2 發(fā)酵培養(yǎng)

兩菌株的搖瓶發(fā)酵結(jié)果如圖2所示。由圖2可知：當(dāng)?shù)孜锲咸烟菫?0 g/L時(shí)，菌株WT對(duì)葡萄糖的利用率遠(yuǎn)不如菌株A1，發(fā)酵72 h后菌株WT對(duì)葡萄糖的利用速率變得緩慢，而菌株A1一直處于快速消耗葡萄糖的狀態(tài)，直至葡萄糖耗盡。由于可以攝取更多的底物，所以菌株A1的生物量和油脂產(chǎn)量均比菌株WT的有了很大提高。

圖2 原始菌株(WT)與誘變菌株(A1)搖瓶發(fā)酵曲線

2.3 測(cè)序結(jié)果和質(zhì)量評(píng)估

對(duì)原始菌和誘變菌進(jìn)行Illumina測(cè)序，然后將得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，除去含有帶接頭的和低質(zhì)量的序列，結(jié)果見表1。由表1可知：最終原始菌和誘變菌的總讀數(shù)分別為4 402萬和4 807萬，就總讀數(shù)而言，誘變菌株比原始菌多出了400萬的讀取數(shù)量；兩株菌的Q30百分比分別為95.76%和95.59%；GC含量分別為62.01%和62.98%。由此可見，測(cè)序質(zhì)量較高，能滿足相應(yīng)要求。

表1 WT和A1基因測(cè)序數(shù)據(jù)

2.4 基因功能注釋

將轉(zhuǎn)錄本總共得到的基因與9個(gè)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，有79.13 %的基因至少被一個(gè)數(shù)據(jù)庫所注釋。在NR數(shù)據(jù)庫中，大多數(shù)注釋序列與Trichosporonoleaginosus和Yarrowialipolytica相近，相似序列分別有8 700、3 526個(gè)(圖3)?？梢姡?jīng)過誘變之后菌株的部分基因發(fā)生了改變，使其能夠大量積累胞內(nèi)油脂。

圖3 同源物種分類

2.5 差異基因分析

2.5.1 差異基因篩選

對(duì)轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行比較，初步將定義差異倍數(shù)為2倍以上并且q值≤0.005的基因，篩選為顯著差異表達(dá)基因，結(jié)果如表2所示。由表2可知：菌株A1與WT相比，兩個(gè)樣品出現(xiàn)差異表達(dá)基因共1 185個(gè)，其中，上調(diào)表達(dá) 767個(gè)、下調(diào)418個(gè)，上調(diào)的基因數(shù)明顯高于下調(diào)基因數(shù)。變化為2<差異倍數(shù)<4的基因?yàn)?94個(gè)，占58.57 %，差異倍數(shù)變化為4～6的基因占17.13 %，差異倍數(shù)變化為6～8和16～18的基因都占8%以上。

表2 顯著性差異基因表達(dá)上下調(diào)數(shù)量

2.5.2 差異基因GO富集分析

對(duì)兩個(gè)樣品的顯著差異基因進(jìn)行GO富集分析，可以把差異基因分類到分子功能、細(xì)胞組分、生物過程3個(gè)方面。本次研究通過對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO分析，得到了差異基因GO富集圖，結(jié)果見圖4。

圖4 差異表達(dá)基因的GO功能富集圖

由圖4可知：在挑選的富集最顯著的37個(gè)GO term中，在生物學(xué)過程分類時(shí)細(xì)胞過程(cellular process)顯著性基因數(shù)目最多，高達(dá)938個(gè)，其次為代謝過程(metabolic process)和單組織過程(single-organism process)；在細(xì)胞組分中細(xì)胞(cell)、細(xì)胞部分(cell part)的差異基因數(shù)達(dá)到1 150個(gè)，其次為細(xì)胞器(organelle)和膜部分(membrane part)；在分子功能中主要差異基因富集在催化活性(catalytic activity)和結(jié)合分子(binding)兩個(gè)類別中。從GO富集情況可以看出誘變菌株A1的細(xì)胞部分與原始菌株有較大差異，從而使菌體的生長(zhǎng)和細(xì)胞膜的通透性發(fā)生變化，進(jìn)而影響菌體的催化活性，最后使菌體的代謝過程出現(xiàn)差異，使誘變菌株A1能更多地積累油脂。

2.5.3 差異基因KEEG富集分析

對(duì)差異基因進(jìn)行KEEG富集分析可以更系統(tǒng)地了解差異基因產(chǎn)物的代謝途徑和差異基因產(chǎn)物的功能。圖5為差異基因的代謝通路富集情況，縱軸表示的是各通路(pathway)的信息，橫軸(rich factor)表示該通路中的差異基因數(shù)與注釋到該通路中的總基因數(shù)之比。q值的大小用點(diǎn)的顏色來表示，q值越小則顏色越接近紅色，每個(gè)功能下包含的差異基因的多少用點(diǎn)的大小來表示。當(dāng)rich factor值越大，q值顏色越接近紅色，表示富集越明顯。

