蛋黃蛋白-植酸靜電復(fù)合物對蛋黃乳液 物理穩(wěn)定性的影響

劉 晶，畢雅雯，董世建，徐明生,

（1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 江西省農(nóng)產(chǎn)品加工與質(zhì)量控制工程實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330045；2.江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 淮安 223023；3.安徽榮達(dá)食品有限公司，安徽 宣城 242228）

蛋黃（egg yolk，EY）營養(yǎng)豐富，具有良好的加工特性，是食品生產(chǎn)中常用的原料。EY富含蛋白質(zhì)、磷脂等表面活性成分，具有在酸性條件形成乳液的特性，在EY醬、調(diào)味料及乳飲料中得到應(yīng)用[1]。但是EY在酸性乳液體系中不穩(wěn)定，制備的乳液易分層或析油，對產(chǎn)品的外觀及保質(zhì)期易造成不良影響，其限制EY乳液在實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用[2]。因此，改善EY在酸性乳液體系的物理穩(wěn)定性具有重要意義。

研究表明，EY蛋白對乳化性能的貢獻(xiàn)高于磷脂[3]，改性蛋白質(zhì)以提升乳液的穩(wěn)定性成為研究熱點(diǎn)?，F(xiàn)普遍通過物理法或添加食品成分對EY改性提高乳液物理穩(wěn)定性。謝云霄[4]超聲處理EY以部分聚集EY的低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL），蛋白質(zhì)分子界面變得柔軟可拉伸，EY乳液的穩(wěn)定性因此提高。Bao Zhijie等[5]使用蛋白酶對蛋白質(zhì)定向水解以改善EY的功能性質(zhì)，使乳液穩(wěn)定性得以提升。此外，通過食品成分與EY形成復(fù)合物，提高EY乳液穩(wěn)定性也是常用手段[6]，如張?jiān)娝糩7]制備的黃原膠-EY復(fù)合物在乳液中形成三維空間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)以抑制液滴聚集，并增加乳液黏度限制液滴移動(dòng)以達(dá)到穩(wěn)定EY乳液的作用；高揚(yáng)[8]制備的殼聚糖-EY靜電復(fù)合物在乳液液滴表面提供空間阻力使EY乳液穩(wěn)定；Yang Xi等[9]通過海藻酸鈉-EY不溶性靜電復(fù)合物制備EY醬，有效改善其黏度及穩(wěn)定性。

植酸（phytic acid，PA）主要存在于谷物或豆類等植物中，是天然小分子化合物[10-11]。PA有6 個(gè)帶負(fù)電荷的磷酸基團(tuán)，其與帶正電荷的蛋白質(zhì)靜電相互作用形成復(fù)合物[12]。如PA與乳清蛋白靜電相互作用，二者形成不溶性靜電復(fù)合物增強(qiáng)乳滴間的空間位阻，提高乳液的物理穩(wěn)定性[13]。此外，PA可螯合金屬離子[14]，其固定EY中金屬離子以破壞酸性EY中穩(wěn)定的磷酸鈣橋結(jié)構(gòu)而釋放更多帶正電荷的蛋白質(zhì)[15]，因此形成更多不溶性靜電復(fù)合物。然而，目前EY蛋白與PA形成靜電復(fù)合物對酸性EY乳液穩(wěn)定性的影響尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)在EY乳液產(chǎn)品的常規(guī)環(huán)境（pH 3.0）中，研究PA質(zhì)量分?jǐn)?shù)（0%～0.8%）對EY蛋白及EY乳液物理穩(wěn)定性的影響。通過分析靜電復(fù)合物制備EY乳液的乳析指數(shù)、黏度、粒徑、微觀結(jié)構(gòu)及界面性質(zhì)，以期了解EY-PA影響酸性EY乳液穩(wěn)定特性的規(guī)律，為改善酸性EY乳液類產(chǎn)品的生產(chǎn)及應(yīng)用提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞蛋市購；大豆油中國益海嘉里金龍魚糧油食品股份有限公司；PA美國Sigma公司；疊氮化鈉 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Bradford蛋白試劑盒 北京 索萊寶科技有限公司；蛋白上樣緩沖液（loading buffer，LB） 美國Thermo Scientific公司。

