基于高通量測序分析感染菌核病和健康桑果 內(nèi)生菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性

彭芳芳，魏召新，李勛蘭，羅友進，韓國輝

（重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所，重慶 401329）

植物內(nèi)生菌是植物微生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，能夠和植物本身和諧共處。研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生菌感染植物宿主后，植物一般具有生長快速、抗逆境、抗病害等優(yōu)勢，比未感染內(nèi)生菌的植株更具生存競爭力[1]。隨著科學(xué)研究的不斷深入，植物內(nèi)生菌在生物防治以及生理生態(tài)方面的作用逐漸被挖掘，成為國內(nèi)外農(nóng)業(yè)、食品等領(lǐng)域的研究重點。一般果樹內(nèi)生菌主要集中于果樹的根、莖、葉、花、果實等組織器官中，能夠為宿主提供保護，產(chǎn)生諸如生物堿、水解酶、抗生素類物質(zhì)或其他代謝產(chǎn)物[2]，誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性，達到消滅病原菌或與之形成競爭的關(guān)系，直接或間接提高果樹免疫能力，起到生物防護的作用。

桑果作為一種食藥兼用的特色水果，因其特殊的物質(zhì)成分及保健功能[3-4]，越來越受到研究者重視和消費者歡迎。菌核病是桑果產(chǎn)業(yè)發(fā)展中危害最為嚴重的病害，主要危害果實，具有發(fā)病快、范圍廣等特點，其病原主要有桑實杯盤菌（Ciboria shiraiana）、肉阜狀杯盤菌（Ciboria carunculoides）、核地杖菌（Scleromitrula shiraiana）和核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）4 種[5]。目前，生產(chǎn)中對桑果菌核病的防治以化學(xué)農(nóng)藥防治為主[6]， 其過量使用會導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生耐藥性[7]，而且?guī)淼霓r(nóng)藥殘留以及環(huán)境污染，給桑果的綠色安全生產(chǎn)帶來很大的威脅和風(fēng)險。因此，亟需尋找安全、高效、環(huán)境友好的菌核病防治新方法，而具有抗菌特性的內(nèi)生菌可作為桑果菌核病生物防治的有效選擇。“以菌治菌”的生防菌制劑，不僅生防能力突出，而且可促進種子萌發(fā)、植物生長，具備一系列在合成非核糖體肽以及核糖體依賴性的tasA和細菌素中起作用的基因簇，并且這些基因簇與抗菌代謝物質(zhì)的形成有關(guān)[8-11]。我國利用桑樹內(nèi)生菌進行病害生物防治的基礎(chǔ)研究起步較晚，雖在研究方法和思路上已有一定的積累，但仍存在大量尚待研究的內(nèi)生菌及其代謝產(chǎn)物。對于內(nèi)生菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性的研究，傳統(tǒng)的平板分離法并不能真正反映內(nèi)生菌群落特征[12-13]。 高通量測序技術(shù)為微生物多樣性研究提供了更加可靠的技術(shù)支撐，目前已廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、工業(yè)、醫(yī)療、食品等領(lǐng)域[14]。此外，外部環(huán)境條件已被證實是影響微生物種群密度和生態(tài)的重要因素[15-17]，熊大維等[18]研究表明，臍橙感黃龍病植株和健康植株葉片內(nèi)生菌有著明顯差異，黃龍病菌的存在改變了臍橙葉片原有內(nèi)生細菌的群落結(jié)構(gòu)，內(nèi)生菌數(shù)量及多樣性均發(fā)生明顯變化。因此，本研究采用Illumina MiSeq二代測序技術(shù)，分析感菌核病和健康桑果的內(nèi)生菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性變化，探討伴生菌與菌核病病原菌的互作關(guān)系，旨在為建立桑果微生物信息系統(tǒng)、桑果菌核病的病原學(xué)研究以及防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

以桑樹品種“大10”的果實作為實驗材料（圖1），分為健康組（A組）、感病組（B組），每組3 個樣品，分別記為A1、A2、A3、B1、B2、B3，以上樣品均取自重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)院桑樹基地，隨機選擇6 株桑樹，每株選擇9 個長勢一致的果實作為一個混合樣，置冰盒帶回實驗室，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 健康桑果（A）與患病桑果（B）對比圖Fig. 1 Healthy (A) and infected mulberry (B) fruits

