牛羊水間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)小鼠酒精性肝病的影響

紀(jì)洪兵，宋哈楠，趙詩宇，張 濤，關(guān)偉軍*

(1.佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，佳木斯 154007； 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193)

羊水間充質(zhì)干細(xì)胞(AF-MSCs)在20世紀(jì)初首次被分離和研究，其具有體外擴(kuò)增和緊密合成支架能力，是作為選擇胎兒組織構(gòu)建體工程的可靠且實(shí)用的細(xì)胞來源[1-2]。AF-MSCs廣泛應(yīng)用的原因主要是：1)AF-MSCs 可以在羊膜穿刺術(shù)期間收集，從原本會(huì)被丟棄的材料中分離出來，不會(huì)受到倫理爭論的影響；2)與其他胎兒來源的干細(xì)胞一樣，AF-MSCs便于儲(chǔ)存且成本較低；3)羊水是多能干細(xì)胞的來源，細(xì)胞群體易擴(kuò)大且能夠長期保存而不會(huì)產(chǎn)生不良影響，可以用于器官再生。與胚胎干細(xì)胞(ES)不同的是，羊水來源的干細(xì)胞在注射到裸鼠皮下時(shí)不會(huì)形成畸胎瘤[3]。AF-MSCs已經(jīng)應(yīng)用于抗腫瘤、神經(jīng)元再生、壞死性結(jié)腸炎、皮膚損傷及缺血性心臟病等研究中，能夠分泌多種細(xì)胞毒性細(xì)胞因子靶向作用癌細(xì)胞，使癌細(xì)胞凋亡；還可以分泌保護(hù)性、營養(yǎng)性因子促進(jìn)局部組織再生，顯示出其多能分化性、非致瘤性、低免疫原性、抗纖維化反應(yīng)[4-8]。經(jīng)過20多年的探索，我國國家家養(yǎng)動(dòng)物種質(zhì)資源庫成功建立，能夠保存各類遺傳物資，目前，已保存體細(xì)胞和干細(xì)胞約9萬余份。本研究中的牛AF-MSCs分離培養(yǎng)并純化后，代次小、活力好的優(yōu)質(zhì)細(xì)胞將入儲(chǔ)存庫用于資源保存，另一部分將入應(yīng)用庫用于后續(xù)生命科學(xué)研究。

酒精性肝病(ALD)是一種由過量飲酒引起的廣譜疾病，從早期的單純性脂肪變性、酒精性肝炎、肝硬化，到晚期的肝細(xì)胞癌。盡管有許多改善ALD預(yù)后的嘗試，但晚期ALD的治療仍然基于禁酒、短暫皮質(zhì)類固醇支持或肝移植等辦法。治療ALD的幾種方法主要是針對(duì)肝再生能力的恢復(fù)，如細(xì)胞因子誘導(dǎo)、干細(xì)胞移植和建立3D人工肝[9-12]。HIF-1α作為調(diào)節(jié)肝氧化應(yīng)激、脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵因子，參與低氧應(yīng)激基因的表達(dá)與氧穩(wěn)態(tài)平衡。VEGF是其最重要的下游調(diào)控基因之一，HIF-1α/VEGF信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞遷移及門靜脈高壓以及側(cè)支循環(huán)的建立均有一定影響，亦成為眾多疾病的致病機(jī)制及治療的靶標(biāo)。而TLR4與配體結(jié)合后，激活NF-κB，同時(shí)觸發(fā)宿主炎癥反應(yīng)中促炎性基因的表達(dá)、活化及炎癥因子釋放從而引起促炎作用。在自體骨相關(guān)髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)治療慢性肝病中，大多都涉及粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)動(dòng)員MSCs或直接采集并移入外周或肝血管系統(tǒng)，但臨床受試者樣本量少，病因亦不同，導(dǎo)致慢性肝病未來研究的方向仍不確定。有研究報(bào)道，自體AF-MSCs移植能改善四氯化碳(CCl4)導(dǎo)致的肝纖維化，并成功示蹤移植細(xì)胞在體內(nèi)的分布狀態(tài)[13]。而牛AF-MSCs用于小鼠ALD模型在國內(nèi)外鮮見報(bào)道。水飛薊賓膠囊(水飛薊素類)作為早期ALD、急慢性肝炎肝功能異?；謴?fù)的推薦藥物[14]，選取其作為本研究的陽性藥物，與牛AF-MSCs對(duì)比探討ALD小鼠的治療效果與其可能的作用機(jī)制，為臨床獸醫(yī)和臨床治療在細(xì)胞種屬與來源方面提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 4～5月齡雌性胎牛來自北京畜牧獸醫(yī)研究所昌平實(shí)驗(yàn)基地。48只SPF級(jí)ICR雄性小鼠， 6～8周齡，體重32～36 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)單位使用許可證編號(hào)SYXK(京)2019-0046。飼養(yǎng)于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)飼養(yǎng)室，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SCXK(京)2016-0006。

