微生物合成中鏈二元羧酸的代謝工程研究進(jìn)展

李國(guó)輝，毛銀

1(糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué))，江蘇 無(wú)錫，214122)2(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫，214122)

二元羧酸在工業(yè)領(lǐng)域有著極其重要的地位和作用，包括有機(jī)物的合成、化工制造、工業(yè)生產(chǎn)、食品醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)等方面都具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值，以二元羧酸為原料生產(chǎn)的各種產(chǎn)品也為我們的日常生活帶來(lái)諸多便利[1-4]。目前，直鏈二元羧酸產(chǎn)品大多是由石油基經(jīng)化學(xué)工藝生產(chǎn)的，盡管這些工藝能夠以相對(duì)較低的成本生產(chǎn)出各種各樣日常所需的化工產(chǎn)品，但這種生產(chǎn)方法的原料來(lái)源有限并且對(duì)環(huán)境存在不利影響，本質(zhì)上不能長(zhǎng)久維持，從長(zhǎng)遠(yuǎn)來(lái)看不具有可持續(xù)性[5-6]。隨著二元羧酸的全球需求量日益增加，國(guó)內(nèi)國(guó)際上對(duì)自然環(huán)境保護(hù)力度日益加大，利用微生物合成過(guò)程取代石油生產(chǎn)過(guò)程的理念逐漸得到廣泛關(guān)注。微生物合成法旨在利用可再生資源高效綠色源源不斷地生產(chǎn)人類所需產(chǎn)品，具有廣闊的發(fā)展前景。

根據(jù)二元羧酸碳鏈的長(zhǎng)短可將其分為短鏈二元羧酸(C2～C3)、中鏈二元羧酸(C4～C10)和長(zhǎng)鏈二元羧酸(C11～C18)。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)中鏈二元羧酸發(fā)酵法生產(chǎn)的研究中，丁二酸合成的研究最為深入，對(duì)于戊二酸、己二酸的全生物合成法報(bào)道較少，而碳原子數(shù)更多的庚二酸、辛二酸、壬二酸、癸二酸基本沒(méi)有關(guān)于生物法合成的研究。本文對(duì)中鏈二元羧酸的應(yīng)用價(jià)值、生產(chǎn)方式、國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展等進(jìn)行了綜述，并對(duì)其全生物法合成進(jìn)行了重點(diǎn)探討，以期為發(fā)酵法合成中鏈二元羧酸的研究提供有益的借鑒。

1 中鏈二元羧酸的應(yīng)用價(jià)值

1.1 丁二酸的應(yīng)用價(jià)值

丁二酸，因最初從琥珀中蒸餾獲得也被稱為琥珀酸，是參與三羧酸循環(huán)的天然二元羧酸，在食品醫(yī)藥、日化用品等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景[1]。作為性能優(yōu)異的表面活性劑，常常被用于去垢清潔劑、肥皂等去污產(chǎn)品的生產(chǎn)，在日用化工品行業(yè)可用于脫毛劑、牙膏、清洗劑的生產(chǎn)。丁二酸具有酸味，除在食品添加劑中常被用作酸化劑外，還可作為抗菌劑和風(fēng)味物質(zhì)參與肉制品、水產(chǎn)品、調(diào)味料等的生產(chǎn)過(guò)程。在醫(yī)藥工業(yè)可用于生產(chǎn)解毒劑、鎮(zhèn)靜劑、止血藥、維生素以及抗生素等。

1.2 戊二酸的應(yīng)用價(jià)值

戊二酸為C5直鏈飽和二元羧酸，可用于生產(chǎn)尼龍5,5(戊二胺和戊二酸的聚合物)及其他C5聚酯類衍生物[2]。作為化工行業(yè)常見(jiàn)的一種原料，戊二酸可添加到化工塑料中作增塑劑，也可用作去垢劑、消毒劑等。過(guò)氧戊二酸是一種重要的戊二酸衍生物，可以用作有機(jī)物反應(yīng)的催化劑，利用其自身具有的強(qiáng)氧化性可作為一種殺菌劑直接使用。

