基于RAGE-TLR4串?dāng)_的高糖影響牛肺泡巨噬細(xì)胞促炎細(xì)胞因子釋放的分子機(jī)制

譚天宇，才冬杰，茍麗萍，任志華，左之才

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，動(dòng)物疫病與人類(lèi)健康四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 611130)

葡萄糖是細(xì)胞重要的能量來(lái)源，但現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)高濃度的葡萄糖(以下簡(jiǎn)稱高糖)具有促進(jìn)炎癥反應(yīng)的作用[1-2]。在牛相關(guān)體外研究中已證實(shí)高糖能夠促進(jìn)牛肝細(xì)胞釋放促炎細(xì)胞因子，從血糖角度解釋了肝炎癥損傷的可能原因[3]。犢牛斷奶、運(yùn)輸?shù)葢?yīng)激與呼吸道疾病發(fā)病率、嚴(yán)重程度有關(guān)，并且在應(yīng)激過(guò)程中血糖顯著升高[4-5]，血糖升高也被認(rèn)為是影響牛呼吸道疾病綜合征嚴(yán)重程度的標(biāo)志物之一[6]。肺泡巨噬細(xì)胞是調(diào)節(jié)肺部炎癥反應(yīng)，維持肺炎癥微環(huán)境的免疫細(xì)胞[7]，在牛呼吸道疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[4]。然而葡萄糖濃度的升高對(duì)于牛肺泡巨噬細(xì)胞(bovine alveolar macrophages, BAMs)促炎細(xì)胞因子釋放的影響及其機(jī)制尚不清楚，缺乏相關(guān)研究。

目前研究發(fā)現(xiàn)，高糖能上調(diào)糖基化終末產(chǎn)物受體(receptor of advanced glycation end products，RAGE)與Toll樣受體4(toll-like receptor 4，TLR4)，活化下游核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)，從而促進(jìn)促炎細(xì)胞因子的合成與釋放[8-9]。當(dāng)RAGE與TLR4均被激活時(shí)會(huì)發(fā)生受體間串?dāng)_，對(duì)下游共同的信號(hào)通路NF-κB、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)等產(chǎn)生協(xié)同激活作用[10-11]。髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)是TLR4下游MyD88依賴途徑中重要的接頭分子[12]，有研究指出MyD88可能在RAGE信號(hào)通路中也發(fā)揮接頭分子的作用，傳導(dǎo)來(lái)自RAGE的炎癥信號(hào)[13]。但RAGE與TLR4能否協(xié)同上調(diào)MyD88的表達(dá)使其進(jìn)一步激活，尚未有研究證實(shí)。另外，受體間串?dāng)_也表現(xiàn)受體的功能與表達(dá)會(huì)互相影響，如抑制TLR4會(huì)一定程度抑制小鼠單核巨噬細(xì)胞TLR2的功能與表達(dá)[14]。但RAGE與TLR4是否通過(guò)受體間串?dāng)_互相影響對(duì)方的表達(dá)，尚未有研究報(bào)道。綜上所述，本試驗(yàn)探究高糖能否通過(guò)RAGE-TLR4串?dāng)_調(diào)控BAMs RAGE/TLR4/MyD88/NF-κB的激活及促炎因子的釋放，并進(jìn)一步探討RAGE/TLR4的潛在串?dāng)_機(jī)制，為研究高糖調(diào)控BAMs炎癥反應(yīng)的分子機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑

高糖DMEM、低糖DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自索萊寶(中國(guó))；胎牛血清購(gòu)自生工生物工程有限公司(中國(guó))；PremixTaq酶、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自寶生物公司(日本)；原代牛肺泡巨噬細(xì)胞采自健康牛新鮮肺部組織；β-actin、RAGE、TLR4、MyD88、NF-κB的實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)引物見(jiàn)表1,引物由生工生物工程有限公司合成。MyD88抗體(Fitzgerald，貨號(hào)70R-50098)、NF-κB p65抗體(CST，貨號(hào)C22B4)、RAGE抗體(Abcam，ab37647)、TLR4抗體(Proteintech，貨號(hào)19811-1-AP)、β-actin抗體(Abcam，ab8226)以及羊抗兔IgG-HRP(索萊寶，貨號(hào)SE134)。IL-1β、IL-6及TNF-α ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自江蘇晶美生物科技有限公司。