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取、聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴增及檢測

使用試劑盒對實驗樣品進行基因組DNA提取，具體方法參照說明書。利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取基因組DNA濃度和純度。根據(jù)測序區(qū)域，合成帶有barcode的特異引物進行PCR擴增，使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒（AXYGEN公司）切膠回收PCR產(chǎn)物，Tris-HCl洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測。參照電泳初步定量結(jié)果，將PCR產(chǎn)物用QuantiFluor?-ST藍色熒光定量系統(tǒng)（Promega公司）進行檢測定量，并均一化處理。

1.2.2 Illumina PE250文庫構(gòu)建與測序

構(gòu)建步驟：連接“Y”字形接頭-使用磁珠篩選去除接頭自連片段-利用PCR擴增進行文庫模板的富集-氫氧化鈉變性，產(chǎn)生單鏈DNA片段。文庫構(gòu)建后利用Illumina公司的MiSeq PE250進行高通量測序。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理與分析

利用Trimmomatic軟件、Flash軟件、Usearch軟件、Qiime軟件以及上海元莘生物自行開發(fā)的perl程序進行序列的優(yōu)化與統(tǒng)計，有效序列按照97%的一致性聚類成為操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）；Qiime平臺、RDP Classifier對97%相似水平的OTU代表序列進行物種分類學(xué)分析[19]，進而計算微生物多樣性指數(shù)；R語言Vegan包，Vegdist和Hclust進行群落Heatmap圖[20]、 Bray-Curtis距離計算和聚類分析；R語言進行主成分分析（principal component analysis，PCA）[21]；LEfSe軟件估算每個組分（物種）豐度對差異效果影響的大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序數(shù)據(jù)分析

經(jīng)過質(zhì)控過濾、去除嵌合體，細菌和真菌分別獲得535 600、717 021 條Effective Tags，堿基數(shù)分別為220 138 093、151 427 189 bp，平均長度分別為411.01、211.19 bp，內(nèi)生細菌序列長度高度集于在401～420 bp范圍內(nèi)，內(nèi)生真菌多集中在161～180 bp（圖2）。將Effective Tags在97%的相似度水平下進行聚類，分別獲得OTU 961、423 個，其中非重復(fù)OTU分別為281、259 個。Specaccum物種累積曲線反映出隨著樣本量的增加，曲線逐步趨于平緩，表明抽樣充分，可以進行數(shù)據(jù)分析（圖3）。

圖2 內(nèi)生菌序列分布Fig. 2 Sequence distribution of endophytes

圖3 內(nèi)生菌的Specaccum物種累積曲線Fig. 3 Specaccum species accumulation curves of endophytes

2.2 內(nèi)生菌多樣性分析

2.2.1α多樣性指數(shù)分析

α多樣性可以反映微生物群落的豐度和多樣性情況，常用的度量指標有ACE指數(shù)、Chao指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)[22]。ACE指數(shù)、Chao指數(shù)用于表示樣品內(nèi)生菌豐富度；Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)用于表示樣品內(nèi)生菌多樣性。其中，Simpson指數(shù)越大，說明群落多樣性越低；其余指數(shù)值越大，說明相應(yīng)的群落豐富度、均勻度和多樣性越高。從表1可知，各樣本文庫的覆蓋率較高（＞99.9%），能夠代表桑果樣本中內(nèi)生菌的真實信息。Chao指數(shù)、ACE指數(shù)表明，內(nèi)生細菌的豐富度整體上高于內(nèi)生真菌。對于A組而言，內(nèi)生真菌的Shannon指數(shù)高于內(nèi)生細菌，Simpson指數(shù)低于內(nèi)生細菌，而B組則完全相反，內(nèi)生真菌的Shannon指數(shù)低于內(nèi)生細菌，Simpson指數(shù)高于內(nèi)生細菌，以上表明，健康桑果中內(nèi)生真菌的多樣性較內(nèi)生細菌有優(yōu)勢，而感病桑果中內(nèi)生細菌多樣性較內(nèi)生真菌有優(yōu)勢。

表1 桑果內(nèi)生菌群落多樣性指數(shù)分析Table 1 Diversity indexes of endophytic communities in mulberry fruits