1.3 己二酸的應(yīng)用價(jià)值

中鏈二元羧酸中最重要的一種是己二酸，作為在有機(jī)合成工業(yè)中占據(jù)重要地位的一種化合物，其全球的市場(chǎng)價(jià)值可達(dá)到60億美元(2018年)[7]。己二酸是合成己二腈和己二胺的基礎(chǔ)原料，己二酸與己二胺發(fā)生脫水縮合反應(yīng)后生成的錦綸6,6(即尼龍6,6)是最主要的工程塑料之一；己二酸與多元醇發(fā)生縮合反應(yīng)生成聚酯多元醇，可用于各種聚氨酯類產(chǎn)品的生產(chǎn)，例如聚氨基甲酸酯制品、泡沫塑料、膠黏劑等；參與精細(xì)化工行業(yè)眾多產(chǎn)品的生產(chǎn)，如增塑劑、潤(rùn)滑油、染料香料、殺蟲(chóng)劑及農(nóng)藥等各類工業(yè)產(chǎn)品；作為國(guó)內(nèi)批準(zhǔn)可使用的一種酸味劑，具有酸味持久柔和的優(yōu)勢(shì)，是一種優(yōu)良的酸度調(diào)節(jié)劑，在食品工業(yè)如果凍、軟糖、果醬、飲品等產(chǎn)品生產(chǎn)中廣泛使用，具有調(diào)節(jié)酸度、防止腐敗(抑菌)及褐變、穩(wěn)定護(hù)色、緩沖螯合等作用。

1.4 其他中鏈二元羧酸

中鏈二元羧酸中碳原子數(shù)更多的庚二酸、辛二酸、壬二酸、癸二酸也在化工、醫(yī)藥、食品等方面應(yīng)用廣泛。庚二酸俗稱蒲桃酸，在有機(jī)化工領(lǐng)域是一種常用原料[3]，可用于生產(chǎn)涂料樹(shù)脂、高分子共聚體、黏合劑、殺蟲(chóng)劑、消毒劑、塑化劑、潤(rùn)滑油、合成纖維、表面活性劑等工業(yè)常用產(chǎn)品；此外，庚二酸在生物制藥、配合物的配體制備中也有應(yīng)用。辛二酸俗稱軟木酸，主要用于工程塑料的制取(主要是尼龍6,8)、合成高分子聚合物、制備工業(yè)樹(shù)脂、醫(yī)學(xué)藥物及染色染料等。壬二酸俗稱杜鵑花酸，目前工業(yè)上大多用于生產(chǎn)塑化劑(增塑劑)來(lái)增加塑料韌性以方便后續(xù)加工，也常用于高分子樹(shù)脂、香精香料以及潤(rùn)滑油等的制備，同時(shí)壬二酸優(yōu)良的抑菌功能被應(yīng)用于食物防腐中。癸二酸俗稱皮脂酸，目前工業(yè)上主要用于癸二酸酯的制備，其酯類在生產(chǎn)生活中用途廣泛，如鄰居苯二甲酸二異癸酯、鄰苯二甲酸二異壬酯可用作樹(shù)脂或者塑料的增塑劑，尤其在對(duì)高溫條件和絕緣性要求高的材料中運(yùn)用廣泛，也可作為其他有機(jī)聚合物的制備原料(例如聚酰胺、聚氨酯等)，還可以用于制備香精香料、潤(rùn)滑油、有機(jī)涂料等，此外，癸二酸也是生產(chǎn)尼龍10系列材料的原料[4]。