1.2 儀器與設(shè)備

K-355凱氏定氮儀 瑞士Büchi公司；T25高速分散機(jī) 德國IKA公司；Zetasizer Nano ZS90電位儀 英國Malvern公司；DHR-1流變儀 美國TA儀器公司；Mastersizer 3000激光粒度分析儀 英國Malvern公司；IX73倒置熒光顯微鏡 日本奧林巴斯公司。

1.3 方法

1.3.1 混合EY液制備

將新鮮EY液攪拌過篩得均勻EY液，并參照GB 5009.5—2016《食品中蛋白質(zhì)的測定》[16]中的凱氏定氮法進(jìn)行蛋白質(zhì)含量的測定，于4 ℃冰箱備用。PA粉末溶于超純水中制備質(zhì)量分?jǐn)?shù)2% PA溶液備用。將EY液、PA溶液和超純水以不同比例均勻混合，并使用0.1 mol/L HCl、0.1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至3.0，分別得到均含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)1% EY蛋白的0%、0.012 5%、0.05%、0.2%、0.8% PA溶液。

1.3.2 乳液的制備

將上述制備的混合EY液與大豆油一定質(zhì)量比混合，再使用分散機(jī)在25 ℃、11 000 r/min剪切2 min制成不同乳液。

1.3.3 Zeta電位測定

參考Gao Yang等[2]的方法并略作修改，用超純水將混合EY液稀釋200 倍，使用電位儀測定溶液所帶電荷。

1.3.4 溶解度測定

取適量混合EY液于離心管中，于4 ℃、12 000 r/min離心20 min取出上清液。使用Bradford蛋白試劑盒的微孔酶標(biāo)儀法[4]測上清液蛋白質(zhì)量濃度（mg/mL）。

1.3.5 乳析指數(shù)測定

參考Chen Xing等[17]的方法，取新鮮乳液，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.04%疊氮化鈉溶液為抗菌劑防止乳液腐敗，然后將乳液置于密閉的玻璃瓶中，玻璃瓶放于25 ℃的恒溫避光培養(yǎng)箱中，分別于第1、3、5、7、14、21、28天監(jiān)測乳液，在第7天時(shí)拍照記錄乳液的外觀。按式（1）計(jì)算乳析指數(shù)：

式中：Hs為不同時(shí)間下層清液的高度/cm；Ht為整個(gè)乳液的高度/cm。

1.3.6 黏度測定

參考高揚(yáng)[8]的方法，用流變儀測定乳液黏度。使用鋁制平板（直徑40 mm，夾具與載物臺之間間距1 mm），在室溫25 ℃，對2.0 mL乳液進(jìn)行連續(xù)剪切實(shí)驗(yàn)，剪切速率范圍為0.1～100 s－1，測定樣品的黏度在連續(xù)剪切條件的變化。

1.3.7 粒徑測定

參考唐世濤[18]的方法，并略作修改，使用Mastersizer 3000激光粒度分析儀測定乳液粒徑分布。參數(shù)設(shè)置：大豆油折射率1.470，材料吸收率0.010，分散劑蒸餾水，折射率1.330。取適量乳液加入樣品池，直到混合溶液的遮光度達(dá)到10%～15%之間。所有測試均在室溫進(jìn)行并重復(fù)3 次取平均值。

參考李慧娜[19]的方法并略作修改。使用倒置熒光顯微鏡觀察乳滴的微觀結(jié)構(gòu)。使用超純水適當(dāng)稀釋乳液并用尼羅紅染料染色，再用毛細(xì)吸管吸取少量乳液于干凈的載玻片中央，并輕輕蓋上蓋玻片。經(jīng)平衡2 min后進(jìn)行觀察，使用倒置熒光顯微鏡儀器自帶的軟件控制攝像機(jī)拍照。

1.3.9 界面蛋白吸附量測定

參考高揚(yáng)[8]的方法，并略作修改，取15 mL乳液于4 ℃、12 000 r/min離心20 min，離心后觀察到3 個(gè)部分：離心管上層的乳脂層，中層的水相和底部的沉淀物。用注射器小心去除乳脂層以收集水相和沉淀物，再次離心子相以徹底去除乳脂層，重復(fù)去除乳脂層3 次，最后收集水相和沉淀物。其中，水相通過0.22 μm濾膜過濾后，使用Bradford蛋白試劑盒測定蛋白質(zhì)含量；沉淀物用凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)含量。乳液界面吸附蛋白量為每克油吸附的蛋白質(zhì)量，按式（2）計(jì)算界面蛋白吸附量：

