基于SSR標(biāo)記的山西玉米自交系的核心種質(zhì)構(gòu)建

李 銳， 尚 霄， 尚春樹(shù)， 常利芳， 閆 蕾， 白建榮

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院， 太原 030031； 2.山西強(qiáng)盛種業(yè)有限公司， 太原 030031)

玉米大約于16世紀(jì)從美洲引入我國(guó)[1]，遺傳基礎(chǔ)相對(duì)狹窄一直是制約我國(guó)玉米育種的瓶頸。因此，種質(zhì)的擴(kuò)增、改良和創(chuàng)新是玉米育種的核心問(wèn)題[2-3]。目前玉米種質(zhì)資源與日俱增，其數(shù)目的龐大給種質(zhì)保存、評(píng)價(jià)、研究和利用增加了工作量及難度。因此，為提高種質(zhì)資源的管理質(zhì)量和效率，構(gòu)建玉米核心種質(zhì)十分必要和迫切。

澳大利亞學(xué)者Frankel在1984年第一次提出了核心種質(zhì)的想法， 即采取一定的取樣方法，用盡可能少的種質(zhì)材料最大可能代表整個(gè)資源的遺傳信息和多樣性[4]。早期對(duì)于核心種質(zhì)的構(gòu)建主要基于表型數(shù)據(jù)，雖易操作，但信息量少、易受環(huán)境影響而誤差大。分子標(biāo)記技術(shù)信息量大，不受環(huán)境影響，已經(jīng)成為構(gòu)建核心種質(zhì)的主要方法[5]。目前，分子標(biāo)記手段已經(jīng)成功應(yīng)用到玉米[6-9]、水稻[10]、籽用西瓜[11]、大白菜[12]、建蘭[13]、野生山胡椒[14]等多種作物核心種質(zhì)的構(gòu)建中。

由于復(fù)雜的地理環(huán)境與生產(chǎn)條件，山西省形成了5個(gè)玉米生態(tài)種植區(qū)域[15]，幾乎包括了全國(guó)乃至全世界的玉米生態(tài)類(lèi)型，每年審定的品種在100個(gè)以上。多年來(lái)，玉米育種團(tuán)隊(duì)在收集了大量國(guó)內(nèi)外玉米種質(zhì)的基礎(chǔ)上，改良、培育了許多符合不同生態(tài)條件的優(yōu)良自交系，這些自交系在很大程度上代表了山西玉米種質(zhì)的特點(diǎn)。因此，構(gòu)建山西玉米自交系的核心種質(zhì)庫(kù)具有實(shí)踐指導(dǎo)意義，也是亟待解決的問(wèn)題。本研究在用SSR分子標(biāo)記對(duì)這些優(yōu)良自交系進(jìn)行遺傳多樣性分析的基礎(chǔ)上，構(gòu)建其核心種質(zhì)，將為這些種質(zhì)的保存、重點(diǎn)研究和有效利用提供可靠的依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1試驗(yàn)材料

224份玉米自交系由山西強(qiáng)盛種業(yè)有限公司提供, 其中包括目前生產(chǎn)上主要推廣品種先玉335、先玉508、先玉696和鄭單958的親本自交系PH 6 WC(先玉335，先玉508，先玉696的母本)、PH 4 CV(先玉335父本)、PHB 1 M(先玉696的父本)、PH 5 AD(先玉508的父本)、鄭58(鄭單958母本)和昌7-2(鄭單958父本)。

1.1.2SSR引物

采用中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(NY/T 1432-2014《玉米品種鑒定DNA指紋方法》)的20 對(duì)核心引物和20 對(duì)輔助核心引物[16]。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1SSR分析及聚類(lèi)分析

DNA 提取、SSR分析及聚類(lèi)分析方法參見(jiàn)李銳等[17]的方法。

1.2.2取樣方法

本試驗(yàn)采用多次聚類(lèi)結(jié)合優(yōu)先取樣法。首先根據(jù)所有種質(zhì)遺傳相似度，將樣品進(jìn)行聚類(lèi)形成樹(shù)狀圖。在聚類(lèi)樹(shù)狀圖中，按照一定的相似度進(jìn)行分類(lèi)。每一類(lèi)中首先全部入選標(biāo)準(zhǔn)測(cè)驗(yàn)種和具有特異等位變異材料，然后從類(lèi)內(nèi)隨機(jī)抽取一個(gè)樣品保留進(jìn)入下一輪聚類(lèi)分析，若類(lèi)內(nèi)只有一個(gè)樣品則該樣品直接保留進(jìn)入下一輪聚類(lèi)分析。將所有保留的樣品再次聚類(lèi)，按之前同樣的方法取樣；再進(jìn)入下一輪聚類(lèi)、取樣，循環(huán)，直至所取樣品量達(dá)到理想取樣。

