固載離子液體修飾Fe3O4納米酶用于 H2O2和葡萄糖的檢測

楊培昕，喻昌木，楊 敏,，張 榮，湯陸揚(yáng)，付陽洋，彭黔榮,3,

（1.貴州大學(xué)藥學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，貴州 貴陽 550025；3.貴州中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，貴州 貴陽 550009）

近年來，人工模擬納米酶由于具有與天然辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）類似的過氧化物酶活性而被人們廣泛關(guān)注，與天然酶相比，人工模擬納米酶具有高催化活性、穩(wěn)定性好、成本低的優(yōu)勢[1-2]。 2007年，研究人員首次報道了Fe3O4磁性納米顆粒具有與天然過氧化物酶類似的過氧化物酶活性[3]。但是Fe3O4磁性納米顆粒容易聚集和氧化，改善Fe3O4納米酶一直是研究的熱點。有研究人員通過在Fe3O4表面官能化具有過氧化物酶活性的金磁微粒（Fe3O4@Au），從而提高復(fù)合納米顆粒的過氧化物酶樣活性[4]。HRP在含有水（體積分?jǐn)?shù)4.53%）的一種親水性離子液體（ionic liquid，IL） （[bmim][BF4]）中可增加其活性和穩(wěn)定性[5]。Walsh等[6]發(fā)現(xiàn)，在IL中可發(fā)生許多氧化還原反應(yīng)，使其修飾的材料具有成為高性能催化劑的潛質(zhì)。據(jù)了解，IL是一種由離子組成且常溫下呈液態(tài)的離子化合物。與傳統(tǒng)有機(jī)溶劑相比，IL具有熱穩(wěn)定性、可重復(fù)性、低毒性以及對金屬催化劑、有機(jī)物、無機(jī)物和氣體物質(zhì)的溶解性等性能[7-9]。 在生物催化過程中，IL可提供不同的溶劑環(huán)境，使生物酶的活性增大；在反應(yīng)過程中，IL和酶均可循環(huán)利用，提高酶的催化效率；并且其與部分有機(jī)溶劑互不相溶，可使酶催化產(chǎn)物易于分離[10-12]。在此構(gòu)建IL修飾的Fe3O4@SiO2磁性納米顆粒，在SiO2包覆的Fe3O4納米粒子表面接枝IL涂層，獲得SiO2固載IL修飾的磁性納米粒子Fe3O4@SiO2@IL，用于葡萄糖和H2O2的檢測。

葡萄糖氧化酶（glucose oxidase，GOD）在有氧條件下能專一性地催化葡萄糖氧化生成葡萄糖酸和H2O2[13]。檢測H2O2和葡萄糖的方法較多，比色傳感器具有操作簡單、快速、方便等特點，廣泛應(yīng)用于生物分析、環(huán)境檢測、食品檢測和醫(yī)療診斷等領(lǐng)域[14]。將Fe3O4@SiO2@IL與GOD耦合，F(xiàn)e3O4@SiO2@IL催化反應(yīng)產(chǎn)物H2O2與過氧化物酶底物3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺（3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine，TMB）形成藍(lán)色產(chǎn)物?；诖嗽?，構(gòu)建一種具有理想選擇性和較高靈敏度的簡便方法，以期為人工模擬納米酶在食品檢測中的應(yīng)用提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛奶 市購；GOD（98%） 北京百靈威科技有限公司；乙酸鈉、三水合物（分子C2H9NaO5）（優(yōu)級純，99.5%） 蘇州市麥克林醫(yī)療器械制品有限公司；3-氯丙基三乙氧基硅烷（98%） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；N-甲基咪唑（98%） 常州市中凱化工有限公司；正硅酸乙酯（tetraethyl orthosilicate，TEOS，分析純） 成都科龍化工試劑廠；TMB（98%）、FeCl3?6H2O、氯化鐵（II）（FeCl2?4H2O）、30% H2O2等均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-9000紫外-可見分光光度計 上海元析儀器有限公司；Nicolet iS50原位漫反射傅里葉變換紅外光譜儀 美國賽默飛世爾科技有限公司；S-3400N掃描電子顯微鏡 日本Hitachi公司；JEM-2100透射電子顯微鏡 日本電子公司。