表1 各基因?qū)崟r(shí)熒光定量引物序列

1.2 方法

1.2.1 BAMs的采集與分組處理 參照文獻(xiàn)[15]中原代BAMs采集與鑒定方法，肺泡巨噬細(xì)胞陽(yáng)性率大于96%。采取眼觀健康無(wú)病變的新鮮且完整的牛肺，結(jié)扎氣管防止污染。用經(jīng)過(guò)高壓滅菌且含有200 IU·mL-1青霉素、200 μg·mL-1鏈霉素的PBS對(duì)肺表面進(jìn)行沖洗，并將PBS經(jīng)氣管灌入肺部，輕揉牛肺5 min，使用注射器收集灌洗液，重復(fù)灌洗3次。收集到的灌洗液經(jīng)200目尼龍紗布過(guò)濾，1 200 r·min-1離心6 min，收集細(xì)胞。PBS洗滌細(xì)胞，1 200 r·min-1離心6 min，用含10%胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，置于37 ℃二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 h。PBS洗去未貼壁細(xì)胞，消化重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×106個(gè)·mL-1，并通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)染色法計(jì)算細(xì)胞存活率，瑞氏染色法進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，墨汁吞噬試驗(yàn)計(jì)算巨噬細(xì)胞陽(yáng)性率。分裝于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3 h。3 h后將原代BAMs隨機(jī)分為正常對(duì)照組(NG，5.5 mmol·L-1葡萄糖)、高糖組(HG，25.5 mmol·L-1葡萄糖)、HG+FPS-ZM1(RAGE抑制劑，1 μmol·L-1)組、HG+TAK-242(TLR4抑制劑，10 μmol·L-1)組及DMSO組(DMSO占培養(yǎng)體系0.1%)培養(yǎng)12 h，抑制劑組在高糖處理前需用TAK-242或FPS-ZM1預(yù)處理1 h，每組設(shè)置3個(gè)平行。12 h后離心收集培養(yǎng)后的上清液及下層細(xì)胞，上清液用于ELISA檢測(cè)TNF-α、IL-1β、IL-6水平，下層細(xì)胞用于qRT-PCR檢測(cè)RAGE、TLR4、MyD88、NF-κB p65 mRNA相對(duì)表達(dá)水平及Western blot檢測(cè)RAGE、TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)BAMsRAGE、TLR4、MyD88和NF-κB p65 mRNA相對(duì)表達(dá)水平 對(duì)收集到的BAMs中總RNA采用Trizol法進(jìn)行提取，并測(cè)定總RNA濃度及純度，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到的cDNA置于-20 ℃保存?zhèn)溆?。以cDNA為模板，對(duì)每組RAGE、TLR4、MyD88和NF-κB p65的mRNA相對(duì)表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系：上下游引物各0.5 μL，PremixTaq5.0 μL，cDNA模板4.0 μL，總體系10 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min，95 ℃ 10 s，58 ℃ 30 s，循環(huán)40次，每個(gè)循環(huán)后檢測(cè)熒光強(qiáng)度值Cq。實(shí)時(shí)定量PCR的結(jié)果采用 2-△△Ct法進(jìn)行計(jì)算，用內(nèi)參基因β-actin對(duì)各基因表達(dá)水平均一化，2-△△Ct法計(jì)算公式: △Ct=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因，△△Ct=△Ct試驗(yàn)組-△Ct對(duì)照組。

1.2.3 Western blot檢測(cè)BAMs RAGE、TLR4、MyD88和NF-κB p65的蛋白相對(duì)表達(dá) 按每孔細(xì)胞加入150～250 μL裂解液的比例加入裂解液，至完全裂解。裂解后的樣品4 ℃高速離心吸取并上清，采用BCA法對(duì)蛋白質(zhì)定量后于-80 ℃保存待檢。調(diào)整每孔上樣蛋白量為15 μg，電泳程序?yàn)闈饪s膠80 V 20 min，分離膠120 V 60 min。蛋白樣品經(jīng)電泳分離后，采用半干式轉(zhuǎn)膜，25 V轉(zhuǎn)膜30 min。 使用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，與MyD88(1∶1 000)、 NF-κB p65(1∶1 000)、RAGE(1∶1 500)、 TLR4(1∶800)以及β-actin(1∶5 000)4 ℃孵育過(guò)夜，孵育一抗的膜用TBST洗滌3次，按照1∶1 000 稀釋HRP標(biāo)記的二抗，與膜37 ℃孵育1 h。用TBST洗滌3次，最后采用ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。

