構(gòu)筑生物傳感器對氰化物的快速檢測

何海寧，劉海龍，楊光瑞，袁彩霞*，洪霞

1.甘肅中商食品質(zhì)量檢驗檢測有限公司（蘭州 730010）；2.甘肅省商業(yè)科技研究所有限公司（蘭州 730010）

乳制品安全是近年來食品安全的焦點之一[1-2]。檢測新技術(shù)運用滯后，部分標(biāo)準(zhǔn)缺乏，導(dǎo)致乳制品不安全事件屢禁不絕[3]。乳制品污染多見于原料乳的后期添加不當(dāng)，如為使乳及乳制品保鮮，向乳中添加過量硫氰酸鈉，若保存條件不當(dāng)會是硫氰酸轉(zhuǎn)化成氰基造成食品污染[4-5]；杏仁露中的有害物質(zhì)之一氰化物主要來源于配料苦杏仁及保存條件不當(dāng)產(chǎn)生[6-7]。研究表明，氰化物是一類有氰基（CN-）的劇毒化合物，氰根離子（CN-）進入人體后，主要作用于血液，能抑制組織細(xì)胞中40多種酶的活性引起整個細(xì)胞色素體系的氧化還原障礙，導(dǎo)致機體的氧化還原作用停止，造成細(xì)胞窒息，組織缺氧[8-10]。因此，為確保人類身體健康和食品安全，建立快速、有效、經(jīng)濟、環(huán)保的乳制品化學(xué)性污染的檢測具有重要意義[11-13]。

相關(guān)文獻顯示，食品中氰化物的檢測方法主要有分光光度法[14]、氣相色譜法[15]、離子色譜法[16]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀[17]、液相色譜法[19]等。但這些方法檢測效率低，干擾大，數(shù)據(jù)不可靠，不適用于杏仁露中氰化物的快速檢測[20]。因此，試驗設(shè)計一種用β-環(huán)糊精功能化石墨烯負(fù)載金納米粒子復(fù)合材料構(gòu)筑生物傳感器快速檢測復(fù)雜基質(zhì)杏仁露中氰化物的方法。采用β-環(huán)糊精功能化石墨烯，極大地提高石墨烯在水中的溶解度和分散性，功能化石墨烯表面負(fù)載金納米粒子復(fù)合物構(gòu)筑生物傳感器對杏仁露中氰化物具有很好的選擇吸附性。利用該納米復(fù)合物構(gòu)筑電化學(xué)生物傳感器對杏仁露中氰化物進行快速檢測，操作簡單快速、重現(xiàn)性好、選擇性高。數(shù)據(jù)可靠，干擾小，檢測的靈敏度高，分析速度快，實用性強。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

水中氰成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（99.8%，北京北方偉業(yè)計量技術(shù)研究院）；磷酸（99.8%，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；氯胺T（99.3%，中國計量科學(xué)研究院）；丙酮（色譜純，99.6%，西安市永紅化工原料公司）；正己烷（色譜純，99.6%，西安市永紅化工原料公司）；杏仁露樣品（蘭州市華聯(lián)超市同期生產(chǎn)的杏仁露）；二次蒸餾水。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平（XS 225A-SCS）；渦旋振蕩儀（GENIUS3）；移液管；吸耳球；臺式高速離心機（CF16RXⅡ）；超聲波清洗機（SB-100B）；電化學(xué)工作站（CHI600E）。

1.3 試驗方法

1.3.1 金納米粒子的制備

采用抗壞血酸還原法制備金納米粒子。制備過程：按體積比1∶1∶1.5∶25（總體積135～175 mL），分別取質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的氯金酸溶液、質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.7%的抗壞血酸溶液、摩爾體積濃度0.2 mol/L的碳酸鉀溶液和蒸餾水，將氯金酸溶液、碳酸鉀溶液和蒸餾水混勻，在攪拌的條件下加入抗壞血酸溶液，立即呈現(xiàn)紫紅色；加蒸餾水至500 mL，加熱至溶液變?yōu)橥该骷t色為止，制得粒徑為10～15 nm的金納米粒子。

1.3.2 氧化石墨烯表面的環(huán)氧功能化

按40 mL去離子水中加入10 mL質(zhì)量體積濃度8 mg/mL的氧化石墨烯懸浮液和1.5 mL環(huán)氧氯丙烷的比例，分別取去離子水、氧化石墨烯懸浮液和環(huán)氧氯丙烷，氧化石墨烯懸浮液加入去離子水中，超聲20～30 min，得到均一氧化石墨烯懸浮液；向該均一氧化石墨烯懸浮液中加入10%氫氧化鈉溶液，待均一氧化石墨烯懸浮液的pH 9.5～10.0后，逐滴加入環(huán)氧氯丙烷，在60～80 ℃的溫度下磁力攪拌3～4 h，離心，水洗3次，得環(huán)氧基團功能化氧化石墨烯。