1.3 方法

1.3.1 Fe3O4磁性納米顆粒的制備

Fe3O4磁性納米顆粒通過共沉淀法[15]制備。將FeCl3?6H2O（0.02 mol）和FeCl2?4H2O（0.01 mol）溶解在90 mL蒸餾水中，并將所得溶液在氮?dú)庀?00 ℃回流3 h。然后，將質(zhì)量分?jǐn)?shù)25%氨水溶液10 mL逐滴加入上述混合物中，并混合攪拌2 h。反應(yīng)完成后，將混合物冷卻至室溫，通過使用外部磁體簡單收集所得磁性納米顆粒，然后用蒸餾水徹底洗滌，烘干備用。

1.3.2 Fe3O4@SiO2磁性微球的制備

通過溶膠-凝膠法[16]，制備SiO2殼層。取上述合成的Fe3O4顆粒0.5 g，并均勻分散在乙醇（40 mL）、去離子水（10 mL）和1.5 mL濃氨水溶液（28%）的混合溶液中，并超聲處理1 h。在30 ℃條件下預(yù)攪拌15 min后滴加TEOS（0.4 mL），繼續(xù)攪拌6 h。收集所得微球，用乙醇和去離子水洗滌，45 ℃真空干燥12 h，得SiO2涂覆的磁性Fe3O4納米顆粒（Fe3O4@SiO2）。

1.3.3 Fe3O4@SiO2@IL磁性納米粒的制備

參考文獻(xiàn)[17]并進(jìn)行改進(jìn)，制備IL涂層。取3-氯丙基三乙氧基硅烷（2.408 g，10 mmol）和Fe3O4@SiO2（3 g）加入到80 mL無水甲苯中，在氮?dú)庀禄亓?2 h。冷卻至室溫，過濾，并用無水甲苯和無水乙醚洗滌2 次，除去未反應(yīng)的反應(yīng)物。然后80 ℃真空干燥6 h得到中間體Fe3O4@SiO2@(CH2)3Cl。將N-甲基咪唑（10 mmol）和Fe3O4@SiO2@(CH2)3Cl（1 g）加入到50 mL無水甲苯溶液中，并將混合物回流12 h。過濾生成的產(chǎn)物，并用無水乙醚洗滌以除去過量的IL，干燥，所得固體即Fe3O4@SiO2@IL。

1.3.4 材料的表征

將微量固體磁性材料溶于適量的蒸餾水，超聲振蕩使其均勻分散。利用掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡觀察材料形貌。將合成的干燥納米粒子粉末與KBr混合，充分研磨后壓片，利用原位漫反射傅里葉變換紅外光譜儀分析材料結(jié)構(gòu)。

1.3.5 Fe3O4@SiO2@IL過氧化物酶活性分析及條件優(yōu)化

通過測定H2O2存在下過氧化物酶底物TMB的催化氧化能力，可以估算Fe3O4@SiO2@IL納米材料的過氧化物酶活性。實驗如下：將Fe3O4@SiO2@IL（300 μL，0.4 mg/mL）、H2O2（300 μL，80 mmol/L）和NaAc緩沖溶液（300 μL，50 mmol/L，pH 3）以及TMB（300 μL，8 mmol/L）混合均勻后在40 ℃下孵育20 min。然后記錄在波長652 nm處（TMB的特征峰）的紫外-可見吸收。類似地，根據(jù)相同步驟研究不同pH值的NaAc緩沖溶液（pH 2～9）、孵育溫度（20～80 ℃）、孵育時間（0～20 min）和催化劑質(zhì)量濃度為0～0.5 mg/mL范圍內(nèi)Fe3O4@SiO2@IL過氧化物酶活性的變化。

1.3.6 動力學(xué)分析

首先，保持TMB濃度恒定并改變H2O2濃度（0.1～1.0 mmol/L），加入乙酸鈉緩沖液（300 μL，50 mmol/L，pH 3）和Fe3O4@SiO2@IL（300 μL， 0.4 mg/mL）制成不同濃度的混合溶液，并在50 ℃下孵育20 min后，通過紫外-可見光分光光度計在波長652 nm處測定混合物的吸光度。類似地，通過在相同條件下保持H2O2濃度恒定并改變TMB濃度（0.1～1.0 mmol/L），研究以H2O2為底物的動力學(xué)分析。

通過從Michaelis-Menten方程導(dǎo)出的Lineweaver-Burk圖以計算酶動力學(xué)參數(shù)：1/V=Km/Vmax（1/[S]+1/Km）；其中，V為反應(yīng)的初始速率/（mol/（L·s））；Vmax為最大反應(yīng)速率/（mol/（L·s））；[S]為底物的濃度/（mol/L）；Km可近似代表酶對底物的親和，Km值一般在10－6～ 10－2mol/L范圍內(nèi)。