式中：M為乳液的總蛋白質(zhì)質(zhì)量/g；M1為中層水相的蛋白質(zhì)質(zhì)量/g；M2為底部沉淀物的蛋白質(zhì)質(zhì)量/g；M3為乳液油相的質(zhì)量/g。

1.3.10 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）

參考Yang Yuan等[20]的方法，并略作修改。將一定蛋白濃度的稀釋液與蛋白LB混勻并沸水浴5 min，于4 ℃、10 000 r/min離心5 min。分離膠和濃縮膠分別為12%和5%，恒壓120 V。運(yùn)用R-250染色，ChemiDoc XRS+凝膠成像儀掃描處理。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

所有樣品一式3 份并以平均值表示。使用Origin 8.0、Excel 2013軟件分析所有數(shù)據(jù)。使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行方差分析，顯著性通過Duncan多重比較得出。

針對上述實(shí)戰(zhàn)需求本文提出了一種基于機(jī)器學(xué)習(xí)的在押人員可穿戴多傳感器融合的生命體征監(jiān)測系統(tǒng)設(shè)計(jì)方案。在該系統(tǒng)中具體的產(chǎn)品形式包括智能指環(huán)、智能手環(huán)和智能胸帶。其中嵌有血氧采集傳感器、體溫傳感器、血壓傳感器、心率傳感器等，可以實(shí)時(shí)監(jiān)測被監(jiān)管人員的生命體征數(shù)據(jù)。所采集的生命體征數(shù)據(jù)通過無線傳感網(wǎng)絡(luò)傳輸，可以使遠(yuǎn)程監(jiān)控中心應(yīng)用服務(wù)能夠在快速的與生命體征監(jiān)測設(shè)備進(jìn)行數(shù)據(jù)交互，同時(shí)具有與PC、手機(jī)和PAD 等不同的終端進(jìn)行交互數(shù)據(jù)的能力，進(jìn)而能夠?qū)?shù)據(jù)通過無線的方式傳輸至網(wǎng)絡(luò)云端進(jìn)行分析處理、可視化展示以及通過機(jī)器學(xué)習(xí)算法和模型對健康狀況進(jìn)行研判。

2 結(jié)果與分析

2.1 混合EY液的Zeta電位分析

如圖1所示，隨著PA質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高，溶液的Zeta電位呈顯著降低的趨勢（P＜0.05），其原因?yàn)閜H 3.0時(shí)，EY蛋白帶凈正電荷[21]，而PA有6 個(gè)帶負(fù)電荷的磷酸基團(tuán)，所以PA一般呈負(fù)電性[22]。因此，隨著PA質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高，更多帶負(fù)電荷的PA與帶正電荷的EY蛋白靜電相互結(jié)合，溶液的Zeta電位持續(xù)降低，這與Pei Yaqiong等[13]的研究結(jié)果一致。Zeta電位的結(jié)果表明在pH 3.0時(shí)，PA與EY蛋白可發(fā)生靜電相互作用。

圖1 混合EY液的Zeta電位Fig. 1 Zeta potential of EY mixtures

2.2 混合EY液的溶解度分析

如圖2所示，pH 3.0時(shí)，隨著PA質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高，混合EY液的溶解度呈先下降后上升的趨勢，其原因?yàn)镻A質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于0.2%時(shí)，逐漸增多的陰離子PA與帶正電荷蛋白質(zhì)氨基酸殘基緩慢結(jié)合，不斷中和蛋白質(zhì)的靜電排斥力，以聚集蛋白質(zhì)形成不溶性靜電復(fù)合物EY-PA；由于復(fù)合物含量開始增多，溶解度出現(xiàn)顯著性下降趨勢 （P＜0.05）。而PA質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.2%～0.8%時(shí)，不斷增多的陰離子PA提高復(fù)合物間的靜電排斥力，溶解度開始增加，靜電復(fù)合物含量減少，此時(shí)PA發(fā)揮類似離液陰離子的作用[23]。溶解度的結(jié)果表明pH 3.0時(shí)，帶正電荷的EY蛋白與負(fù)電荷PA靜電結(jié)合以形成不溶性復(fù)合物EYPA，且靜電復(fù)合物的含量依賴PA質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