1.1.2 藥品 水飛薊賓膠囊，購自天津天士力圣特制藥，國藥準(zhǔn)字H20040299。

1.1.3 主要儀器及試劑 恒溫CO2培養(yǎng)箱購自德國賀利氏公司；離心機(jī)購自艾本德中國有限公司；TE-2000-E共聚焦顯微鏡購自日本尼康公司；多功能掃描成像分析系統(tǒng)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀均購自伯樂公司。L-DMEM、胎牛血清(FBS)、山羊血清均購自Gibco公司；胰蛋白酶(Trypsin1:250)、EDTA、DMSO、Triton-X100均購自Sigma公司；抗CD44、CD73、CD71、SSEA4、OCT4兔源抗體及山羊抗兔-FITC均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；Dil碘化物購自北京富百科生物技術(shù)有限公司；ALT、AST、TG測定試劑盒購自長春匯力生物技術(shù)有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量試劑盒均購自TaKaRa公司；動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒購自天根生化科技(上海)有限公司。

1.1.4 試劑配制 試劑配制參考Gao等[15]的研究。水飛薊賓膠囊內(nèi)容物溶劑：成年人210～420 mg · d-1，按體表面積劑量折算小鼠1.2～2.4 mg · d-1，將水飛薊賓膠囊內(nèi)容物1.2 mg溶于0.1 mL 56度紅星二鍋頭(現(xiàn)用現(xiàn)配)。

1.1.5 引物設(shè)計(jì)及合成 參照GenBank中牛、小鼠基因mRNA 序列設(shè)計(jì)同源引物，應(yīng)用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增各基因CDS區(qū)，引物信息見表1、2。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 PCR引物序列

1.2 方法

1.2.1 AF-MSCs分離培養(yǎng) 無菌條件下剖宮產(chǎn)后的胎牛(4～5月)，用冷藏箱在4～8 h內(nèi)運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室，在無菌條件下用50 mL注射器穿刺羊膜層，收集羊水，3 000 r · min-1離心9 min。用100 mL無菌離心管連續(xù)向同一離心管內(nèi)注入羊水收集細(xì)胞，將細(xì)胞以1×103個(gè) · mL-1接種到12孔板中，在37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育。接種后48 h，用PBS沖洗細(xì)胞2次，去除未貼壁細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到70%～80%融合時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.2 AF-MSCs的RT-PCR鑒定 選取P5代細(xì)胞當(dāng)融合至80%～90%時(shí)，TRIzol 1 ml裂解5 min； 轉(zhuǎn)移至無RNase EP管，200 μL氯仿劇烈震蕩，室溫靜置5 min；4 ℃，12 000 r · min-1離心15 min；取上層水相加入等體積異丙醇，震蕩后靜置15 min；4 ℃，12 000 r · min-1離心15 min；75%乙醇清洗管底沉淀，離心同上；晾干加入dH2O 30 μL，得到總RNA溶液。利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。 反轉(zhuǎn)錄條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 15 s，4 ℃保存。PCR反應(yīng)體系 20 μL：2 ×TaqPCR StarMix with Loading Dye 10 μL，RNase Free dH2O 7 μL，上、下游引物及cDNA模板各1 μL。擴(kuò)增條件：94 ℃ 5 min； 94 ℃ 1 min，60 ℃ 40 s，72 ℃ 50 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min。

