乳鐵蛋白對配方乳溶液益生菌存活率的影響

揭良，蘇米亞

乳業(yè)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海乳業(yè)生物工程技術(shù)研究中心，光明乳業(yè)股份有限公司乳業(yè)研究院（上海 200436）

母乳具有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)和活性免疫物質(zhì)，如益生菌、益生因子、乳鐵蛋白等[1]。嬰幼兒配方乳粉是除母乳外最佳的嬰兒食物來源，能最大限度地為嬰幼兒提供生長發(fā)育所需的營養(yǎng)和功能[2]。隨著科研工作者對母乳研究的不斷深入以及嬰幼兒營養(yǎng)科學(xué)知識利用的不斷發(fā)展，嬰幼兒配方乳粉得到一定的改進(jìn)和升級，特別是使其在營養(yǎng)組成上（蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、碳水化合物、免疫活性物質(zhì)、微量營養(yǎng)素等）和功能上（腸道健康、智力發(fā)育等），都更加接近于母乳。腸道菌群平衡的建立對于新生兒生命前期非常重要，腸道菌群異常或者建立遲緩都會嚴(yán)重影響嬰幼兒的生長發(fā)育[3-5]。大量研究證明，嬰幼兒食用帶有益生菌的配方粉可以有效維持腸道菌群平衡，能夠改善和緩解嬰幼兒常發(fā)生的一些疾病，如嬰幼兒腹瀉率、特應(yīng)性濕疹、機(jī)體免疫力弱使其易發(fā)生感染等[6-7]。近年來益生菌在嬰幼兒配方食品中得到廣泛的應(yīng)用，但由于益生菌是活體物質(zhì)，其最后能活著到達(dá)嬰兒腸道受較多因素影響，因此益生菌的存活情況尚不明確。大量的研究主要是集中在水分活度、胃腸道環(huán)境以及沖調(diào)溫度等對益生菌存活率的影響[8-9]，很少有研究嬰幼兒配方粉中的特定組分在沖調(diào)后對益生菌存活率的影響。

乳鐵蛋白是嬰幼兒配方粉中關(guān)注度比較高的一種功能性原料，是一種具有多種生理活性功能的非血紅素鐵結(jié)合蛋白。其主要存在于哺乳動(dòng)物的乳汁中，是母乳中對嬰兒免疫功能非常重要的一種營養(yǎng)物質(zhì)，成熟母乳中其質(zhì)量濃度在1.2～2.6 mg/mL之間，約占母乳總蛋白的20%[10]。奶粉生產(chǎn)企業(yè)會向嬰兒奶粉中添加從牛乳中分離濃縮出來的乳鐵蛋白，以達(dá)到提升產(chǎn)品的目的，因此乳鐵蛋白添加到嬰兒奶粉中不僅是一種趨勢，更是配方奶粉母乳化很重要的一個(gè)方面。乳鐵蛋白在嬰幼兒體內(nèi)的功能如提高嬰幼兒對鐵的吸收率、提高免疫以及增加抗病毒能力等，這些已經(jīng)得到證實(shí)[11-13]。但乳鐵蛋白對添加益生菌的配方乳溶液的益生菌的影響還不是很清楚，因此就不同濃度的乳鐵蛋白對嬰兒配方乳粉沖調(diào)后液內(nèi)益生菌的存活率進(jìn)行探究，以期為含益生菌和乳鐵蛋白的嬰幼兒配方乳粉的開發(fā)推薦提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

4款含有益生菌無乳鐵蛋白強(qiáng)化的不同品牌嬰兒配方乳粉（IF1動(dòng)物雙歧桿菌Bb-12；IF2乳雙歧桿菌Bi-07；IF3動(dòng)物雙歧桿菌Bb-12和乳雙歧桿菌HN019；IF4動(dòng)物雙歧桿菌Bb-12和乳雙歧桿菌HN019）：市售。乳鐵蛋白。

MRS固體培養(yǎng)基、平板計(jì)數(shù)固體培養(yǎng)基（青島高科園海博生物技術(shù)有限公司）；氯化鈉（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

A35型厭氧培養(yǎng)箱（英國Don whitley scientific公司）；冰箱BCD 259（海爾）；TE612-L型電子天平（德國Sartorius公司）。