1.3.3β-環(huán)糊精功能化石墨烯的制備

按質(zhì)量比1∶10～1∶15，分別取環(huán)氧基團功能化氧化石墨烯和β-環(huán)糊精，將環(huán)氧基團功能化氧化石墨烯完全溶解于pH 9.5～10的碳酸緩沖溶液中，加入β-環(huán)糊精，在60～70 ℃的溫度下磁力攪拌3～4 h，用14000 r/min的離心機離心10 min，水洗3次，冷凍干燥，得β-環(huán)糊精功能化的氧化石墨烯。

1.3.4 金納米粒子負(fù)載β-環(huán)糊精功能化石墨烯復(fù)合物的制備

按質(zhì)量比1∶6∶14分別取粉末狀的4-氨基苯硫酚、β-環(huán)糊精功能化的氧化石墨烯和金納米粒子，將4-氨基苯硫酚加入無水乙醇中，超聲溶解，加入β-環(huán)糊精功能化的氧化石墨烯，超聲30～40 min，加入金納米粒子，磁力攪拌20～24 h；離心分離，干燥。

1.3.5 杏仁露中氰化物的提取及衍生

將硫酸銨溶液作為蛋白沉淀劑，加入杏仁露中，通過鹽析法沉淀杏仁露中的蛋白質(zhì)，通過離心分離，取上清液定容，在定容后的上清液中加入0.2 mL（1+5）磷酸溶液，渦流混合，加入0.3 mL 10 g/L的氯胺T溶液，立即加蓋密封，渦流混合得到衍生液。

1.3.6 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

氰離子標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液的配制：將購買的水中氰成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配制成10 mg/L儲備液并于冰箱保存，使用時將其儲備液用水稀釋成質(zhì)量濃度為0，0.001，0.002，0.010，0.050和0.100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液。準(zhǔn)確移取10 mL標(biāo)準(zhǔn)工作溶液于頂空瓶中，加入0.2 mL磷酸溶液（1+5），渦流混合，加入0.3 mL 10 g/L的氯胺T溶液，立即加蓋密封，渦流混合得到衍生液。

1.3.7 電化學(xué)檢測

將裸玻碳電極利用三氧化二鋁粉末打磨干凈并在紅外燈下烘干；在打磨干凈的裸玻碳電極表面滴涂1～2滴1 mol/L功能化石墨烯復(fù)合物分散液，自然晾干作為工作電極；以鉑電極作為對電極，飽和甘汞電極作為參比電極，將構(gòu)成三電極電化學(xué)生物傳感體系放入杏仁露中氰化物衍生液中，在電壓-0.1～1.0 V，電流0～10 mA通過電化學(xué)工作站CHI600E可對氰化物的電化學(xué)性能進行研究。

2 結(jié)果與討論

2.1 β-環(huán)糊精功能化石墨烯負(fù)載金納米粒子復(fù)合材料的性能表征

圖1（A）和（B）分別是氧化石墨烯納米片的透射電子衍射圖和β-環(huán)糊精功能化石墨烯負(fù)載金納米粒子復(fù)合材料的掃描電子顯微鏡圖。從圖1（A）可以看出，氧化石墨烯表面的褶皺和每一個電子衍射區(qū)域，選定區(qū)域電子衍射模式說明利用化學(xué)法還原可以得到石墨烯納米片晶體結(jié)構(gòu)[21]。圖1（C）和（D）分別是β-環(huán)糊精功能化石墨烯負(fù)載金納米粒子復(fù)合材料的低倍和高倍透射電子衍射圖，金納米粒子均勻地分散在功能化石墨烯表面，金納米粒子的大小為3～10 nm。結(jié)果表明，在形成大小均勻、穩(wěn)定的金納米粒子過程中β-環(huán)糊精起著重要作用，并且在長時間超聲過程中金納米粒子也不會從石墨烯表面上脫落，這說明金納米粒子與功能化石墨烯表面具有強的相互作用。研究表明，金納米粒子的尺寸減小到納米尺度時，由于高的比表面積，表面原子數(shù)增多及表面原子配位不飽和性導(dǎo)致大量的懸掛鍵，使得納米顆粒的活性遠(yuǎn)高于相應(yīng)塊體材料[22]。墨烯表面的β-環(huán)糊精可以有效地阻止石墨烯納米片團聚使其活性面積降低[23]。由于金納米粒子和β-環(huán)糊精的特異性及石墨烯大比表面積，提高了該電化學(xué)生物傳感器的電化學(xué)性能。