2.2.2β多樣性分析

采用PCA法對兩組桑果內(nèi)生菌的β多樣性進行分析，評估其群落組成相似性及差異性情況。從圖4a看出，PC1、PC2分別解釋了內(nèi)生細菌總變異的97.48%、1.34%，在OTU水平上，A組3 個樣品距離較近，群落組成相似性較高；B組則較為分散，在PC1水平上，B3和A組樣品距離較近，表明感病果實中的病原菌可能會不同程度的改變原有的群落結(jié)構(gòu)。從圖4b看出，PC1、PC2分別解釋了內(nèi)生真菌總變異的83.34%、9.91%，與內(nèi)生細菌不同的是，B組3 個樣品聚集明顯，從內(nèi)生真菌角度看，A組和B組內(nèi)生真菌群落差異明顯。對比圖4可知，無論是內(nèi)生細菌還是真菌，A組中3 個樣品均表現(xiàn)出一定的個體獨立性。

圖4 內(nèi)生菌群落PCA圖Fig. 4 PCA of endophytic communities in mulberry fruits

2.3 內(nèi)生菌群落結(jié)構(gòu)組成

在屬、科、目、綱、門水平上分別對2 組樣品的群落結(jié)構(gòu)進行分析。如圖5a所示，內(nèi)生細菌共鑒定出10 個門類，其中占比在0.3%以上的依次為藍藻門（Cyanobacteria，68.74%）、變形菌門（Proteobacteria，27.69%）、厚壁菌門（Firmicutes，1.62%）、擬桿菌門（Bacteroidetes，1.54%）。藍藻門為優(yōu)勢菌門，分支單一，包括1 綱1 目1 科1 屬；變形菌門為相對優(yōu)勢菌門，包括2 綱5 目7 科8 屬；厚壁菌門包括2 綱2 目3 科6 屬；擬桿菌門包括1 綱1 目4 科4 屬。在屬的水平，Cyanobacteria_norank（分類學(xué)系譜中沒有這個層級的科學(xué)名稱，用norank作標記）為優(yōu)勢菌屬（68.74%），泛菌屬（Pantoea，14.32%）為相對優(yōu)勢菌屬；占比超過1.0%的有Mitochondria_norank（8.75%）、甲基桿菌屬（Methylobacterium，1.28%）；占比在0.3%～1.0%之間的有Enterobacteriaceae_unclassified、擬桿菌屬（Bacteroides）、沙雷氏菌屬（Serratia）、氣單胞菌屬（Aureimonas）、普雷沃菌屬（Prevotella_9）和根瘤菌屬（Rhizobium）。此外，如圖6a所示，Heatmap圖可以直觀地看出各樣品在屬分類水平上群落組成結(jié)構(gòu)相似性及差異性，除A3外，A組樣品的內(nèi)生菌群落結(jié)構(gòu)多樣性明顯小于B組所有樣品，說明感病果實內(nèi)生細菌多樣性高于健康果實，與2.2.1節(jié)結(jié)果相似。Cyanobacteria_norank、Mitochondria_norank是病原菌影響最為明顯的兩個屬，均呈下降的趨勢。未發(fā)現(xiàn)單獨存在于某一樣本中的特有菌屬。層次聚類的結(jié)果和β多樣性分析相似。

圖5 不同分類水平下的內(nèi)生菌主要類群Fig. 5 Main endophytic groups at different taxonomic levels in mulberry fruits