圖2 混合EY液的可溶性蛋白質(zhì)含量Fig. 2 Soluble protein contents in EY mixtures

2.3 混合EY液可溶性蛋白質(zhì)組成

為了解不同PA質(zhì)量分?jǐn)?shù)結(jié)合EY蛋白的種類及順序，完善EY蛋白與PA形成復(fù)合物的作用機(jī)制。采用SDS-PAGE分析混合EY液中可溶性蛋白的組成，并推理已結(jié)合的蛋白質(zhì)種類。EY中LDL、高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）、卵黃高磷蛋白（phosvitin，PV）及卵黃球蛋白（livetine，VN）是主要的蛋白質(zhì)成分。如圖3所示，對照組1% EY蛋白泳道主要是LDL（220、110～180、50 kDa）、VN（38～40 kDa）[18,24]，其原因?yàn)長DL與VN幾乎在任意離子強(qiáng)度或pH值的溶液中溶解，而EY中磷酸鈣橋的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，磷酸鈣橋僅在高離子濃度或者pH值接近中性時(shí)才逐漸被破壞并釋放HDL、LDL、PV[24]。因此pH 3.0時(shí)，EY中可溶性蛋白成分主要以LDL與VN為主。1% EY-0.012 5% PA的蛋白條帶組成和對照組無明顯變化，只是部分條帶深淺產(chǎn)生變化，表明此時(shí)PA已和少量EY蛋白結(jié)合，但極低質(zhì)量分?jǐn)?shù)PA并未改變混合EY液的可溶性蛋白組成。而在0.05% PA的泳道上，LDL與VN條帶基本消失，且出現(xiàn)35 kDa HDL、53 kDa HDL、19 kDa LDL、59 kDa PV條帶[18,20,25]，所以此時(shí)LDL、VN分別與PA形成不溶性復(fù)合物PA-LDL和PA-VN，且游離PA開始破壞EY磷酸鈣橋結(jié)構(gòu)，釋放其中可溶性帶正電荷的EY蛋白。而PA質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.2%或0.8%時(shí)的混合EY液可溶性蛋白濃度極低，其泳道出現(xiàn)與0.05% PA相同分子質(zhì)量但顏色較淺的條帶，所以增多的PA將磷酸鈣橋釋放的蛋白質(zhì)再次靜電結(jié)合形成EY-PA。SDS-PAGE結(jié)果表明pH 3.0時(shí)，隨著PA質(zhì)量分?jǐn)?shù)的提高，PA先與EY中可溶性蛋白形成不溶性靜電復(fù)合物，接著破壞EY磷酸鈣橋結(jié)構(gòu)，并與釋放的蛋白質(zhì)再次結(jié)合形成更多的不溶性靜電復(fù)合物EY-PA。

圖3 混合EY液的可溶性蛋白組成Fig. 3 SDS-PAGE analysis of soluble protein components in EY mixtures

2.4 不同比例乳液的乳析指數(shù)

乳液乳析指數(shù)是衡量乳液物理穩(wěn)定性的重要參數(shù)，一般乳析指數(shù)越大則液滴移動(dòng)越快，液滴越易聚集，乳液物理穩(wěn)定性越差[26]。圖4a為不同PA質(zhì)量分?jǐn)?shù)的混合EY液與大豆油混合質(zhì)量比3∶1時(shí)，剪切均質(zhì)制備的乳液。由圖4a1可知，3 組乳液的乳析指數(shù)隨著貯藏時(shí)間延長均呈緩慢上升的趨勢，且在第7天后上升速度降低至趨于平緩，因此分析第7天乳液的乳析指數(shù)、外觀圖。 由圖4a2、a3可知，隨著PA質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高，復(fù)合物EY-PA制備EY乳液的乳脂層較對照組的厚度均增加，乳析指數(shù)呈先顯著下降再上升的趨勢（P＜0.05），1% EY-0.2% PA組乳析指數(shù)低于其他組別。表明EY-PA制備乳液的液滴間斥力作用強(qiáng)度高于對照組乳液，液滴有規(guī)則地分布并緊密堆積使乳脂層加厚[27]。此外，乳液乳析指數(shù)變化與對應(yīng)混合EY液溶解度的變化趨勢相似，這說明EY-PA制備的乳液的物理穩(wěn)定性與不溶性靜電復(fù)合物含量呈正相關(guān)性。乳析指數(shù)的結(jié)果表明，PA能提高EY乳液物理穩(wěn)定性，但過高濃度PA破壞乳液穩(wěn)定，其具體機(jī)理需深入研究。