在此，根據(jù)Lambert-Beer定律（A=k×b×c）對Ox-TMB濃度進(jìn)行定量。其中，A為吸光度；b為溶液厚度/cm；c為Ox-TMB的濃度/（mol/L）；k為摩爾吸光系數(shù)，通常為39 000/（L/（mol?cm））[18-20]。

1.3.7 H2O2和葡萄糖的檢測

1.3.7.1 H2O2的檢測

將TMB（300 μL，8.0 mmol/L）、Fe3O4@SiO2@IL 儲備溶液（300 μL，0.4 mg/mL）和不同濃度的H2O2溶液（0.001～1 mmol/L）加入到2 mL乙酸鹽緩沖液（pH 3.0，50 mmol/L）中，然后將混合溶液在40 ℃溫育20 min后通過紫外分光光度計測量在波長652 nm處吸光度的變化。

1.3.7.2 葡萄糖的檢測

將GOD（0.2 mL，1.0 mg/mL）、1.0 mL不同濃度的葡萄糖（0.02～0.2 mmol/L）加入到1 mL磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）中混合，并在37 ℃溫育30 min；之后，將Fe3O4@SiO2@IL（300 μL，0.4 mg/mL）、TMB（300 μL，8 mmol/L）和乙酸鹽緩沖液（2 mL，50 mmol/L，pH 3）添加至上述葡萄糖反應(yīng)溶液中，并在40 ℃下溫育20 min。最后在紫外分光光度計下測量其在波長652 nm處的吸光度變化。為了測試葡萄糖檢測的選擇性，選擇蔗糖、果糖、乳糖、麥芽糖進(jìn)行對照實驗，對照樣品的濃度高于葡萄糖的濃度（約5 倍）。

1.3.7.3 實際樣品的檢測

建立的檢測方法用于牛奶中H2O2的檢測。樣品的預(yù)處理：首先向25 mL牛奶樣品中添加1%（體積分?jǐn)?shù)）三氯乙酸25 mL，并超聲處理20 min去除牛奶樣品中的蛋白質(zhì)；然后以12 000 r/min離心10 min，將上清液通過0.22 μm膜過濾，除去脂質(zhì)；通過向該上清液中添加不同濃度的H2O2儲備溶液，制備不同濃度的H2O2牛奶樣品。取不同濃度的牛奶樣品100 μL分別加入300 μL Fe3O4@SiO2@IL懸浮液（0.4 mg/mL）和300 μL TMB （8.0 mmol/L），加入到2 mL乙酸鹽緩沖液（pH 3.0，50 mmol/L）中，然后在40 ℃溫育20 min。根據(jù)上述1.3.7.1節(jié)方法測量吸光度的變化，重復(fù)3 次，考察檢測體系的加標(biāo)回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 材料的表征

采用共沉淀法制備Fe3O4納米顆粒，然后以TEOS為硅源制備SiO2殼層，目的是提高納米材料的分散性，并且保護(hù)磁鐵礦芯在使用過程中不被腐蝕和氧化[16]。 加入3-氯丙基三乙氧基硅烷，經(jīng)回流改性與硅膠層形成Si—O—Si鍵，從而表面接枝帶上氯丙基，獲得中間體Fe3O4@SiO2@(CH2)3Cl[21-22]。最后通過N-甲基咪唑與修飾在硅膠殼上的氯丙基反應(yīng)，形成了帶N-甲基咪唑氯鎓的固定化IL。IL由于相同電荷之間的排斥作用，能夠有效減少聚集，增強(qiáng)穩(wěn)定性。如圖1所示，將裸露的Fe3O4磁性納米顆粒溶于水中，大部分顆粒聚集在底部，分散性差；而IL修飾后的Fe3O4磁性納米顆粒（Fe3O4@SiO2@IL）在水溶液中呈現(xiàn)出較好的分散性和順磁性，使其可以很容易地從反應(yīng)介質(zhì)中分離出來，增強(qiáng)重復(fù)利用性。

圖1 Fe3O4@SiO2@IL的合成原理示意圖Fig. 1 Schematic diagram for the synthesis principle of Fe3O4@SiO2@IL