1.2.3核心種質(zhì)代表性檢驗(yàn)和評(píng)價(jià)

用等位變異數(shù)、多態(tài)位點(diǎn)數(shù)、基因多樣性、多態(tài)信息含量等指標(biāo)評(píng)價(jià)原始種質(zhì)和核心種質(zhì)的遺傳多樣性。

2 結(jié)果與分析

2.1 核心種質(zhì)庫(kù)的構(gòu)建及數(shù)據(jù)分析

利用40個(gè)SSR標(biāo)記的171個(gè)等位變異，對(duì)224個(gè)自交系進(jìn)行遺傳距離聚類(lèi)。在相似系數(shù)大約為0.71處可分為五大聚類(lèi)群, 依據(jù)各聚類(lèi)支中含有的不同種質(zhì)類(lèi)群的代表性自交系,確定類(lèi)群的名稱(chēng)(圖1)。從圖中看出，瑞德群、蘭卡斯特群是兩個(gè)最大的群，二者數(shù)量之和超過(guò)了材料的90%；有10份材料屬于唐四平頭群；另有10個(gè)自交系的類(lèi)群歸屬不明確，定為其他群。蘭卡斯特群可明顯看出，有335父本群、696與508父本群和其他蘭卡斯特群，即有亞類(lèi)分化趨勢(shì)。在此基礎(chǔ)上，再用最小距離逐步抽樣法進(jìn)行構(gòu)建核心種質(zhì)，即遺傳距離小于一定數(shù)值的種質(zhì)將首先被淘汰，但每次抽樣都保留標(biāo)準(zhǔn)測(cè)驗(yàn)種和具有特異等位變異的自交系。共抽樣8次，每次抽樣構(gòu)建自交系核心種質(zhì)的遺傳多樣性如表1。由表1可以看出，隨著抽樣種質(zhì)數(shù)目的減少，PIC和遺傳多樣性參數(shù)呈增加趨勢(shì)；等位基因數(shù)與多態(tài)性位點(diǎn)減少極少。分析每次抽樣后聚類(lèi)圖的類(lèi)群結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，抽樣6的聚類(lèi)圖仍然保持原始樣本的類(lèi)群劃分(圖2 )，但抽樣7和抽樣8的聚類(lèi)圖則不能保持原始樣本的類(lèi)群結(jié)構(gòu)。因此，抽樣6為最合適的核心種質(zhì)群體。

表1 聚類(lèi)優(yōu)先取樣下各備選核心種質(zhì)遺傳多樣性指數(shù)

圖1 基于SSR的224份原始玉米自交系聚類(lèi)分析

圖2 基于SSR 標(biāo)記的68份玉米核心自交系聚類(lèi)分析

2.2 核心種質(zhì)的確認(rèn)與評(píng)價(jià)

原始種質(zhì)224個(gè)自交系，依據(jù)30.36% 取樣比例構(gòu)建的核心種質(zhì)包含 68個(gè)自交系，剩下的 156 個(gè)自交系為保留種質(zhì)。對(duì)3組種質(zhì)的等位變異數(shù)、基因多樣性、多態(tài)信息量、多態(tài)位點(diǎn)數(shù)這 4 個(gè)遺傳參數(shù)進(jìn)行比較，結(jié)果如表2所示，核心種質(zhì)的多態(tài)信息含量(0.50)和基因多樣性(0.556 0)高于原始種質(zhì)(0.44；0.500 2)，等位變異數(shù)(4.20)和多態(tài)位點(diǎn)數(shù)(168)略小于原始種質(zhì)(4.28；171)。同時(shí)，核心種質(zhì)的這4個(gè)遺傳參數(shù)均大于保留種質(zhì)。3 組種質(zhì)的4個(gè)遺傳參數(shù)t檢驗(yàn)結(jié)果顯示，核心種質(zhì)與原始種質(zhì)、保留種質(zhì)和原始種質(zhì)均無(wú)明顯差異(p>0.05)(表3)。以30.36% 的取樣比例構(gòu)建的包含 68個(gè)玉米自交系的核心種質(zhì)能夠充分代表原始種質(zhì)的遺傳多樣性。