圖4 乳液的乳析指數(shù)變化及第7天乳液的外觀圖Fig. 4 Changes in creaming index and appearance of emulsions on the seventh day of storage

為了探究EY-PA制備的酸性EY乳液保持穩(wěn)定狀態(tài)的能力，實(shí)驗(yàn)研究pH 3.0及最優(yōu)PA質(zhì)量分?jǐn)?shù)（0.2% PA）時(shí)，不同EY蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)（1%、3%、5%）對乳液穩(wěn)定性能的影響。圖4b為不同蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的混合EY液與大豆油混合質(zhì)量比為2∶1時(shí)，剪切均質(zhì)制備的乳液。由 圖4b1可知，5% EY-0.2% PA制備乳液在28 d內(nèi)乳析指數(shù)均為0；其他乳液的乳析指數(shù)隨著貯藏時(shí)間延長均呈緩慢上升的趨勢，且在第7天后變化趨于平緩。由圖4b2、b3可知，隨著EY蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的提高，實(shí)驗(yàn)組和對照組的乳析指數(shù)均呈顯著下降趨勢（P＜0.05）；1% EY-0.2% PA制備乳液的乳析指數(shù)甚至低于5% EY制備乳液的乳析指數(shù)；放置28 d的5% EY-0.2% PA制備乳液仍未分層。這些結(jié)果表明pH 3.0時(shí)，EY-PA制備EY乳液的穩(wěn)定性得到顯著改善，且使用復(fù)合物制備的乳液能減少EY使用量并達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。

2.5 不同比例乳液的黏度

乳液黏度與乳滴間的聚集程度及穩(wěn)定性密切相關(guān)[28]。 由圖5可知，乳液黏度隨剪切速率的增大而降低， 極高剪切速率下黏度趨于定值，EY乳液均呈剪切稀化。圖5a中，相同剪切速率的作用時(shí)，PA質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0%～0.2%時(shí)，隨著PA質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，乳液黏度不斷升高；當(dāng)PA質(zhì)量分?jǐn)?shù)由0.2%升高至0.8%時(shí)，乳液黏度出現(xiàn)降低現(xiàn)象，此現(xiàn)象與Pei Yaqiong等[13]的研究結(jié)果一致。Le Denmat等[24]發(fā)現(xiàn)在EY乳液中，較高的乳液黏度意味著乳滴間空間斥力作用較強(qiáng)，其限制乳液液滴的流動(dòng)性，有助于加強(qiáng)乳液穩(wěn)定性。由圖4a3可知，PA能提高EY乳液的黏度并改善乳液穩(wěn)定性，但過高含量的PA可能會降低界面上蛋白質(zhì)間的斥力作用而降低乳液穩(wěn)定性。

圖5 不同PA質(zhì)量分?jǐn)?shù)（a）和EY蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)（b）乳液的黏度Fig. 5 Viscosity versus shear rate curves of emulsions with different PA concentrations (a) and different EY concentrations (b)

由于EY乳液黏度影響產(chǎn)品的口感及質(zhì)量[29]，因此研究不同EY蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)（1%、3%、5%）對乳液黏度的影響。由圖5b可知，相同剪切速率的作用時(shí)，純EY乳液的黏度隨著蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加而不斷升高，此現(xiàn)象與Anton等[30]的研究結(jié)果一致。由圖5b可知，EY-0.2% PA制備乳液的黏度均高于對照組（1%、3%、5% EY）制備的乳液的黏度，此現(xiàn)象與Pei Yaqiong等[13]加入PA后，乳液界面上蛋白質(zhì)間的空間斥力作用加強(qiáng)而黏度變大的結(jié)果一致。由圖4b3可知，純EY組乳液的下層清液較渾濁甚至底部有沉淀產(chǎn)生，而1% EY-0.2% PA制備乳液的下層清液層幾乎透明，其原因可能為更多EY在油水界面處穩(wěn)定乳液，因此酸性EY乳液較其他條件制備乳液有更好的穩(wěn)定性[31]。

