四氯蟲酰胺對(duì)棉鈴蟲生物活性的溫度效應(yīng)及其解毒酶相關(guān)機(jī)制

竇亞楠，孫小諾，安靜杰，高占林，郭江龍，黨志紅，李耀發(fā)

(1.河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所/河北省農(nóng)業(yè)有害生物綜合防治工程技術(shù)研究中心/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北北部作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北保定 071000；2.保定市氣象局，河北保定 071000)

0 引 言

【研究意義】棉鈴蟲HelicoverpaarmigeraHübner是一種世界性害蟲，其寄主范圍廣，包括棉花、玉米、花生、大豆等200余種作物，也包括多種蔬菜、果樹、花卉等[1,2]。棉鈴蟲在我國從南到北各省均有不同程度的發(fā)生，其中長江流域、黃河流域和西北內(nèi)陸棉區(qū)受害最嚴(yán)重[3]。棉鈴蟲成蟲對(duì)棉花具有明顯的產(chǎn)卵偏好性，Bt棉花破壞了其寄主轉(zhuǎn)移過程，棉鈴蟲種群數(shù)量得到了有效控制[1]。2010年以來，隨著種植結(jié)構(gòu)調(diào)整，長江流域和黃河流域棉花種植面積不斷減少，玉米、蔬菜面積種植比率逐漸升高，棉鈴蟲在棉花之外的各寄主上的危害逐年加重，同時(shí)多地花生、油葵、大豆和番茄等作物及蔬菜均受到嚴(yán)重危害[4]。研究殺蟲劑的溫度效應(yīng)，分析其相關(guān)影響機(jī)制，對(duì)提高雙酰胺類殺蟲劑對(duì)棉蚜蟲的防治有實(shí)際意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】溫度不僅影響殺蟲劑自身的理化性質(zhì)，還能影響昆蟲的生長發(fā)育和新陳代謝，產(chǎn)生不同的溫度效應(yīng)[5]。已有研究發(fā)現(xiàn)，乙酰膽堿酯酶抑制劑類的有機(jī)磷類和氨基甲酸酯類殺蟲劑，通常被認(rèn)為是正溫度系數(shù)殺蟲劑[6-7]，而鈉離子通道抑制劑類的擬除蟲菊酯類殺蟲劑在低溫下的毒力顯著高于較高溫度，常表現(xiàn)為負(fù)溫度效應(yīng)[8]。對(duì)于不同種類昆蟲，同一種殺蟲劑也會(huì)出現(xiàn)不同程度的溫度效應(yīng)，比如辛硫磷對(duì)于麥長管蚜，在10～25℃表現(xiàn)為較顯著的正溫度效應(yīng)，而對(duì)于綠盲蝽來說，溫度對(duì)其生物活性的影響很小[9]。魚尼丁受體抑制劑雙酰胺類殺蟲劑對(duì)鱗翅目害蟲防治效果優(yōu)異，且對(duì)非靶標(biāo)生物安全，其中四氯蟲酰胺(tetrachlorantraniliprole)是沈陽化工研究院創(chuàng)制的雙酰胺類殺蟲劑品種，具有極高的應(yīng)用前景和開發(fā)價(jià)值[10]。研究表明，魚尼丁受體抑制劑類殺蟲劑對(duì)多種鱗翅目害蟲均為正溫度效應(yīng)，但其溫度效應(yīng)程度存在顯著差異[11-12]。昆蟲體內(nèi)重要的解毒酶系，羧酸酯酶(CarE)、多功能氧化酶(MFO)、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)以及尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶(UGT)，在機(jī)體代謝外源物質(zhì)、保護(hù)細(xì)胞免受急性毒性化學(xué)物質(zhì)攻擊中起重要作用[13]。經(jīng)不同殺蟲劑誘導(dǎo)之后，麥長管蚜GST活性與負(fù)溫度系數(shù)殺蟲劑密切相關(guān)，CarE則與正溫度系數(shù)殺蟲劑有關(guān)[14]；15～35℃誘導(dǎo)綠盲蝽解毒酶發(fā)現(xiàn)，GST參與了負(fù)溫度效應(yīng)殺蟲劑溴蟲腈的代謝[15]。【本研究切入點(diǎn)】昆蟲體內(nèi)解毒酶參與調(diào)節(jié)了殺蟲劑溫度效應(yīng)的影響機(jī)制，但有關(guān)于雙酰胺類殺蟲劑對(duì)鱗翅目害蟲溫度效應(yīng)解毒酶影響機(jī)制的研究卻未見系統(tǒng)報(bào)道。棉鈴蟲寄主種類多樣，其發(fā)生地區(qū)分布廣泛，有效控制棉鈴蟲種群的化學(xué)防治易受到如溫度等外界因素的影響，棉鈴蟲發(fā)生地區(qū)地理跨度大且發(fā)生歷期長，造成了其生境極大的溫度差異，影響藥劑防治效果。研究殺蟲劑的溫度效應(yīng)并分析其相關(guān)影響機(jī)制。【擬解決的關(guān)鍵問題】研究四氯蟲酰胺對(duì)棉鈴蟲生物活性的溫度效應(yīng)，測(cè)定不同溫度下經(jīng)四氯蟲酰胺影響后的棉鈴蟲體內(nèi)主要解毒酶的比活力，分析雙酰胺類殺蟲劑對(duì)棉鈴蟲溫度效應(yīng)的影響機(jī)制，為不同環(huán)境溫度下有效防治棉鈴蟲提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試?yán)ハx