表2 核心種質(zhì)、保留種質(zhì)與原始種質(zhì)遺傳參數(shù)的比較

表3 核心種質(zhì)、保留種質(zhì)與原始種質(zhì)遺傳參數(shù)的t檢驗(yàn)

3 討 論

本研究根據(jù)30.36% 取樣比例構(gòu)建了224份玉米自交系的核心種質(zhì)。3 組種質(zhì)的4個(gè)遺傳參數(shù)t檢驗(yàn)結(jié)果表明，核心種質(zhì)與原始種質(zhì)、保留種質(zhì)和原始種質(zhì)之間均無(wú)明顯差異，充分反映了該核心種質(zhì)代表了原始種質(zhì)的遺傳多樣性，保留種質(zhì)也保留了原始種質(zhì)的遺傳多樣性。

核心種質(zhì)構(gòu)建是種質(zhì)資源研究的熱點(diǎn)，構(gòu)建核心種質(zhì)的目的是以最小的樣本數(shù)最大限度地代表原始樣本群體的遺傳多樣性，構(gòu)建的核心種質(zhì)要有代表性、異質(zhì)性和多樣性、類(lèi)型齊全。但是核心種質(zhì)遺傳代表性和數(shù)量之間存在非線性關(guān)系[17]，因此，取樣策略和取樣比例是構(gòu)建核心種質(zhì)的關(guān)鍵。本研究的原始樣本劃分為4類(lèi)雜種優(yōu)勢(shì)群，而玉米自交系的雜種優(yōu)勢(shì)類(lèi)群的劃分是玉米種質(zhì)分析的主要內(nèi)容和品種親本組配的重要依據(jù)，因而構(gòu)建的核心種質(zhì)也要保留原雜種優(yōu)勢(shì)類(lèi)群的特點(diǎn)，核心種質(zhì)構(gòu)建要考慮實(shí)際育種的需求和應(yīng)用，構(gòu)建好的核心種質(zhì)要有利于種質(zhì)的分析、保存和利用，不能盲目照搬已有的方法。因此，本研究采用多次聚類(lèi)結(jié)合優(yōu)先取樣法，即在構(gòu)建玉米自交系種質(zhì)的核心種質(zhì)時(shí)，雖然采用最小遺傳距離逐步抽樣法進(jìn)行，但是，首先抽選標(biāo)準(zhǔn)測(cè)驗(yàn)種將它們作為類(lèi)群劃分的標(biāo)準(zhǔn)，使每次的抽樣能反映其代表性；然后在其他抽樣時(shí)先入選有特異等位變異的材料，因?yàn)樗鼈兇砹嗽紭颖镜漠愘|(zhì)性和多樣性。每次循環(huán)聚類(lèi)都按照這個(gè)原則進(jìn)行。當(dāng)進(jìn)行到第7次抽樣聚類(lèi)圖顯示和原始樣本聚類(lèi)圖的類(lèi)群劃分不一樣時(shí)，就認(rèn)為第6次抽樣是合適的。研究結(jié)果顯示，原始樣本瑞德群的數(shù)量最多，但是核心種質(zhì)中瑞德群的數(shù)量減少了很多，說(shuō)明原始瑞德群中重復(fù)、冗余的樣本較多；核心種質(zhì)中其他群的數(shù)量相比原始群中其他群的數(shù)量相差不多。另外，本研究沒(méi)有預(yù)先劃定取樣比例，完全根據(jù)逐步取樣后能否完全反映原始樣本的遺傳多樣性為前提，這和李自超等[18]認(rèn)為各物種適宜的核心種質(zhì)規(guī)模應(yīng)按照具體物種的遺傳多樣性來(lái)定的思路是一致的。綜上表明，本研究采用的策略具有合理性和實(shí)用性。構(gòu)建的核心種質(zhì)將有利于育種人員對(duì)育種材料的評(píng)價(jià)、保存、研究和在育種中的有效利用。