2 現(xiàn)有中鏈二元羧酸的生產(chǎn)方式

2.1 丁二酸的合成

2.1.1 丁二酸的合成方法

丁二酸目前主要的制備方法有電解法、化學(xué)法(從碳原子數(shù)目較少且相對(duì)常見(jiàn)價(jià)廉的烯烴、烷烴出發(fā)，通過(guò)化學(xué)手段制備得到)、生物法(酶轉(zhuǎn)化法和微生物發(fā)酵法)。目前我國(guó)生產(chǎn)丁二酸的廠家除少數(shù)使用順酐加氫化學(xué)法外，其他廠家?guī)缀醵际褂秒娊夥?。電解法[5]是對(duì)馬來(lái)酸或馬來(lái)酸酐(順酐)進(jìn)行電解反應(yīng)，還原得到丁二酸。電解法利用電子的轉(zhuǎn)移，使陰極上馬來(lái)酸中的烯鍵發(fā)生加成反應(yīng)，生成飽和丁二酸，陽(yáng)極電解出的H+轉(zhuǎn)移至陰極。電解法早在20世紀(jì)30年代就在生產(chǎn)實(shí)踐中發(fā)展成熟，到目前為止我國(guó)工業(yè)規(guī)模的丁二酸生產(chǎn)仍停留在該技術(shù)階段。但丁二酸的電化學(xué)法還存在一些問(wèn)題，比如能耗大、離子膜不能長(zhǎng)期重復(fù)使用、電極容易被腐蝕、電解槽維修難度大、污水的回收利用困難、生產(chǎn)規(guī)模小等。順酐催化加氫法具備高轉(zhuǎn)化率、高純度、副產(chǎn)物少等優(yōu)勢(shì)，目前我國(guó)已有部分企業(yè)采用該方法進(jìn)行丁二酸的工業(yè)化生產(chǎn)。其技術(shù)在實(shí)際操作中有兩種路徑：(1)熔融狀態(tài)的順酐直接進(jìn)行催化加氫，或者以有機(jī)溶劑為載體進(jìn)行催化加氫從而生成丁二酸酐，再將丁二酸酐進(jìn)行水解從而得到丁二酸，該方法被稱為非水相法；(2)將順酐水解制備馬來(lái)酸，然后在負(fù)載型貴金屬催化劑條件下一步加氫制備丁二酸，該方法因此被稱為水相法。

2.1.2 丁二酸的生物合成方法

目前生物轉(zhuǎn)化法是擁有較高轉(zhuǎn)化率的方法之一，其利用微生物體內(nèi)制造的富馬酸還原酶將富馬酸(反式丁二烯)轉(zhuǎn)換成丁二酸，這種方法以富馬酸為原料，使用量大且價(jià)格較貴，這種生產(chǎn)方式的性價(jià)比還有待進(jìn)一步提高，目前世界上僅日本三井化學(xué)一家丁二酸生產(chǎn)商使用該制備方法[6]。天然存在的某些厭氧或兼性厭氧微生物(胃腸中的細(xì)菌和一些真菌)，其本身可以依靠自身代謝積累丁二酸[8]。但未經(jīng)改造的天然菌株不具備很強(qiáng)的丁二酸生產(chǎn)能力，同時(shí)伴隨發(fā)酵過(guò)程發(fā)生的副反應(yīng)較雜、副產(chǎn)物較多，對(duì)于糖酸的耐受性差，并不適用于工業(yè)上大規(guī)模的生產(chǎn)[9]。所以生物合成法的研究重點(diǎn)集中放在選育和培養(yǎng)高效的丁二酸發(fā)酵菌種，其中產(chǎn)琥珀酸厭氧螺菌、產(chǎn)琥珀酸放線桿菌、產(chǎn)琥珀酸曼氏桿菌和大腸桿菌等是目前研究的熱門菌株。GLASSNER等[10]篩選菌株得到1株發(fā)生了自發(fā)突變的厭氧螺菌FA-10可以直接生產(chǎn)琥珀酸，其發(fā)酵產(chǎn)物的琥珀酸比例和耐糖濃度均明顯提高，發(fā)酵條件優(yōu)化后丁二酸產(chǎn)量高于30 g/L，得率超過(guò)70%。GUETTLER等[11]篩選出更為優(yōu)秀的變異菌株，該琥珀酸放線桿菌變異菌株不僅能夠抗氟代乙酸，而且在優(yōu)化發(fā)酵條件后丁二酸產(chǎn)量高達(dá)110 g/L，發(fā)酵時(shí)間48 h得率約為97%。LEE等[12]篩選出產(chǎn)琥珀酸曼式桿菌LPK7，在丁二酸的生產(chǎn)過(guò)程中幾乎沒(méi)有甲酸、乙酸、乳酸等其他有機(jī)酸的生成，丁二酸產(chǎn)量達(dá)到52.49 g/L，收率約為1.16 mol/mol，生產(chǎn)強(qiáng)度約為1.8 g/(L·h)。除了篩選高產(chǎn)丁二酸的突變菌株之外，研究者們還通過(guò)基因工程手段對(duì)微生物進(jìn)行改造以提高其產(chǎn)丁二酸的能力，例如敲除或失活競(jìng)爭(zhēng)途徑中的酶、增強(qiáng)丁二酸代謝途徑中的關(guān)鍵酶、改造還原型輔酶合成途徑以及構(gòu)建丁二酸有氧生產(chǎn)體系等[13]。