1.3 方法

1.3.1 嬰兒配方乳粉中益生菌計(jì)數(shù)

參考并修改賈宏信[9]的方法。取25 g嬰兒乳粉，加入到225 mL 0.85%的無菌生理鹽水中（充分溶解），混勻。然后取1 mL加入到9 mL無菌生理鹽水內(nèi)進(jìn)行梯度稀釋。取稀釋倍數(shù)為104，105和106的稀釋液，取0.2 mL稀釋液加入到已傾注MRS培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上，進(jìn)行涂布試驗(yàn)。MRS傾注前進(jìn)行121 ℃ 15 min滅菌，待冷卻至45 ℃左右時(shí)再進(jìn)行傾注。每個(gè)平行重復(fù)3個(gè)平板。

1.3.2 乳鐵蛋白對益生菌存活量計(jì)數(shù)

國外嬰兒配方奶粉中乳鐵蛋白的添加量基本在0.5 mg/g左右，因此將不同品牌的嬰幼兒奶粉乳鐵蛋白添加到0.5 mg/g。取這些添加好乳鐵蛋白的嬰兒配方乳粉，依照該乳粉標(biāo)準(zhǔn)沖調(diào)法加入沖調(diào)所需體積溫開水（50 ℃），溫水直接沖調(diào)，混勻（2～5 min）后用自來水沖冷至35 ℃左右。然后放入冰箱冷藏24 h，并分別于0，8，16和24 h取1 mL溶液，用0.85%的生理鹽水進(jìn)行10倍梯度稀釋。最后取3個(gè)適宜的稀釋梯度進(jìn)行MRS培養(yǎng)基傾注試驗(yàn)。傾注試驗(yàn)同1.3.1節(jié)。

1.3.3 不同濃度乳鐵蛋白對益生菌存活量的影響

GB 14880—2012《食品營養(yǎng)強(qiáng)化劑使用標(biāo)準(zhǔn)》[14]中批準(zhǔn)允許在嬰兒配方奶粉中添加乳鐵蛋白，允許添加量≤1.0 mg/g，因此將嬰兒配方乳粉中乳鐵蛋白濃度調(diào)到0.25，0.5，0.75和1 mg/g，依照該乳粉標(biāo)準(zhǔn)沖調(diào)法加入沖調(diào)所需體積溫開水（50 ℃）直接沖調(diào)，混勻（2～5 min）后用自來水沖冷至35 ℃左右。然后放入冰箱冷藏24 h后，取1 mL溶液，用0.85%的生理鹽水進(jìn)行10倍梯度稀釋。最后取3個(gè)適宜的稀釋梯度進(jìn)行MRS培養(yǎng)基傾注試驗(yàn)。傾注試驗(yàn)同1.3.1節(jié)。

1.3.4 培養(yǎng)與計(jì)數(shù)

待傾注平板培養(yǎng)基冷卻凝固后，將稀釋好的含菌待測溶液進(jìn)行涂布，放置在厭氧箱內(nèi)37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h；雙歧桿菌的有效計(jì)數(shù)平板菌落數(shù)在30～300 CFU/平板。

1.4 數(shù)據(jù)處理

存活率的計(jì)算：以每種溫度每種沖調(diào)方式進(jìn)行的兩次平行試驗(yàn)計(jì)數(shù)的平均值與相對應(yīng)的各品牌的基礎(chǔ)檢測值相比計(jì)算所得。嬰兒配方乳粉沖調(diào)液各微生物數(shù)量變化的顯著性分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，顯著水平p≤0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 嬰兒配方乳粉中益生菌水平