如圖2、3所示，在Fe3O4的光譜中可以看到O—H在3 100～3 500 cm－1附近的伸縮振動和Fe—O在575 cm－1附近的伸縮振動（a譜）。出現(xiàn)在1 090 cm－1處的寬吸收峰是Si—O—Si拉伸振動的特征峰（b譜），表明形成了SiO2殼層。1 584 cm－1處的峰可歸因于雙鍵咪唑環(huán)的C＝N 拉伸（c譜），表明IL已成功地修飾在Fe3O4@SiO2上。從圖3A可以看出，F(xiàn)e3O4納米顆粒呈顆粒狀聚集體的簇狀結(jié)構(gòu)，經(jīng)SiO2殼層涂覆后形成較為分散的顆粒狀 （圖3B）。相較于圖3A、B，IL修飾后的納米材料形貌發(fā)生了變化，大多數(shù)表現(xiàn)為表面光滑的球狀結(jié)構(gòu)（圖3C），說明Fe3O4納米顆?？赡芘cIL發(fā)生了某種特定的相互作用。使用透射電鏡進(jìn)行更詳細(xì)的觀察，如圖3D所示，證實本實驗制備的Fe3O4@SiO2@IL為均一的球形，且直徑約為20 nm。

圖2 傅里葉變換紅外光譜圖Fig. 2 FT-IR spectra of Fe3O4, Fe3O4@SiO2 and Fe3O4@SiO2@IL

圖3 Fe3O4（A）、Fe3O4@SiO2（B）和Fe3O4@SiO2@IL（C）的掃描電鏡和Fe3O4@SiO2@IL的透射電鏡（D）圖Fig. 3 SEM images of Fe3O4 (A), Fe3O4@SiO2 (B) and Fe3O4@SiO2@IL (C) and TEM image of Fe3O4@SiO2@IL (D)

2.2 Fe3O4@SiO2@IL類過氧化物酶活性分析

為了研究在H2O2和底物TMB存在下Fe3O4@SiO2@IL的過氧化物酶樣活性，比較有無H2O2和TMB時的比色反應(yīng)。如圖4所示，在對照組實驗中，缺少H2O2或TMB時，曲線1和曲線2無明顯的紫外吸收。而TMB與H2O2存在下，在波長652 nm處出現(xiàn)了一個明顯的吸收峰（曲線3）。這是由于Fe3O4@SiO2@IL在H2O2存在下能氧化TMB，使溶液變藍(lán)（如插圖所示），并在波長652 nm處產(chǎn)生特定的吸收峰。實驗表明，制備的Fe3O4@SiO2@IL具有較好的類過氧化物酶活性。

圖4 不同反應(yīng)體系溶液的紫外-可見光吸收圖譜Fig. 4 UV-Vis absorption spectra of different reaction system solutions

另外，類似于天然過氧化物酶HRP，基于納米材料的過氧化物酶模擬物的酶活性受pH值和溫度等條件影響。在緩沖溶液pH 2～9、孵育溫度20～80 ℃的范圍內(nèi)研究酸度和溫度對體系中顯色產(chǎn)物吸光度的影響，結(jié)果顯示pH 3、孵育溫度40 ℃時達(dá)到最佳催化活性 （圖5A、B）。接著研究Fe3O4@SiO2@IL質(zhì)量濃度對體系中顯色產(chǎn)物吸光度的影響，如圖5C所示，在Fe3O4@SiO2@IL質(zhì)量濃度為0～0.5 mg/mL范圍內(nèi)，顯色產(chǎn)物吸光度隨Fe3O4@SiO2@IL質(zhì)量濃度增加而增加，當(dāng)Fe3O4@SiO2@IL質(zhì)量濃度達(dá)到0.4 mg/mL時，逐漸趨于平衡。同理，如圖5D、E所示，在H2O2濃度為10～100 mmol/L和TMB濃度為1～10 mmol/L范圍內(nèi)，濃度增加其催化活性也隨之增加，當(dāng)H2O2濃度達(dá)到80 mmol/L或TMB濃度達(dá)到8.0 mmol/L時，F(xiàn)e3O4@SiO2@IL催化活性趨于平衡，并且選擇最佳孵育時間為20 min（圖5F）。根據(jù)優(yōu)化結(jié)果，選擇Fe3O4@SiO2@IL 0.4 mg/mL、H2O280 mmol/L和TMB 8 mmol/L進(jìn)行后續(xù)實驗。