微生物發(fā)酵法生產(chǎn)丁二酸在其他國(guó)家已經(jīng)可以實(shí)施工業(yè)化生產(chǎn)，例如法國(guó) Bioamber 公司。而國(guó)內(nèi)此法起步晚發(fā)展慢，尚未有成功應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)的相關(guān)報(bào)道。發(fā)酵法制備丁二酸旨在使用價(jià)格相對(duì)便宜的材料，以更為簡(jiǎn)潔高效的加工過(guò)程獲得高產(chǎn)量、高濃度的產(chǎn)品。使用秸稈、玉米等低廉的農(nóng)產(chǎn)品為原料，不僅可得到與化學(xué)方法相比更為安全的醫(yī)藥食品級(jí)產(chǎn)品，同時(shí)還能為農(nóng)產(chǎn)品深加工產(chǎn)業(yè)提供出路，使低廉的農(nóng)產(chǎn)品轉(zhuǎn)化為擁有高附加值的產(chǎn)品，因此發(fā)酵法制備丁二酸是一條具有前景的綠色途徑，具有巨大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

2.2 戊二酸的合成

2.2.1 戊二酸的合成方法

目前戊二酸的工業(yè)生產(chǎn)主要是依靠回收法，在憑借環(huán)己酮的氧化作用得到己二酸的工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中，常常伴有戊二酸、丁二酸等混合二元羧酸副產(chǎn)物，其中一半左右為戊二酸。因此研究者們不斷探索二元羧酸的分離技術(shù)，以期將混合物分離成單個(gè)組分后回收，獲得經(jīng)濟(jì)效益。最常見(jiàn)的一種回收方法是成鹽酸化法。該工藝在二元混合羧酸水溶液中按照理論反應(yīng)配比加入氧化鎂，反應(yīng)生成的戊二酸鎂鹽、丁二酸鎂鹽、己二酸鎂鹽的溶解度不同，其中戊二酸鎂在水中溶解度小，大部分以結(jié)晶物析出，而丁二酸鎂、己二酸鎂大部分溶解在水中，以濾液的形式存在。過(guò)濾得到的戊二酸鎂濾渣中加入濃硫酸，分層溶液上層主要成分為粗戊二酸(95%以上)。整個(gè)過(guò)程沒(méi)有有機(jī)溶液的引入以及“三廢”的產(chǎn)生，工藝過(guò)程簡(jiǎn)單，操作容易，收率較高，已實(shí)現(xiàn)了工業(yè)化生產(chǎn)，是目前戊二酸生產(chǎn)最主要方式[14]。