棉鈴蟲HelicoverpaarmigeraHübner種群來源于河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所室內(nèi)長期飼養(yǎng)種群，在(25±1)℃、60%～70%RH和光暗比16 h∶8 h(L∶D)條件下以人工飼料飼養(yǎng)。挑選生理狀態(tài)一致，健康活潑的3齡幼蟲供試。

1.1.2 供試藥劑

94.1%四氯蟲酰胺原藥tetrachlorantraniliprole，沈陽科創(chuàng)化學(xué)品有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)所有步驟均在溫控室內(nèi)進(jìn)行，可調(diào)溫度范圍(10±0.5)℃～(35±0.5)℃。溫控室設(shè)有5個(gè)溫度，15、20、25、30和35℃，將試蟲提前24 h置于各個(gè)溫度下飼養(yǎng)以適應(yīng)溫度。將四氯蟲酰胺原藥用丙酮稀釋并配制成一定濃度的母液，再用0.1%吐溫80水溶液將其稀釋為5～7個(gè)濃度梯度備用。采用浸葉法測(cè)定四氯蟲酰胺對(duì)棉鈴蟲幼蟲的生物活性。將甘藍(lán)葉片用打孔器打成直徑1 cm的小圓片后，完全浸漬于藥液中30s，取出后于吸水紙上自然晾干后將提前饑餓2 h的試蟲接入其中。0.1%吐溫80水溶液作為對(duì)照。每個(gè)處理4次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)15頭試蟲，72 h后檢查試蟲死亡情況，以用鑷子輕觸蟲體無正常反應(yīng)為死亡標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2 解毒酶比活力測(cè)定

1.2.2.1 試蟲處理

取生物活性測(cè)定得到的各溫度下的0.1×LC50值為作為亞致死濃度，以0.1%吐溫80水溶液為對(duì)照，在各溫度下進(jìn)行藥劑處理，其余步驟同1.2.1生物活性測(cè)定方法。72 h后將試蟲挑入1.5 mL的離心管中，液氮速凍后保存至-80℃下備用。

1.2.2.2 酶源制備

按每0.04～0.06 g昆蟲加1 mL緩沖液的比例，向裝有試蟲的離心管中加入預(yù)冷的緩沖液，冰浴條件下充分研磨至勻漿，并在4℃、10 000 g條件下離心15 min，取上清液，混勻，冰浴待用。不同解毒酶選用不同的緩沖液，0.04 mol/L pH 7.0磷酸緩沖液用于CarE，0.05 mol/L pH 7.5 Tris-HCL緩沖液用于GST，0.1 mol/L pH 7.8磷酸緩沖液用于MFO，0.1 mol/L pH 7.6磷酸緩沖液用于UGT。

1.2.2.3 比活力

羧酸酯酶(CarE)比活力測(cè)定方法參照冉春等[16]；谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)參照Clark等[17]；多功能氧化酶(MFO)參照Kim等[18]；尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶(UGT)參照婁琳琳[19]和王夢(mèng)瑤[20]。

1.2.2.4 酶源蛋白質(zhì)