圖1 透射電鏡和掃描電鏡圖

2.2 不同納米復(fù)合物構(gòu)筑電化學(xué)生物傳感器對杏仁露中氰化物快速檢測及性能研究

探究不同納米復(fù)合物構(gòu)筑電化學(xué)生物傳感器對杏仁露中氰化物快速檢測及性能，結(jié)果如圖2所示。與裸玻碳電極、金納米粒子修飾電極、石墨烯修飾電極相比較，該β-環(huán)糊精功能化石墨烯負(fù)載金納米粒子復(fù)合材料修飾電極對杏仁露氰化物具有很好的電化學(xué)響應(yīng)。

圖2 不同納米復(fù)合物構(gòu)筑電化學(xué)生物傳感器對杏仁露中氰化物快速檢測及性能研究對比

2.3 復(fù)合材料構(gòu)筑電化學(xué)生物傳感器對不同濃度氰化物吸附性能研究

為考察該生物傳感器的靈敏度及精確度，通過加標(biāo)方式探討該復(fù)合材料修飾電極對杏仁露不同濃度氰化物吸附性能。從圖3可以看出，該納米復(fù)合材料構(gòu)筑電化學(xué)生物傳感器對杏仁露中不同濃度氰化物具有良好線性關(guān)系，最低檢出限為0.0056 mg/L。

圖3 復(fù)合材料構(gòu)筑電化學(xué)生物傳感器對不同質(zhì)量濃度氰化物吸附性能研究

2.4 杏仁露氰化物提取過程中衍生劑用量的選擇

如圖4所示，利用不含苦杏仁的杏仁露陰性樣品作為分析物，準(zhǔn)確移取7份20 mL該杏仁露于頂空瓶中，編號為1，2，3，4，5，6和，編號1試樣作為空白，其他試樣分別加入20 μL 0.05 mg/L的氰離子標(biāo)準(zhǔn)儲備液，依次添加50，100，200，300，350，400和500 μL 10 g/L的氯胺T衍生劑溶液，從圖4可以觀察氯胺T的用量對響應(yīng)值的影響情況。由試驗數(shù)據(jù)可以看出，氯胺T用量達到300 μL后電化學(xué)響應(yīng)最好，即可獲得滿意的試驗結(jié)果。

圖4 杏仁露氰化物提取過程中衍生劑用量研究

2.5 衍生pH的選擇

根據(jù)有關(guān)文獻顯示，溶液的酸堿性對該傳感器有很的大影響，因此可以在頂空瓶中通過加入濃磷酸達到調(diào)節(jié)pH的目的，結(jié)果見圖5。通過觀察對電流響應(yīng)值的影響，結(jié)果表明，電流值隨著pH增大而增大，溶液pH在5.5～6.5范圍內(nèi)時電流沒有明顯差別，所以選用pH 6作為試驗條件。

圖5 衍生pH的選擇

2.6 沉積時間的選擇

沉積時間是影響傳感器電化學(xué)活性的主要因素之一，在陰性樣品中加入30 μL 0.01 mg/L的氰化物標(biāo)準(zhǔn)溶液后，沉積時間選擇20，30，35，40，50，55，60和65 min分別進行考察，結(jié)果見圖6。結(jié)果顯示，電極表面沉積時間50 min后即達到穩(wěn)定，故最終沉積時間選擇為50 min。

圖6 沉積時間

2.7 方法的回收率和精密度試驗

選用陰性杏仁露樣品作為基質(zhì)，取樣品1和樣品2各10 mL，分別加入30和50 μL 10 mg/L的氰離子標(biāo)準(zhǔn)儲備液進行2個濃度水平添加回收試驗，每個添加濃度水平做3個平行樣品。方法的回收率和精密度（用相對標(biāo)準(zhǔn)偏差SRSD表示）數(shù)據(jù)見表1。

3 結(jié)論

試驗提供一種用金納米粒子負(fù)載β-環(huán)糊精功能化石墨烯復(fù)合物構(gòu)筑電化學(xué)生物傳感器，并用該電化學(xué)生物傳感器快速檢測杏仁露中氰化物的方法，該方法作為一種新穎的方法相對于現(xiàn)有技術(shù)中的色譜法、光譜法、生化法等對杏仁露中氰化物具有很好的選擇性和穩(wěn)定性。該方法操作簡便、快捷，大幅縮短檢測周期，同時對人體和環(huán)境安全，是一種環(huán)保、經(jīng)濟、快速的檢測手段，試驗線性關(guān)系良好，準(zhǔn)確度和精密度較高，抗干擾小。該試驗為杏仁露的質(zhì)量保證提供支持，尤其是面對大批量樣品的檢測，更能體現(xiàn)方法的優(yōu)越性。