圖5 差異表達(dá)基因KEGG代謝通路富集

由圖5可知：兩個(gè)樣品的差異基因KEGG代謝通路中顯著富集的通路有酵母細(xì)胞周期(cell cycle-yeast)、酵母MAPK信號(hào)通路(MAPK signaling pathway-yeast)、基因復(fù)制(DNA replication)、真核生物中的核糖體生物發(fā)生(ribosome biogenesis in eukaryotes)、色氨酸代謝(tryptophan metabolism)、戊糖和葡萄糖醛酸的相互轉(zhuǎn)化(pentose and glucuronate interconversions)、糖酵解/糖異生(glycolysis/gluconeogenesis)等。

在代謝途徑中，尋找與脂肪酸合成相關(guān)的上調(diào)差異基因，可為后期的分子育種和定點(diǎn)改造提供基礎(chǔ)。從差異表達(dá)的基因中選取了3個(gè)基因，結(jié)果如表3所示。

表3 顯著上調(diào)基因的功能和代謝通路

由表3可知：這些基因涉及三羧酸循環(huán)、糖酵解、甘油磷脂代謝、類固醇生物合成等；其中，在三羧酸循環(huán)中檸檬酸合成酶(CIS)相關(guān)基因過表達(dá)，CIS加強(qiáng)了乙酰-CoA和草酰乙酸的縮合反應(yīng)[16]，使產(chǎn)物檸檬酸的生成量增加[17]，檸檬酸通過穿梭作用可以到達(dá)細(xì)胞質(zhì)中，作為脂肪酸合成的原料。胡利華等[18]將CIS的基因?qū)攵i稻中，秈稻可以耐受低磷土壤并分泌大量檸檬酸。童晉[19]研究油菜中的CIS對(duì)脂肪酸合成的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，在植物的脂肪酸合成過程中，CIS是重要的調(diào)控酶，該酶表達(dá)量的上升會(huì)造成脂肪酸合成量的增加，這與本研究的結(jié)果相一致。

在糖酵解途徑中，3-磷酸甘油醛脫氫酶可以催化3-磷酸甘油醛氧化(脫氫)和磷酸化，生成1，3-二磷酸甘油酸，是糖代謝的中心環(huán)節(jié)，對(duì)糖代謝起著重要的作用[20-21]，因?yàn)楫a(chǎn)生的1，3-二磷酸甘油酸是糖酵解途徑中第一個(gè)產(chǎn)生ATP分子的底物，產(chǎn)生的ATP可以為后續(xù)反應(yīng)提供能量，Vigeolas等[22]在油菜中表達(dá)了酵母菌中3-磷酸甘油醛脫氫酶的基因，甘油-3-磷酸脫氫酶活性提高1倍，最終的脂肪含量增加40%。甘油磷酸二酯磷酸二酯酶(GDPD)是磷脂代謝中的關(guān)鍵酶，可將甘油磷酸二酯水解為3-磷酸甘油和一些肌醇、膽堿等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[23-24]。這將有利于酵母的生長(zhǎng)和發(fā)育。

2.5.4 差異表達(dá)基因的逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)驗(yàn)證

對(duì)上述的3個(gè)相關(guān)基因進(jìn)行RT-PCR驗(yàn)證，差異基因和內(nèi)參基因的引物設(shè)計(jì)及序列如表4所示。RT-PCR的結(jié)果如圖6所示。由圖6可知：由于TRINITY_DN8489_c0_g1基因的差異性較小，經(jīng)RT-PCR驗(yàn)證時(shí)出現(xiàn)較小差異，其他2個(gè)表達(dá)差異較大的基因，與反轉(zhuǎn)錄測(cè)序結(jié)果(表4)中基因的變化趨勢(shì)基本一致。

表4 RT-PCR驗(yàn)證基因及其引物

圖6 差異表達(dá)基因的RT-PCR 驗(yàn)證結(jié)果

3 結(jié)論

經(jīng)ARTP誘變處理的突變菌，在生物量、油脂產(chǎn)量分別提高了41.7%、103.1%，油脂含量達(dá)到了56.5%，通過對(duì)高產(chǎn)菌株進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，能進(jìn)一步幫助我們了解菌株的基因表達(dá)差異及代謝差異。

對(duì)菌株WT與A1進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序過濾后，篩選差異倍數(shù)為2倍以上并且q值≤0.001的基因?yàn)轱@著差異表達(dá)基因，菌株A1與WT相比，兩個(gè)樣品出現(xiàn)差異表達(dá)基因共1 185個(gè)，其中，上調(diào)表達(dá) 767個(gè)、下調(diào)418個(gè)，上調(diào)的基因數(shù)明顯高于下調(diào)基因數(shù)。對(duì)差異基因進(jìn)行GO富集分析，發(fā)現(xiàn)差異基因主要富集在細(xì)胞過程、代謝過程、細(xì)胞部分、催化活性；對(duì)差異基因進(jìn)行KEGG富集分析，發(fā)現(xiàn)差異基因主要富集在酵母細(xì)胞周期、基因復(fù)制、戊糖和葡萄糖醛酸的相互轉(zhuǎn)化、糖酵解/糖異生等。在代謝途徑中選取了3個(gè)與脂肪酸合成相關(guān)的上調(diào)基因及對(duì)應(yīng)的酶，RT-PCR驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)這些酶參與微生物的能量循環(huán)和甘油磷脂代謝，可為脂肪酸的合成提供足夠的底物(檸檬酸、草酰乙酸)和能量以及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，這將有助于油脂酵母積累更多的油脂。以上發(fā)現(xiàn)可為后續(xù)的油脂酵母分子育種和定點(diǎn)改造提供理論基礎(chǔ)。