益生菌的定義：益生菌是活的微生物，當(dāng)攝入充足的數(shù)量時(shí)，其對宿主產(chǎn)生一種有論證的功能性健康益處。從該定義中可見要攝入足夠活的數(shù)量才能成為益生菌[15]。由表1可知：市售的嬰兒配方乳粉活性益生菌以雙歧桿菌為主，且實(shí)際添加量均在1×106CFU/g以上，另有大量臨床研究表明攝入益生菌的量達(dá)到106CFU/g可以有效維持嬰幼兒腸道菌群平衡、降低嬰幼兒腹瀉、增強(qiáng)嬰幼兒機(jī)體免疫力，從而降低感染發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)，為嬰幼兒健康成長筑起鞏固的防線[16-17]。而通過統(tǒng)計(jì)中國市場上嬰幼兒奶粉發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)品牌的益生菌添加數(shù)量均在1×106CFU/g以上。不同益生菌在奶粉或者配方奶中存活差異很大，主要受環(huán)境和配方奶中組成成分和加工工藝的影響。因此要達(dá)到益生菌的有益功效，除了保證活的益生菌添加量達(dá)到一定數(shù)量外，還要確保在飲食前益生菌的存活率是否達(dá)到要求。

表1 不同品牌嬰兒配方乳粉益生菌的實(shí)際檢測值

2.2 含乳鐵蛋白配方乳長時(shí)間存放益生菌的變化

由圖1可知：在一般乳鐵蛋白添加量濃度（0.5 mg/g）下存放24 h，嬰兒配方乳的益生菌的數(shù)量未呈現(xiàn)出明顯的變化，與未含乳鐵蛋白的對照組變化趨勢相近，說明乳鐵蛋白在一般添加量下不會對奶粉沖調(diào)后益生菌有抑制作用。賈宏信[9]曾研究含益生菌奶粉沖調(diào)后置于5 ℃ 24 h的益生菌存活情況及菌落總數(shù)、大腸菌群和金黃色葡萄球菌的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)同一品牌的雙歧桿菌活菌數(shù)、菌落總數(shù)在不同儲藏時(shí)間內(nèi)均保持在同一水平，此次試驗(yàn)結(jié)果和其研究結(jié)果相似。益生菌含量有下降趨勢，但不顯著。因此含有一般添加量乳鐵蛋白的嬰兒配方乳粉沖調(diào)液5 ℃冷藏，完全能滿足保存含益生菌嬰兒配方乳粉沖調(diào)液的需求。

圖1 不同存放時(shí)間益生菌的存活變化

2.3 不同乳鐵蛋白濃度對益生菌存活率的影響

牛乳鐵蛋白是一種天然糖蛋白，具有廣譜抗菌活性[18]。根據(jù)GB 14880—2012的要求，調(diào)制乳粉的乳鐵蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0～100 mg/100 g之間，因此試驗(yàn)考察乳鐵蛋白在0～100 mg/100 g添加量時(shí)對乳粉中益生菌的影響，結(jié)果如圖2所示。與以不添加乳鐵蛋白的益生菌配方奶粉相比，整體上沖調(diào)冷藏后含有乳鐵蛋白的益生菌配方奶粉中的益生菌含量有下降的趨勢，且乳鐵蛋白添加量越大，益生菌下降越明顯，但添加量在100 mg/100 g內(nèi)的益生菌變化均不顯著。說明如果配方奶粉中同時(shí)添加益生菌和乳鐵蛋白，若乳鐵蛋白添加量較高，考慮到會有稍微的損失，益生菌添加量也應(yīng)稍高一點(diǎn)，從而能滿足保存含益生菌和乳鐵蛋白嬰兒配方乳粉沖調(diào)液的需求。

圖2 不同乳鐵蛋白濃度益生菌的存活影響

3 結(jié)論

益生菌奶粉沖調(diào)低溫冷藏存放24 h內(nèi)，配方乳的益生菌的數(shù)量不會出現(xiàn)明顯的降低。乳鐵蛋白添加量在50 mg/100 g內(nèi)的配方奶粉可以忽略乳鐵蛋白對益生菌的影響。而乳鐵蛋白在高添加量（大于50 mg/100 g）時(shí)，益生菌的質(zhì)量分?jǐn)?shù)有下降趨勢，因此未能滿足含益生菌和乳鐵蛋白嬰兒配方乳粉沖調(diào)液的需求。建議較不添加或者少量添加乳鐵蛋白的益生菌配方奶粉，在開發(fā)較高乳鐵蛋白添加量的益生菌奶粉時(shí)，應(yīng)該稍微提高益生菌的添加量，以保證在到達(dá)體內(nèi)時(shí)有足夠的活菌數(shù)。