2.2.2 戊二酸的生物合成方法

2013年，ADKINS等[2]發(fā)現(xiàn)在一些細(xì)菌如惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)中存在天然氨基戊酸途徑，在大腸桿菌中表達(dá)惡臭假單胞菌體內(nèi)的davA、davB、gabT、gabD基因，從而構(gòu)建了從L-賴氨酸生產(chǎn)戊二酸的代謝途徑，最終產(chǎn)生0.82 g/L的戊二酸。同年，PARK等[15]在大腸桿菌中構(gòu)建了相同的途徑——氨基戊酸途徑，將L-賴氨酸經(jīng)過(guò)5-氨基戊酰胺，5-氨基戊酸和戊二酸半醛最終轉(zhuǎn)化為戊二酸，經(jīng)過(guò)優(yōu)化的菌株WL3110最終的戊二酸產(chǎn)量為1.7 g/L(圖1)。2017年，YU等[16]報(bào)道了在重組大腸桿菌中生產(chǎn)戊二酸的新途徑，其中包含部分已知的戊烯酸生物合成途徑以及填空模塊采用的trans-enoyl-CoA還原酶(Ter)，該人造途徑先將中心碳代謝物α-酮戊二酸還原成2-羥基戊二酸，活化成2-羥基戊二酰-CoA后將其脫水成反式戊烯二酰-CoA，通過(guò)trans-enoyl-CoA還原酶和硫酯水解將其氫化成戊二酰-CoA，最終在厭氧培養(yǎng)模式下該重組大腸桿菌產(chǎn)生了3.8 mg/L戊二酸和27.7 mg/L戊烯二酸(圖2)。LI等[17]基于大腸桿菌天然賴氨酸分解代謝途徑，通過(guò)補(bǔ)充谷氨酸和還原型輔酶強(qiáng)化賴氨酸生物合成，釋放賴氨酸反饋抑制和促進(jìn)草酰乙酸供應(yīng)，從而最大化碳通量向戊二醛生物合成，同時(shí)使用天然轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白來(lái)克服尸胺和5-氨基戊酸的細(xì)胞外積累，最終在補(bǔ)料分批條件下戊二酸的產(chǎn)量達(dá)到54.5 g/L。

圖1 L-賴氨酸生產(chǎn)戊二酸的代謝途徑Fig.1 Metabolic pathways for the production of glutarate from L-lysine

圖2 重組大腸桿菌中戊二酸的生物合成途徑Fig.2 Metabolic pathway for glutarate biosynthesis in recombinant Escherichia coli

2.3 己二酸的合成

2.3.1 己二酸的化學(xué)合成方法

現(xiàn)有的工業(yè)化生產(chǎn)己二酸的工藝以化學(xué)方法為主，主要有環(huán)己醇氧化法、環(huán)己烷氧化法和環(huán)己烯水合法等3種方式[18]。20世紀(jì)30年代，美國(guó)杜邦已開(kāi)始了己二酸的工業(yè)制備，通過(guò)利用苯酚與氫氣在催化劑作用下反應(yīng)生成環(huán)己醇后經(jīng)硝酸氧化即可生成己二酸，但因?yàn)樵媳椒拥膩?lái)源受限，該法僅適用于苯酚原料相對(duì)豐富的地區(qū)。環(huán)己烷氧化法是目前企業(yè)生產(chǎn)己二酸最常用的方法，具有效率高、污染小且回收率好等優(yōu)勢(shì)，但是由于使用硝酸氧化，會(huì)產(chǎn)生大量的氮氧化物從而對(duì)環(huán)境產(chǎn)生嚴(yán)重影響。而環(huán)己烯水合法是利用高純度苯與充足氫氣在催化劑釕的作用下發(fā)生加成反應(yīng)得到部分加氫產(chǎn)物環(huán)己烯，而后者可與水生成環(huán)己醇并最終氧化后生成己二酸。