1.2.4 ELISA檢測(cè)BAM上清液中TNF-α，IL-1β，IL-6水平 吸取BAMs細(xì)胞培養(yǎng)液，離心收集上清。參照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)每組上清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平。

2 結(jié) 果

2.1 FPS-ZM1與TAK-242抑制高糖促進(jìn)的BAMs RAGE、TLR4、MyD88、NF-κB mRNA表達(dá)

HG組BAMs的RAGE、TLR4、MyD88以及NF-κB的基因表達(dá)水平均極顯著高于NG組(P<0.01)。HG+FPS-ZM1組RAGE、TLR4、MyD88、NF-κB基因表達(dá)水平顯著高于NG組(P<0.05)，但均極顯著低于HG組(P<0.01)。HG+TAK-242組RAGE、TLR4、MyD88、NF-κB基因表達(dá)水平顯著高于NG組(P<0.05)，但均極顯著低于HG組(P<0.01)。DMSO組與NG組各基因表達(dá)水平均無(wú)顯著差異(P>0.05)(圖1)。

結(jié)果表明，高糖能夠引起B(yǎng)AMsRAGE、TLR4、MyD88及NF-κB p65 mRNA表達(dá)上調(diào)，而TLR4抑制劑TAK-242與RAGE抑制劑FPS-ZM1均能抑制高糖引起的RAGE、MyD88、NF-κB p65 mRNA表達(dá)上調(diào)。其中，抑制RAGE能夠下調(diào)TLR4 mRNA相對(duì)表達(dá)水平，抑制TLR4能夠下調(diào)RAGEmRNA相對(duì)表達(dá)水平，并且抑制RAGE與TLR4均能下調(diào)MyD88與NF-κB p65 mRNA相對(duì)表達(dá)水平。由此說(shuō)明，高糖在處理BAMs細(xì)胞時(shí)在基因水平上產(chǎn)生了RAGE-TLR4串?dāng)_，對(duì)RAGE、TLR4本身的mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生影響，并協(xié)同促進(jìn)下游MyD88、NF-κB p65 mRNA轉(zhuǎn)錄。

與NG組相比，*.P<0.05差異顯著，**.P<0.01差異極顯著；與HG組相比，#.P<0.05差異顯著，##.P<0.01差異極顯著Compared with NG group, *.P<0.05, **.P<0.01; Compared with HG group,#.P<0.05,##.P<0.01圖1 高糖及高糖與不同抑制劑共處理對(duì)BAMs RAGE、TLR4、MyD88、NF-κB基因表達(dá)的影響Fig.1 Effects of high glucose, high glucose and different inhibitor treatments on BAMs gene expression of RAGE, TLR4, MyD88 and NF-κB

2.2 FPS-ZM1與TAK-242抑制高糖促進(jìn)的BAMs RAGE/TLR4/MyD88/NF-κB蛋白表達(dá)

HG組BAMs的RAGE、TLR4、MyD88以及NF-κB的蛋白表達(dá)水平均極顯著高于NG組(P<0.01)。HG+FPS-ZM1組RAGE、TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達(dá)水平顯著高于NG組(P<0.05)，但均極顯著低于HG組(P<0.01)。HG+TAK-242組RAGE、TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達(dá)水平顯著高于NG組(P<0.05)，但均極顯著低于HG組(P<0.01)。DMSO組與NG組各蛋白表達(dá)水平均無(wú)顯著差異(P>0.05)(圖2)。

與NG組相比，*.P<0.05差異顯著，**.P<0.01差異極顯著；與HG組相比，#.P<0.05差異顯著，##.P<0.01差異極顯著Compared with NG group, *.P<0.05, **.P<0.01; Compared with HG group,#.P<0.05,##.P<0.01圖2 高糖及高糖與不同抑制劑共處理對(duì)BAMs RAGE、TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達(dá)的影響Fig.2 Effects of high glucose and different inhibitor treatments on BAMs protein expression of RAGE, TLR4, MyD88 and NF-κB