參考Bradford[21]考馬斯亮蘭藍(lán)G-250染色法測(cè)定酶源蛋白含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用DPS v6.55分析所得數(shù)據(jù)，得到各溫度下的生物活性回歸方程及LC50等參數(shù)。溫度系數(shù)記為各溫度與最低溫度的LC50值比值的絕對(duì)值，其中LC50隨溫度升高而降低，則在溫度系數(shù)之前標(biāo)“+”，反之則為“-”。各溫度與最低溫度下95%置信區(qū)間不重疊則溫度系數(shù)被認(rèn)為具有顯著性差異。

用Ducan’s多重比較分析不同溫度下各處理解毒酶比活力差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 四氯蟲酰胺對(duì)棉鈴蟲生物活性的溫度效應(yīng)

研究表明，四氯蟲酰胺在不同溫度下對(duì)棉鈴蟲的生物活性具有顯著差異，在15、20、25、30和35℃，其LC50分別為326.91、59.18、28.91、9.07和0.26 mg/L，15與35℃間LC50相差高達(dá)1 257.35倍。與15℃時(shí)相比，從20～35℃，其溫度系數(shù)由+5.52增長為+1 257.35，表現(xiàn)為極顯著的正溫度系數(shù)殺蟲劑。表1

表1 四氯蟲酰胺對(duì)棉鈴蟲生物活性的溫度效應(yīng)Table 1 Temperature effect on the bio-activity of tetrachlorantraniliprole to H. armigera

2.2 不同溫度下四氯蟲酰胺處理后棉鈴蟲體內(nèi)解毒酶比活力的變化

2.2.1 羧酸酯酶(CarE)

研究表明，不同溫度下棉鈴蟲CarE比活力均明顯高于對(duì)照。對(duì)照組CarE比活力在15℃最高為94.98 nmol/mg Pr.min而后隨溫度增長比活力下降，經(jīng)藥劑處理后，CraE比活力在15～30℃由110.67 nmol/mg Pr.min不斷增長至172.81 nmol/mg Pr.min，而在35℃出現(xiàn)下降趨勢(shì)，降至133.63 nmol/mg Pr.min。表2，圖1

2.2.2 谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)

研究表明，在供試溫度15～35℃，對(duì)照組GST比活力表現(xiàn)出一定的差異。在25℃時(shí)GST比活力達(dá)到最高為18.08 nmol/mg Pr.min，與其他溫度下的比活力相比差異較為顯著，出現(xiàn)明顯的“鐘型”曲線現(xiàn)象。經(jīng)四氯蟲酰胺處理后，GST比活力僅在15℃時(shí)略高于對(duì)照，為15.81 nmol/mg Pr.min，之后隨著溫度上升，其比活力迅速下降，20～35℃的GST比活力之間未出現(xiàn)顯著差異，但均顯著低于15℃。表2，圖1

2.2.3 多功能氧化酶(MFO)

研究表明，隨著溫度升高，對(duì)照組MFO比活力未出現(xiàn)顯著變化。經(jīng)四氯蟲酰胺處理后，MFO比活力均明顯低于對(duì)照，其比活力在15℃最高為620.55 nmol/mg Pr.30 min，從15到30℃間出現(xiàn)明顯下降趨勢(shì)，而隨溫度升高，其比活力從484.28 nmol/mg Pr.30 min(30℃)升至571.22 nmol/mg Pr.30 min(35℃)。表2，圖1

2.2.4 尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶(UGT)

研究表明，對(duì)照組的UGT比活力在15～30℃呈不斷上升趨勢(shì)，30℃時(shí)達(dá)到4.43ΔOD/mg Pr.20 min。而經(jīng)四氯蟲酰胺處理后，UGT比活力明顯高于對(duì)照，在15～20℃和30～35℃間呈下降趨勢(shì)，30℃下的比活力為8.43ΔOD/mg Pr.20 min，顯著高于其他溫度。表2，圖1

表2 四氯蟲酰胺處理后棉鈴蟲體內(nèi)4種解毒酶比活力變化Table 2 The variation of tetrachlorantraniliprole to the specific activities of four detoxification enzymes of H. armigera