在化學(xué)法工業(yè)生產(chǎn)己二酸的工藝中，硝酸的大量使用對(duì)環(huán)境造成嚴(yán)重影響?；瘜W(xué)法中常采用硝酸作為氧化劑制得己二酸，實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的蒸氣和廢酸很難處理，并且導(dǎo)致氮氧化物(特別是氧化亞氮)的大量釋放。氧化亞氮是《京都議定書》中規(guī)定需減排的溫室氣體之一，它可參與光化學(xué)反應(yīng)，破壞臭氧層，導(dǎo)致全球變暖[19]，是國(guó)家制定有嚴(yán)格排放標(biāo)準(zhǔn)的大氣污染物[20]。而將氮氧化物還原為氮?dú)獾某杀竞芨?，無(wú)疑會(huì)大大增加己二酸的生產(chǎn)成本。其次，化學(xué)法合成己二酸中使用到的生產(chǎn)原料均來(lái)源于不具有再生性和可持續(xù)性的石油資源，無(wú)法實(shí)現(xiàn)可持續(xù)地生產(chǎn)也是現(xiàn)有的化學(xué)法生產(chǎn)己二酸中的一大難題。隨著己二酸需求的增長(zhǎng)、環(huán)境污染的加劇以及石油等不可再生資源的短缺，尋找一種高效環(huán)保地生產(chǎn)己二酸的生產(chǎn)方式成為大勢(shì)所趨。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，基于基因工程學(xué)、代謝工程學(xué)、合成生物學(xué)等眾多學(xué)科的生物合成方式被視為化學(xué)方法合成己二酸的一種有益補(bǔ)充。

2.3.2 己二酸的半生物合成方法

由于微生物中不存在天然的己二酸合成途徑，研究者們首先想到的是利用生物合成方法獲得己二酸的前體物質(zhì)，再利用化學(xué)方法將前體物質(zhì)轉(zhuǎn)化為己二酸。順，順-粘康酸屬于不飽和二元羧酸，其含有的共軛雙鍵能夠在金屬鉑的催化下加氫生成己二酸。利用生物合成法獲得順，順-粘康酸有以下兩種方式[21]：一種是利用芳香族化合物生物合成順，順-粘康酸，一些微生物如假單胞菌、短桿菌、不動(dòng)桿菌以及黃色桿菌可將苯甲酸、環(huán)己烷、環(huán)己醇、兒茶酚、苯酚等芳香族化合物轉(zhuǎn)化為順，順-粘康酸，但是該途徑的原料芳香族化合物仍主要來(lái)源于石油資源，不能從根本上解決原料不可再生的問(wèn)題；另一種方式是利用可再生的葡萄糖生物合成順，順-粘康酸，研究發(fā)現(xiàn)將來(lái)源于Klebsiellapneumonia的2個(gè)基因aroZ和aroY以及來(lái)源于Acinetobactercalcoaceticus的基因catA引入工程菌株中進(jìn)行表達(dá)，可以實(shí)現(xiàn)直接從葡萄糖合成順，順-粘康酸，另外通過(guò)菌種誘變、阻斷反饋抑制、更換表達(dá)質(zhì)粒等方式還可提高順，順-粘康酸的產(chǎn)量和產(chǎn)率。

利用葡萄糖為原料合成順，順-粘康酸這一生物合成途徑的成功構(gòu)建，使得間接生物合成己二酸成為可能，原料從有限的石油資源變成了無(wú)毒無(wú)害的葡萄糖，實(shí)現(xiàn)了原料的可再生性和可持續(xù)性。然而，從己二酸前體物質(zhì)順，順-粘康酸合成己二酸的這一步驟使用的仍是化學(xué)方法，需要貴重金屬鉑作為催化劑來(lái)催化加氫反應(yīng)，這勢(shì)必增加了己二酸的生產(chǎn)成本，且前體物質(zhì)相比于己二酸其市場(chǎng)價(jià)值更高，這種方法不具有經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢(shì)。因此研究者們開(kāi)始將目光轉(zhuǎn)向?qū)憾崛锖铣赏緩降难芯俊?/p>