高糖能夠引起B(yǎng)AMs RAGE、TLR4、MyD88及NF-κB p65 蛋白表達(dá)上調(diào)，而TLR4抑制劑TAK-242與RAGE抑制劑FPS-ZM1均能顯著抑制高糖引起的TLR4、RAGE、MyD88及NF-κB p65 蛋白表達(dá)上調(diào)。其中，抑制RAGE能夠下調(diào)TLR4 的蛋白表達(dá)，抑制TLR4能夠下調(diào)RAGE的蛋白表達(dá)，并且抑制RAGE與TLR4均能下調(diào)MyD88與NF-κB p65蛋白水平。由此說(shuō)明，高糖在處理BAMs細(xì)胞時(shí)在蛋白水平上產(chǎn)生了RAGE-TLR4串?dāng)_，對(duì)RAGE、TLR4本身的蛋白表達(dá)產(chǎn)生影響，并協(xié)同促進(jìn)下游MyD88、NF-κB p65 蛋白表達(dá)。

2.3 FPS-ZM1與TAK-242抑制高糖促進(jìn)的BAM促炎因子IL-1β、IL-6及TNF-α釋放

HG組BAMs培養(yǎng)上清液中IL-1β、IL-6及TNF-α蛋白濃度極顯著高于NG組(P<0.01)。HG+FPS-ZM1組IL-1β、IL-6及TNF-α蛋白濃度均極顯著高于NG組(P<0.01)，但均極顯著低于HG組(P<0.01)。HG+TAK-242組IL-1β、IL-6蛋白濃度顯著高于NG組(P<0.05)，TNF-α濃度極顯著高于NG組(P<0.01)，但均極顯著低于HG組(P<0.01)。DMSO組與NG組各蛋白表達(dá)水平均無(wú)顯著差異(P>0.05)(圖3)。

高糖能夠引起B(yǎng)AMs IL-1β、IL-6及TNF-α蛋白釋放增加，而TLR4抑制劑TAK-242與RAGE抑制劑FPS-ZM1均能顯著抑制高糖引起的IL-1β、IL-6及TNF-α蛋白釋放。

3 討 論

高糖可促進(jìn)炎癥反應(yīng)，引起機(jī)體IL-1β、 IL-6及TNF-α等促炎因子釋放[16-17]。高糖相關(guān)體外細(xì)胞試驗(yàn)中，25.5 mmol·L-1葡萄糖濃度是對(duì)于大部分體外培養(yǎng)細(xì)胞的高糖濃度，也是高糖相關(guān)研究的常用葡萄糖濃度[18-19]，因此本次研究采用25.5 mmol·L-1葡萄糖濃度作為高糖。在本次試驗(yàn)中，高糖處理能夠引起B(yǎng)AMs釋放促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-6及TNF-α，與前人研究結(jié)論相符。目前研究認(rèn)為高糖主要通過(guò)TLR4、RAGE等固有免疫受體，激活下游NF-κB促進(jìn)促炎細(xì)胞因子釋放[9, 20]，但受體下游信號(hào)途徑的傳導(dǎo)激活有待進(jìn)一步完善。Zhao等[21]研究發(fā)現(xiàn)，高糖能顯著上調(diào)視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞TLR4/NF-κB的mRNA和蛋白表達(dá)，并促進(jìn)促炎細(xì)胞因子TNF-α的分泌，而抑制TLR4能顯著抑制NF-κB mRNA、蛋白表達(dá)以及TNF-α的分泌，表明高糖能通過(guò)TLR4激活NF-κB， 促進(jìn)細(xì)胞分泌促炎因子TNF-α。詹聃婷等[22]研究發(fā)現(xiàn)，高糖能促進(jìn)人牙周膜成纖維細(xì)胞RAGE mRNA及蛋白表達(dá)，并促進(jìn)促炎細(xì)胞因子IL-6、TNF-α的分泌，而RAGE抑制劑FPS-ZM1能顯著抑制高糖引起的IL-6、TNF-α分泌。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高糖處理BAMs 12 h后，細(xì)胞RAGE、TLR4、MyD88及NF-κB mRNA和蛋白水平以及上清液中促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α濃度均顯著升高，并且抑制RAGE與TLR4能夠顯著抑制上述過(guò)程，與前人研究結(jié)果相符。