注：四氯蟲酰胺處理后4種解毒酶比活力變化，其中A：CarE，B：GST，C：MFO，D：UGT

3 討 論

溫度對(duì)殺蟲劑生物活性的影響因子是多元的，藥劑在不同溫度下的揮發(fā)程度，在昆蟲表皮的滲透速度以及昆蟲體內(nèi)的解毒代謝均能引起殺蟲劑生物活性的差異[5]。有關(guān)于溫度和殺蟲劑對(duì)昆蟲的相關(guān)研究多為單一因素影響，而將三者相結(jié)合的研究相對(duì)較少且未成一定體系，不同昆蟲以及不同藥劑所表現(xiàn)的溫度效應(yīng)以及解毒酶等影響因素不盡相同。經(jīng)短期高溫處理后，33.5℃均能提高煙粉虱、蚜蟲和黃曲條跳甲的多種酶活性，而36℃則表現(xiàn)為抑制作用；對(duì)于毒死蜱抗性品系小菜蛾，在33.5℃下，其各種酶活力未受到顯著抑制，相較于33.5℃，36℃卻顯著抑制了其細(xì)胞色素P450含量[22]。小菜蛾經(jīng)四氯蟲酰胺亞致死濃度處理后，酯酶(EST)和MFO較對(duì)照組活性下降，但卻對(duì)GST表現(xiàn)為誘導(dǎo)作用；氯蟲苯甲酰胺處理家蠶24 h后，P450和GST活性顯著升高[23-24]。經(jīng)35℃高溫預(yù)處理后，煙粉虱對(duì)噻蟲嗪的敏感性增強(qiáng)，后經(jīng)解毒酶驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，高溫通過影響P450活性降低煙粉虱對(duì)噻蟲嗪的耐受性[25]。當(dāng)殺蟲劑和溫度同時(shí)作用于昆蟲時(shí)，馬云華[9]和劉佳[26]的研究分別發(fā)現(xiàn)了GST活性受誘導(dǎo)參與了擬除蟲菊酯和溴蟲腈對(duì)綠盲蝽的負(fù)溫度效應(yīng)的變化過程；安靜杰[27]在有關(guān)于綠盲蝽轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)正溫度系數(shù)殺蟲劑吡蟲啉亞致死濃度處理后，在35℃下綠盲蝽體內(nèi)P450、CarE和過氧化氫酶(CAT)相關(guān)基因差異表達(dá)顯著，對(duì)于負(fù)溫度系數(shù)殺蟲劑高效氯氰菊酯則在15℃更為顯著，UGT某些相關(guān)基因也參與其中。

四氯蟲酰胺對(duì)棉鈴蟲表現(xiàn)出了顯著的正溫度效應(yīng)，而從這4種解毒酶的比活力來看，在不同溫度下經(jīng)四氯蟲酰胺處理后，分別出現(xiàn)了不同的變化趨勢(shì)。隨著溫度的升高棉鈴蟲UGT比活力在30℃時(shí)達(dá)到最高，GST比活力在則25℃下出現(xiàn)峰值，這與劉佳等[15]在對(duì)綠盲蝽溫度效應(yīng)的研究結(jié)果中提到的“鐘型”曲線相似。經(jīng)四氯蟲酰胺亞致死劑量處理之后，15～35℃間GST和MFO比活力明顯低于對(duì)照，但GST在較低溫度15～20℃間的比活力隨溫度升高顯著降低，同時(shí)四氯蟲酰胺對(duì)棉鈴蟲的LC50在此溫度范圍內(nèi)由326.91 mg/L降至59.18 mg/L，兩者變化趨勢(shì)相符；MFO比活力在15～30℃出現(xiàn)下降現(xiàn)象，雖不及GST下降趨勢(shì)明顯但也同樣符合毒力隨溫度上升而增強(qiáng)的趨勢(shì)。CarE和UGT可能參與了四氯蟲酰胺的部分代謝，比活力較對(duì)照組顯著增強(qiáng)，但在15～30℃間總體與溫度表現(xiàn)為正相關(guān)，而與四氯蟲酰胺生物活性的溫度效應(yīng)未表現(xiàn)出明顯相關(guān)性，CarE和UGT雖然可能在對(duì)四氯蟲酰胺的解毒代謝中起到一定作用，但卻受溫度影響不明顯。

4 結(jié) 論

四氯蟲酰胺對(duì)棉鈴蟲表現(xiàn)出的正溫度效應(yīng)影響機(jī)制復(fù)雜，其正溫度效應(yīng)可能與GST和MFO有關(guān)，其中GST在15～20℃間比活力變化尤為顯著。而CarE和UGT則未發(fā)現(xiàn)與四氯蟲酰胺生物活性的正溫度效應(yīng)相關(guān)。