2.3.3 己二酸的全生物合成方法

20世紀(jì)初，研究者在土壤棒桿菌基因中發(fā)現(xiàn)可以氧化環(huán)己醇的基因簇，能夠利用環(huán)己烷生物合成己二酸。但是以環(huán)烴類化合物作為底物，其來(lái)源仍舊受限，不符合原料的可持續(xù)性[22]。另外，生物體內(nèi)含有一種稱為ω 氧化的脂肪酸代謝途徑[23]，可以對(duì)脂肪酸進(jìn)行三次氧化生成己二酸。美國(guó)加利福尼亞州的工業(yè)生物技術(shù)公司Verdezyne于2012年獲得生物基己二酸生產(chǎn)的美國(guó)專利[24]，他們將工程酵母菌作為宿主菌，利用烷烴類、糖類物質(zhì)生產(chǎn)己二酸。此外，葡萄糖經(jīng)α-酮己二酸也可以合成己二酸[25]，該方法以葡萄糖為底物，經(jīng)過(guò)α-酮戊二酸、α-酮己二酸、α-酮庚二酸以及5-甲酰基戊酸這幾種物質(zhì)最終轉(zhuǎn)化為己二酸。

近些年來(lái)利用逆己二酸降解途徑合成己二酸得到了廣泛的報(bào)道[26]。逆己二酸降解途徑可利用乙酰輔酶A和琥珀酰輔酶A(圖3)，在一系列酶的作用下，將兩者聚合逐步合成己二酸。途徑中的關(guān)鍵酶包括琥珀酰輔酶A：乙酰輔酶A酰基轉(zhuǎn)移酶、3-羥酰輔酶A脫氫酶和3-羥基己二酰輔酶A脫氫酶、5-羰基-2-戊烯酰輔酶A還原酶、電子轉(zhuǎn)移黃素蛋白以及己二酰輔酶A合成酶。美國(guó)加利福尼亞州Genomatica公司在大腸桿菌中成功構(gòu)建了逆己二酸降解的合成途徑，但并沒(méi)有報(bào)道己二酸實(shí)際的產(chǎn)量和效價(jià)[18]。YU等[27]在大腸桿菌中表達(dá)逆己二酸降解途徑中的基因，經(jīng)過(guò)優(yōu)化的菌株AA1己二酸產(chǎn)量達(dá)到(639±34) μg/L。CHEONG等[28]基于逆己二酸降解途徑，通過(guò)敲除ldhA、poxB、pta、adhE、sucD基因使己二酸產(chǎn)量提高到2.5 g/L。DENG等[29]發(fā)現(xiàn)在褐色嗜熱裂孢菌(Thermobifidafusca)中存在天然的逆己二酸降解途徑(圖3)，且共有6種編碼基因進(jìn)行編碼，其中Tfu_0875編碼β-酮硫解酶，Tfu_2399編碼3-羥?；o酶A脫氫酶，Tfu_0067編碼3-羥基己二酰輔酶A脫氫酶，Tfu_1647編碼5-羰基-2-戊烯酰輔酶A還原酶，Tfu_2576及Tfu_2577共同編碼己二酰輔酶A合成酶。DENG等[29]將逆己二酸降解途徑導(dǎo)入到大腸桿菌中表達(dá)，通過(guò)模塊化重構(gòu)上述代謝途徑，發(fā)現(xiàn)5-羰基-2-戊烯酰-CoA還原酶(Tfu_1647)是該途徑高效積累己二酸的關(guān)鍵步驟。通過(guò)優(yōu)化啟動(dòng)子，實(shí)現(xiàn)了上述酶的高效表達(dá)。之后，對(duì)阻礙己二酸合成的競(jìng)爭(zhēng)性途徑進(jìn)行理性預(yù)測(cè)和調(diào)整，最終以甘油為底物，己二酸產(chǎn)量提高到了68 g/L[30]。