圖5 pH值（A）、孵育溫度（B）、Fe3O4@SiO2@IL質(zhì)量濃度（C）、H2O2（D）、TMB（E）以及孵育時間（F）對酶活性的影響Fig. 5 Effects of pH (A), temperature (B), concentrations of Fe3O4@SiO2@IL (C), H2O2 (D), TMB (E) and incubation time (F) on peroxidase mimic activity

2.3 Fe3O4@SiO2@IL的穩(wěn)態(tài)動力學(xué)分析

通過改變一種底物的濃度，同時保持另一種底物的濃度不變，測定一系列的動力學(xué)數(shù)據(jù)，研究催化機(jī)理，獲得相應(yīng)的動力學(xué)參數(shù)。如圖6所示，在合適的TMB和H2O2濃度范圍內(nèi)觀察到與酶促反應(yīng)相似的典型Michaelis-Menten行為。由雙倒數(shù)Lineweaver-Burk方程可得到最大初速度（Vmax）和Michaelis-Menten常數(shù)（Km）等基本參數(shù)：1/V=Km/Vmax（1/[s]+1/Km）。通過計算15 min內(nèi)波長652 nm處吸光度變化斜率，得到表觀反應(yīng)速率，如表1所示。Km值通常被認(rèn)為是酶與特定底物親和力的指標(biāo)。Km值越小，說明酶與底物的親和力越強(qiáng)，所研究催化劑的效率越高。由表1可以看出，以TMB（0.107 mmol/L）和H2O2（0.245 mmol/L）為底物的Fe3O4@SiO2@IL的Km值遠(yuǎn)低于HRP（0.434 mmol/L和3.700 mmol/L），說明Fe3O4@SiO2@IL對TMB和H2O2的親和力遠(yuǎn)高于HRP。另一方面，在不同固定TMB濃度下，TMB對H2O2的氧化反應(yīng)雙倒數(shù)曲線呈一組線性平行線（圖6C、D），這是典型的乒乓機(jī)制[23-24]。與其他具有過氧化物酶活性的納米材料相比，F(xiàn)e3O4@SiO2@IL的Km值均具有較大優(yōu)勢，這進(jìn)一步證實了IL修飾的Fe3O4納米顆粒與比色底物TMB和H2O2具有較好的親和性。

圖6 Fe3O4@SiO2@IL的穩(wěn)態(tài)動力學(xué)圖Fig. 6 Steady-state kinetics of Fe3O4@SiO2@IL

表1 Fe3O4@SiO2@IL納米材料與其他納米酶和HRP的Km和 Vmax參數(shù)的比較Table 1 Km and Vmax values of Fe3O4@SiO2@IL nanomaterials, other nanozymes and HRP

2.4 H2O2和葡萄糖的檢測

體系中Fe3O4@SiO2@IL表現(xiàn)出過氧化物酶活性，能夠有效催化H2O2氧化TMB發(fā)生顯色反應(yīng)。TMB的顯色程度與H2O2濃度呈正比。因此，考察紫外吸收光譜652 nm（TMB的特征峰）處的吸光度可有效檢測H2O2?；诖?，通過結(jié)合GOD與葡萄糖反應(yīng)生成H2O2的原理，可間接檢測葡萄糖。原理如圖7所示，GOD在有氧條件下作用于葡萄糖生成葡萄糖醛酸，同時產(chǎn)生H2O2。Fe3O4@SiO2@IL與產(chǎn)物H2O2反應(yīng)生成H2O和O2，然后與第2底物TMB反應(yīng)生成藍(lán)色產(chǎn)物TMBox[23]。

圖7 葡萄糖比色測定原理圖Fig. 7 Schematic diagram for the colorimetric determination of glucose

由圖8A可知，體系在波長652 nm處（TMB的特征峰）的吸光度隨H2O2濃度的增加而增大，然后趨于平衡。同源線性校準(zhǔn)曲線（圖8B）表現(xiàn)出在最佳條件下，吸光度與H2O2濃度在4～100 μmol/L范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，其線性方程為y=0.049 57+0.938 17x，相關(guān)系數(shù)為 0.996 49。檢出限（limit of detection，LOD）為 0.698 μmol/L。其中LOD的精確度（相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD））為0.304%（n=5）。與其他過氧化物酶模擬物相比（表2），F(xiàn)e3O4@SiO2@IL具有更寬的線性檢測范圍和更低的LOD。