與NG組相比，*.P<0.05差異顯著，**.P<0.01差異極顯著；與HG組相比，#.P<0.05差異顯著，##.P<0.01差異極顯著Compared with NG group, *.P<0.05, **.P<0.01; Compared with HG group,#.P<0.05,##.P<0.01圖3 高糖及高糖與不同抑制劑共處理對(duì)BAMs IL-1β、IL-6及TNF-α釋放的影響Fig.3 Effects of high glucose and different inhibitor treatments on BAMs secretion of IL-1β, IL-6, TNF-α

RAGE與TLR4共享部分配體及下游炎癥信號(hào)通路，并在受體被激活時(shí)發(fā)生信號(hào)通路上的串?dāng)_，從而對(duì)下游部分信號(hào)通路產(chǎn)生協(xié)同激活作用[11, 23]。目前已有研究表明，RAGE與TLR4被激活后能夠?qū)ο掠喂餐盘?hào)途徑如MAPK、NF-κB產(chǎn)生協(xié)同激活作用[24-25]，但能否協(xié)同激活更多的下游信號(hào)通路有待進(jìn)一步研究。Sakaguchi等[13]研究指出，MyD88作為已知的TLR4下游關(guān)鍵接頭分子，可能與磷酸化的RAGE結(jié)合從而傳導(dǎo)來(lái)自RAGE的炎癥信號(hào)，但RAGE與TLR4能否協(xié)同激活MyD88尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，在高糖處理細(xì)胞前使用TLR4抑制劑TAK-242或RAGE抑制劑FPS-ZM1預(yù)處理BAMs 1 h，均能顯著抑制高糖引起的BAMs MyD88/NF-κB mRNA、蛋白表達(dá)上調(diào)以及促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的釋放，表明在高糖處理下，RAGE與TLR4能夠協(xié)同激活MyD88/NF-κB 信號(hào)通路，促進(jìn)BAMs炎癥反應(yīng)。另外，受體間串?dāng)_還表現(xiàn)為受體水平上的相互影響，主要表現(xiàn)出影響另一受體的功能、蛋白表達(dá)或跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，不同TLR之間的串?dāng)_在巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[26-27]，但尚未有RAGE與TLR4間受體相互影響的研究報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，TLR4抑制劑處理BAMs后能顯著抑制高糖引起的RAGE mRNA及蛋白表達(dá)上調(diào)，而RAGE抑制劑處理BAMs后能顯著抑制高糖引起的TLR4 mRNA及蛋白表達(dá)上調(diào)。即RAGE與TLR4互相影響另一受體的蛋白表達(dá)，表明RAGE與TLR4間存在著受體水平上的串?dāng)_，但RAGE與TLR4是否互相影響其受體功能和跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)有待進(jìn)一步研究。在結(jié)果中還發(fā)現(xiàn)RAGE抑制劑FPS-ZM1相較于TLR4抑制劑TAK-242，能引起更進(jìn)一步的TLR4表達(dá)抑制。TAK-242其主要功能并非抑制細(xì)胞TLR4表達(dá)，而是抑制細(xì)胞膜上TLR4的正常功能，引起下游MyD88/NF-κB信號(hào)減弱，通過(guò)負(fù)反饋調(diào)節(jié)使細(xì)胞TLR4表達(dá)受到抑制。而FPS-ZM1抑制RAGE正常功能后，也能引起MyD88/NF-κB信號(hào)減弱，但引起了更進(jìn)一步的TLR4表達(dá)抑制，這可能說(shuō)明RAGE除通過(guò)MyD88/NF-κB負(fù)反饋調(diào)節(jié)TLR4外，還存在其他串?dāng)_調(diào)控途徑，有待進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié) 論

高濃度的葡萄糖能夠通過(guò)RAGE-TLR4串?dāng)_引起B(yǎng)AMs釋放促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-6及TNF-α，促進(jìn)炎癥反應(yīng)。研究結(jié)果進(jìn)一步闡明了高濃度葡萄糖促進(jìn)細(xì)胞炎癥反應(yīng)的分子機(jī)制，RAGE與TLR4間的串?dāng)_機(jī)制可能成為后續(xù)研究的主要方向。