如圖5b所示，內(nèi)生真菌共鑒定出3 個門類，依次為子囊菌門（Ascomycota，83.52%）、Fungi_unclassified（13.34%）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota，3.14%），子囊菌門為優(yōu)勢菌門，包括3 綱8 目15 科18 屬；Fungi_unclassified菌門幾乎全部存在于A組，且為相對優(yōu)勢菌門；擔(dān)子菌門包括3 綱4 目4 科5 屬。在屬的水平，杯盤菌屬（Ciboria，49.64%）為優(yōu)勢菌屬，占比超過2.0%的屬有5 個，分別為Fungi_unclassified（13.34%）、Monographella（11.15%）、間座殼屬（Diaporthe，7.48%）、球腔菌科（Mycosphaerellaceae_unclassified，3.31%）和鏈格孢屬（Alternaria，2.03%）；占比超過1.0%的屬有5 個，分別為座囊菌綱（Dothideomycetes_unclassified）、腥擲孢菌屬（Tilletiopsis）、刺盤孢屬（Cladosporium）、Udeniomyces和Boeremia；在0.3%～1.0%的屬有11 個。如圖6b所示，B組中杯盤菌屬占比高達99%以上，且內(nèi)生真菌多樣性遠小于A組。值得注意的是，在A組也檢出少量的杯盤菌屬，且多數(shù)存在于A1中，同時發(fā)現(xiàn)A1中多數(shù)真菌豐度大于A2和A3，其中最為突出的是Mycosphaerellaceae_unclassified與赤霉菌屬（Gibberella）2 個屬，Mycosphaerellaceae_unclassified在A1中的豐度分別是A2和A3的2 835.93、226.67 倍，赤霉菌屬在A1中的豐度分別是A2和A3的63.74、261.82 倍，此變化是否和少量病原菌入侵有關(guān)，還有待于進一步驗證。此外，間座殼屬、棒孢屬（Corynespora）分別為A2、A3的特有菌屬，這可能是由于植株（樣品）個體差異，對病原菌的敏感程度及調(diào)節(jié)能力不同所致。層次聚類的結(jié)果和β多樣性分析相似。

圖6 屬水平群落結(jié)構(gòu)Heatmap圖Fig. 6 Heatmap of endophytic community structure at the genus level

2.4 組間內(nèi)生菌差異顯著分析

采用LEfSe（LDA Effect Size）分析方法，進行感病桑果及健康桑果內(nèi)生菌差異顯著分析，尋找具有統(tǒng)計學(xué)差異的生物標識（Biomarker）。從圖7a、b可知，只有B組進入了預(yù)設(shè)值。泛菌屬（Pantoea）、嗜纖維菌綱（Cytophagia）及其分支嗜纖維菌目（Cytophagales）、嗜纖維菌科（Cytophagaceae）、薄層菌屬（Hymenobacter）是B組中起重要作用的微生物類群，其中泛菌屬（Pantoea）對其影響程度最大。

圖7 LDA值與物種分支圖Fig. 7 LDA scores and cladograms of endophytes

從圖7c可知，A組中有差異顯著的Biomarker遠大于B組。結(jié)合進化分支圖（圖7d）可知，兩組內(nèi)有差異的Biomarker相對較多，包括3 門10 綱20 目25 科32 屬，其中B組僅有1 門（Ascomycota）、1 綱（錘舌菌綱，Leotiomycetes）、1 目（柔膜菌目，Helotiales）、1 科（核盤菌科，Sclerotiniaceae）、1 屬（Ciboria）在組間有顯著差異，且豐度較高，其余的2 門9 綱19 目24 科31 屬均存在于A組，其中豐度相對較高的有2 綱1 目1 科1 屬，分別為糞殼菌綱（Sordariomycetes）和Dothideomycetes 2 綱、炭角菌目（Xylariales）及其分支的1 科（Xylariales_f_Xylariales_fam_Incertae_sedis）1 屬（Monographella）。

3 討 論

3.1 感病與健康桑果的內(nèi)生菌多樣性

目前，關(guān)于菌核病病原侵染對健康桑果內(nèi)生菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性造成的影響鮮見報道，本研究以桑樹的感病果實和健康果實為研究對象，采用高通量測序技術(shù)，分析二者內(nèi)生菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性差異。從ACE指數(shù)、Chao指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)（表1）4 個多樣性指標變化可知，病原菌的入侵明顯改變了桑果的內(nèi)生菌群落多樣性，但其對細菌和真菌的影響規(guī)律不一致。整體上看，感病果實內(nèi)生細菌豐富度及多樣性高于健康果，而真菌豐富度及多樣性低于健康果。其中細菌的變化規(guī)律和向立剛等[23]關(guān)于感病煙株細菌變化相似，可能是菌核病嚴重破壞了果實組織，內(nèi)部平衡被打破，導(dǎo)致環(huán)境中其他細菌在發(fā)病組織中定植，另一方面，植株自身的防御系統(tǒng)在受到外來病原菌攻擊時，根部內(nèi)生細菌可能會通過莖部向果實遷移；真菌變化與鄧世林等[24]關(guān)于感病楊樹葉圍的研究相似，可能是因為病原菌的大量繁殖改變了內(nèi)生真菌的生態(tài)環(huán)境，與原生真菌形成生態(tài)位競爭的關(guān)系，導(dǎo)致部分真菌減少甚至消失。β多樣性及層次聚類分析表明，B組樣品的內(nèi)生細菌群落組成差異性較大，且B3和A組樣品細菌組成相似性在PC1水平相對較高，可能是由于病原菌對桑果的破壞程度不同而引起內(nèi)生細菌群落結(jié)構(gòu)組成差異較大。