圖8 H2O2濃度與吸光度的劑量-響應(yīng)曲線（A）及同源性 校準(zhǔn)曲線（B）Fig. 8 Plot of H2O2 concentration versus absorbance (A) and calibration curve (B)

表2 檢測H2O2材料的性能比較Table 2 Performance comparison of various materials for detecting H2O2

如圖9所示，在0.008～0.2 mmol/L范圍內(nèi)，吸光度與葡萄糖濃度呈良好的線性關(guān)系。LOD為2.39 μmol/L，與先前報道的其他過氧化物酶模擬物相比（表3），F(xiàn)e3O4@SiO2@IL具有較低的葡萄糖LOD。

表3 檢測葡萄糖納米材料的性能比較Table 3 Performance comparison of various nanomaterials for glucose detection

圖9 葡萄糖檢測的劑量-響應(yīng)曲線（A）和葡萄糖濃度變化的 紫外吸收光譜圖（B）Fig. 9 Plot of glucose concentration versus absorbance (A) and UV-Vis spectra of varying glucose concentrations (B)

2.5 Fe3O4@SiO2@IL的干擾性

為了進(jìn)一步研究該方法的特異性，選擇空白樣品、蔗糖、果糖、乳糖和麥芽糖進(jìn)行對照實驗。如圖10所示，即使對照樣品的濃度是葡萄糖濃度的5 倍，含葡萄糖樣品的吸光度也遠(yuǎn)高于對照樣品。此外，蔗糖、果糖、乳糖和麥芽糖樣品中，肉眼可觀察到葡萄糖樣品的藍(lán)色變化（插圖）。結(jié)果表明，該比色法反應(yīng)體系對葡萄糖具有較高的選擇性。

圖10 葡萄糖的選擇性檢測（n=3）Fig. 10 Selectivity for glucose detection (n= 3)

2.6 Fe3O4@SiO2@IL的穩(wěn)定性

連續(xù)7 d測量Fe3O4@SiO2@IL納米材料吸光度的變化，評估其長期貯存穩(wěn)定性。如圖11所示，F(xiàn)e3O4@SiO2@IL在一周內(nèi)具有較好穩(wěn)定性，表明Fe3O4@SiO2@IL具有良好的長期貯存穩(wěn)定性。

圖11 Fe3O4@SiO2@IL的穩(wěn)定性（n=3）Fig. 11 Stability of Fe3O4@SiO2@IL (n = 3)

2.7 實際樣品的檢測

H2O2通常被用作生乳中的保鮮劑，但是，過量添加H2O2不僅會降低牛奶的營養(yǎng)價值，還會導(dǎo)致胃腸道疾病，因此，檢測牛奶中H2O2的含量具有重要意義。基于Fe3O4@SiO2@IL的過氧化物酶樣活性比色傳感器檢測牛奶中的H2O2，結(jié)果如表4所示，測定牛奶樣品中H2O2的回收率為94.0%～107.8%，RSD為2.24%～3.12%。表明Fe3O4@SiO2@IL納米材料可以有效用于牛奶中H2O2的測定，并且具有較高的準(zhǔn)確度和精密度，在實際樣品分析中具有潛在的應(yīng)用價值。

表4 牛奶樣品中H2O2的測定Table 4 Recoveries of H2O2 in spiked milk samples

3 結(jié) 論

采用共沉淀法制備Fe3O4納米顆粒并添加SiO2殼層，然后將3-氯丙基三乙氧基硅烷接枝在Fe3O4@SiO2納米顆粒上并與N-甲基咪唑進(jìn)一步反應(yīng)，合成具有IL涂層的Fe3O4磁性納米顆粒。研究證明，F(xiàn)e3O4@SiO2@IL有效改善了Fe3O4磁性納米顆粒的聚集。在優(yōu)化條件下，F(xiàn)e3O4@SiO2@IL表現(xiàn)出較好的過氧化物酶樣活性和對底物TMB和H2O2的親和性，在H2O2存在下可催化過氧化物酶底物TMB氧化產(chǎn)生藍(lán)色反應(yīng)?；贔e3O4@SiO2@IL 的過氧化物酶性質(zhì)，開發(fā)一個簡單而靈敏的葡萄糖和H2O2檢測平臺，用于牛奶中H2O2的檢測，加標(biāo)回收率為94.0%～107.8%。Fe3O4@SiO2@IL具有構(gòu)建低成本和簡單生物傳感器的巨大潛力，并為人工模擬酶應(yīng)用于食品檢測提供了參考。