2.6 乳液的粒徑分析

乳液粒徑影響乳液穩(wěn)定性，乳滴粒徑越小的乳液越穩(wěn)定[32]。如圖6所示，隨著PA質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，乳液粒徑呈先顯著減小后增大的趨勢（P＜0.05）。這表明PA與EY蛋白靜電結(jié)合形成復(fù)合物后，在剪切均質(zhì)過程中，復(fù)合物吸附到油水界面形成粒徑較小的液滴，使乳液更穩(wěn)定。濃度過高的PA聚集一部分乳滴聚結(jié)，從而使乳液中乳滴的平均粒徑上升，降低EY乳液穩(wěn)定性。結(jié)合圖4、5可知，乳析指數(shù)、黏度、粒徑有一定關(guān)聯(lián)性，即EY-PA制備的酸性EY乳液黏度越高，粒徑越小，穩(wěn)定性越理想。

圖6 乳液的粒徑Fig. 6 Particle sizes of emulsions with different PA concentrations and 1% EY mixtures

2.7 不同比例乳液的微觀結(jié)構(gòu)

乳液微觀結(jié)構(gòu)的表征可揭示液滴的微觀形態(tài)、分布情況。由圖7可知，對照組（1% EY）乳液的液滴粒徑較大，且分布不均勻，大量液滴聚集、聚結(jié)。PA質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.012 5%～0.2%時(shí)，乳滴隨著PA質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而減小粒徑，且分布更均勻，聚集、聚結(jié)情況好轉(zhuǎn)。PA質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%～0.8%時(shí)，1% EY-0.2% PA制備乳液的粒徑較1% EY-0.8% PA制備的乳液的粒徑明顯減小，液滴呈規(guī)律的球形，且極少有聚結(jié)情況，所以1% EY-0.2% PA制備乳液保持理想的穩(wěn)定性。因此pH 3.0時(shí)，EY蛋白作為乳化劑仍可包覆在油滴表面形成界面膜，但是由于缺乏足夠排斥力，小液滴容易聚集并聚結(jié)形成更大粒徑的液滴。而適量的PA可提供一定空間阻力以保持乳滴規(guī)則的球狀，且未打破液膜形成更大尺寸的液滴。從微觀角度說明EY-PA制備EY乳液形成的界面膜具有一定阻止液滴合并的能力。

圖7 乳液的液滴分布圖（×20）Fig. 7 Droplet distribution micrographs of emulsions (× 20)

2.8 乳液界面蛋白吸附量分析

界面吸附層性影響乳液聚集穩(wěn)定，界面蛋白吸附量是表征乳液穩(wěn)定性的重要指標(biāo)之一。由圖8可知，1% EY-0.2% PA的界面吸附量與其他組別相比顯著提高 （P＜0.05）。隨著PA質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，EY乳液的界面蛋白吸附量呈先顯著增大后減少的趨勢（P＜0.05）。另外，乳液的界面蛋白吸附量與乳析指數(shù)變化結(jié)果一致，即界面蛋白吸附量越高，乳液的乳析指數(shù)越小，乳液的穩(wěn)定性越好，其原因?yàn)镋Y乳液中界面蛋白吸附量越高，則吸附在油滴表面的蛋白質(zhì)含量越高，易形成致密的界面膜。界面蛋白膜越厚，空間位阻作用越明顯，乳液抗聚結(jié)穩(wěn)定性越好[19,33]。更高的界面蛋白吸附量除了增加界面上的蛋白質(zhì)覆蓋率，還抑制液滴聚集并形成較小的液滴[34-35]。因此，PA通過螯合磷酸鈣橋釋放蛋白質(zhì)形成更多EY-PA復(fù)合物，使油滴表面的蛋白含量增加，界面空間位阻作用更明顯，這限制了乳滴移動(dòng)聚集，有助于形成更小粒徑的液滴，由此乳液更穩(wěn)定。而過高的PA質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低靜電復(fù)合物含量、界面蛋白吸附量，使乳液穩(wěn)定性降低。