圖3 己二酸全生物合成途徑Fig.3 Biosynthesis pathway of adipic acid

2.4 其他二元羧酸的合成

對(duì)于碳原子較多的中鏈二元羧酸，目前工業(yè)上多采用化學(xué)方法生產(chǎn)。庚二酸的制備有氧化環(huán)酮法、烯烴類化合物合成法、金屬鈉還原異戊醇法等[31]。辛二酸可由蓖麻油或環(huán)辛烷經(jīng)氧化制得，壬二酸主要由不飽和脂肪酸發(fā)生氧化裂解反應(yīng)制得，其中最為常見(jiàn)原料是油酸，除此之外還可使用蓖麻油為原料[32]。癸二酸的化學(xué)法合成也依賴于蓖麻油為原料[33]，而微生物法則是利用石油餾分中分離制得的正癸烷，經(jīng)過(guò)熱帶假絲酵母氧化發(fā)酵，最終制得癸二酸[34]。以上碳鏈較長(zhǎng)的二元羧酸均難以在微生物體內(nèi)直接由便宜易得的常見(jiàn)發(fā)酵原料直接合成，目前國(guó)內(nèi)外幾乎沒(méi)有關(guān)于全生物發(fā)酵法合成的相關(guān)報(bào)道。隨著微生物領(lǐng)域基因工程、代謝工程、生物反應(yīng)工程等學(xué)科的不斷發(fā)展，發(fā)酵法將會(huì)是未來(lái)中鏈二元羧酸合成研究的一個(gè)可行方向。

3 總結(jié)與展望

目前，國(guó)內(nèi)外研究人員利用代謝工程手段改造工程菌株生產(chǎn)己二酸、戊二酸的研究雖然有一定進(jìn)展，但與琥珀酸相比還不夠成熟，遠(yuǎn)不能達(dá)到工業(yè)生產(chǎn)的需求。而碳數(shù)更多的中鏈二元羧酸更加難以由微生物合成，因此相關(guān)報(bào)道更加稀少?，F(xiàn)已有的化學(xué)法、回收法等生產(chǎn)中鏈二元羧酸的方法相對(duì)成熟且生產(chǎn)價(jià)格便宜、存在利潤(rùn)空間，在大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)中發(fā)酵法還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能取代化學(xué)法，但發(fā)酵法作為更加綠色環(huán)保的一種生產(chǎn)方式具有廣闊的前景，是未來(lái)大宗化學(xué)原料生產(chǎn)的大勢(shì)所趨。此外，相比于化學(xué)法，利用發(fā)酵法生產(chǎn)的中鏈二元羧酸應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、日化等與人類生活息息相關(guān)的產(chǎn)業(yè)相對(duì)更加安全，更易被消費(fèi)者所認(rèn)可和接受。因此，對(duì)于微生物發(fā)酵法生產(chǎn)中鏈二元羧酸的研究還需進(jìn)一步的深入，例如對(duì)現(xiàn)有途徑進(jìn)行改造，進(jìn)一步提高目的產(chǎn)物產(chǎn)量；分離耐受低pH的大腸桿菌突變菌株，或者使用酵母作為表達(dá)生產(chǎn)基因的宿主；采用多種方法增加宿主微生物對(duì)中鏈二元羧酸的耐受性，如適應(yīng)性進(jìn)化、直接進(jìn)化和基因工程手段等；尋找一條高效生產(chǎn)中鏈二元羧酸的通用代謝途徑，利用中鏈二元羧酸的結(jié)構(gòu)共性找到通用的特異性酶系，通過(guò)構(gòu)建通用平臺(tái)使中鏈二元羧酸的生物合成更加高效便捷。