3.2 感病與健康桑果的內(nèi)生細菌群落結(jié)構(gòu)組成及差異

變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門、酸桿菌門（Acidobactria）以及放線菌門（Actinobacteria）是桑樹主要的內(nèi)生細菌資源[25-26]。本研究對感病和健康桑果的內(nèi)生菌群落結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，藍藻門是果實相對其莖段內(nèi)生菌[26]的特有菌門，放線菌門相對較少，不含有酸桿菌門，這可能和宿主?；约吧９麅?nèi)環(huán)境有關(guān)。從屬水平看，除A3外，健康桑果內(nèi)生細菌類群僅為患病組的45.39%，可能和3.1節(jié)討論部分分析的原因有關(guān)。相對來說，Cyanobacteria_norank、Mitochondria_norank 2 個屬在患病組含量呈現(xiàn)明顯下降趨勢，說明二者對病原菌較為敏感。LEfSe分析表明，泛菌屬在B組中是重要的微生物類群，其豐富度遠大于A組，而該屬一分支已被證實具有致萎活性，可能會與其他病原菌發(fā)生協(xié)同作用，導(dǎo)致?？菸27]。目前，芽孢桿菌屬被認為是具有顯著生防作用的一類菌[9]，且對植物生長有促進作用，但在本研究中，芽孢桿菌屬幾乎不存在于桑果中，這一發(fā)現(xiàn)為今后芽孢桿菌屬在果實中的定殖研究奠定了基礎(chǔ)。

3.3 感病與健康桑果的內(nèi)生真菌群落結(jié)構(gòu)組成及差異

內(nèi)生真菌在門的組成水平相對簡單，主要為子囊菌門、Fungi_unclassified和擔(dān)子菌門，其中Fungi_unclassified、擔(dān)子菌門在感病組有不同程度下降，前者幾乎不存在于感病組，后者受病原菌影響較大，整體下降99.07%，說明二者為菌核病敏感指示菌門。關(guān)于健康果中也含有少量病原菌Ciboria，但未發(fā)病的現(xiàn)象，可能與病原菌侵染方式和氣候有關(guān)，菌核病病原菌孢子特異性侵染桑雌花一般發(fā)生在春季2—3月桑雌花開放時，后致桑果染病[28]，此外，采集樣品時（5月初）重慶氣溫已經(jīng)達到30 ℃以上，不利于病原菌菌絲大量繁殖，故有病原菌但并未發(fā)病。Wilcoxon秩和檢驗發(fā)現(xiàn)，健康組和感病組桑果內(nèi)生真菌達到了顯著性差異水平，其中杯盤菌屬為感病組重要影響成分，因為該菌為桑果菌核病致病菌屬中的一類；Dothideomycetes已被證明具有組織偏好性[29]，可能已經(jīng)纖維化的病果不利其生長；Sordariomycetes在本研究中表現(xiàn)的組織偏好性，與前人研究不一致[30-31]，可能和樣本類別不同有關(guān)，研究中未被分類的菌還有待于進一步開發(fā)。

4 結(jié) 論

本研究利用高通量測序技術(shù)，獲得了大量桑果內(nèi)生真菌和細菌微生物群體信息，包括一些未被分類的菌群。通過比較分析，明確了健康桑果和感病桑果的內(nèi)生菌群落構(gòu)成及多樣性，探討了部分內(nèi)生菌在健康桑果和感病桑果中的差異和作用，篩選出一些具有顯著差異的Biomarker。研究結(jié)果可以為桑果微生物信息系統(tǒng)構(gòu)建、菌核病拮抗菌株的篩選和利用提供數(shù)據(jù)支撐。