圖8 乳液的界面蛋白吸附量Fig. 8 Interfacial protein adsorption capacity of emulsions with different PA concentrations and 1% EY

2.9 不同比例乳液的界面蛋白質(zhì)組成

EY乳液主要由蛋白質(zhì)形成并穩(wěn)定，不同蛋白質(zhì)穩(wěn)定乳液的能力存在差異[23]，因此采用SDS-PAGE手段分析EY-PA制備乳液的界面蛋白組成變化情況。由于各組界面蛋白均稀釋6 倍，條帶的深度代表其界面蛋白含量。由圖9可知，1% EY泳道上的界面蛋白條帶主要為LDL、VN，明顯少于EY（pH 7）蛋白條帶數(shù)。1% EY-0.012 5% PA的界面蛋白條帶組成與1% EY基本相同，但1% EY-0.012 5% PA條帶顏色更深。在PA質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05%～0.2%時(shí)，EY-PA制備乳液的界面蛋白條帶中較對照組出現(xiàn)新條帶，主要是35 kDa HDL、53 kDa HDL、19 kDa LDL、59 kDa PV條帶，且隨著PA質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高，界面蛋白條帶顏色加深；而PA質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.2%～0.8%范圍內(nèi)增加時(shí)，條帶顏色變淺。界面蛋白條帶的顏色深度變化與界面蛋白吸附量變化結(jié)果一致。界面蛋白SDS-PAGE表明在pH 3.0時(shí)，EY中溶解性較好的LDL、VN吸附到界面上穩(wěn)定乳液[24]；而PA通過靜電結(jié)合EY中可溶性蛋白，并破壞磷酸鈣橋以釋放其中的蛋白質(zhì)，再與釋放的游離蛋白質(zhì)形成更多靜電復(fù)合物EY-PA吸附到界面上穩(wěn)定EY乳液。而過高濃度PA并不影響EY乳液的界面蛋白質(zhì)組成，但是會降低界面蛋白吸附量，導(dǎo)致乳液穩(wěn)定性變差。EY-PA制備乳液的界面蛋白條帶與EY（pH 7）條帶基本相同，這說明PA僅通過靜電相互作用與EY蛋白結(jié)合，并未破壞蛋白質(zhì)的組成結(jié)構(gòu)。

圖9 乳液的界面蛋白組成Fig. 9 SDS-PAGE analysis of interfacial protein components of emulsions

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)通過研究酸性條件中不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的PA對EY蛋白、EY乳液穩(wěn)定性的影響，發(fā)現(xiàn)在EY液中添加PA能有效改善酸性EY乳液的穩(wěn)定性。PA質(zhì)量分?jǐn)?shù)在 0.012 5%～0.2%范圍內(nèi)增加時(shí)，PA通過螯合作用破壞酸性EY中的磷酸鈣橋并釋放其中包覆的可溶性正電荷蛋白，并與EY中帶正電荷的可溶性蛋白通過靜電相互作用形成不溶性靜電復(fù)合物EY-PA。由EY-PA制備酸性EY乳液較對照組黏度更高，粒徑更小，乳析速率降低。乳液的微觀及界面結(jié)果表明，改性EY液在剪切均質(zhì)過程中有更多蛋白質(zhì)吸附到油水界面，形成更厚的界面膜；乳液保持較小的液滴并呈規(guī)則球狀均勻分布，液滴間聚結(jié)現(xiàn)象好轉(zhuǎn)。但PA質(zhì)量分?jǐn)?shù)需控制在0.012 5%～0.2%范圍內(nèi)，過高含量（0.8%） PA減少靜電復(fù)合物的含量，且破壞界面上蛋白質(zhì)間的斥力作用導(dǎo)致EY乳液穩(wěn)定性下降。本研究為EY-PA靜電復(fù)合物應(yīng)用于酸性EY乳液類產(chǎn)品的研發(fā)、生產(chǎn)提供參考。