1.2.3 AF-MSCs的免疫熒光鑒定 用37 ℃溫預(yù)4%多聚甲醛固定30 min，0.1% Triton X-100室溫通透15 min，PBS洗3次；1∶10山羊血清室溫封閉30 min；兔源CD29、CD73、SSEA4和OCT4一抗1∶100稀釋，4 ℃孵育過夜；FITC標(biāo)記二抗1∶100稀釋，室溫避光孵育1 h，PBS洗3次，每次5 min。DAPI核染，室溫15 min，PBS洗3次，激光共聚焦顯微鏡下拍照并觀察。

1.2.4 AF-MSCs成脂誘導(dǎo) L-DMEM+1 μmol · L-1地塞米松、5 μg · mL-1胰島素、0.5 mmol · L-1異丁基甲基黃嘌呤(IBMX)和60 μmol · L-1吲哚美辛的培養(yǎng)基中培養(yǎng)2周，每2 d更換一次誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

1.3 動(dòng)物模型制備與檢測

1.3.1 造模 48只ICR小鼠隨機(jī)分為4組：空白對(duì)照組(BC組)、模型對(duì)照組(MC組)、AF-MSCs組(MC+AF-MSCs組)、水飛薊賓膠囊(SC)組(MC+SC組)，每組12只。適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，第8天除BC組以外，其余試驗(yàn)組均以56度紅星二鍋頭灌胃，5 g · kg-1，2次 · d-1連續(xù)4周。第5周試驗(yàn)前12 h MC+AF-MSCs組小鼠禁食不禁水，麻醉后左肋下緣處縱開口0.5 cm，暴露肝左葉，將Dil標(biāo)記細(xì)胞懸液用微量注射器注射50 μL。同時(shí)MC+SC組行水飛薊賓膠囊內(nèi)容物溶劑灌胃，2次 · d-1共2.4 mg，共1 d。

1.3.2 小鼠血清檢測 2%戊巴比妥鈉麻醉小鼠后，眼球取血，室溫靜置30 min，3 000 r · min-1離心20 min分離血清。根據(jù)ALT、AST和TG測定試劑盒說明書，檢測特定波長OD值，根據(jù)公式換算活性。

1.3.3 肝組織HE及免疫組化染色 麻醉后取肝左葉組織固定液固定過夜后，常規(guī)脫水、石蠟和OCT包埋、切片，油紅O染色，光鏡下選取相同的病變區(qū)域準(zhǔn)確觀察肝小葉脂肪病變情況。

1.3.4 Dil標(biāo)記AF-MSCs Dil碘化物儲(chǔ)存液：Dil粉末10 mg，溶于10 mL DMSO溶解配置終濃度1 mmol·L-1于-20 ℃，避免反復(fù)凍融。稀釋儲(chǔ)存液至終濃度為5 μmol·L-1的工作液，P5代懸浮細(xì)胞(1×108個(gè)·mL-1)加入工作液中37 ℃孵育25 min， 1 000 r · min- 1離心5 min，棄上清，加入37 ℃基礎(chǔ)培養(yǎng)基1 mL。

1.3.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 小鼠麻醉后取肝尾狀葉迅速放置凍存管中液氮保存，利用動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒提取小鼠肝總RNA，并及時(shí)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，以cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。PCR反應(yīng)體系25 μL：cDNA 2 μL，上、下游引物各1 μL，TB Green Premix ExTaqⅡ 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s； 95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品最少進(jìn)行3個(gè)重復(fù)。

表2 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR引物序列

1.3.6 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)使用SPSS25.0軟件進(jìn)行單因素方差分析及鄧肯氏多重比較，用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，實(shí)時(shí)熒光定量PCR數(shù)據(jù)使用BC組歸一后進(jìn)行分析，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 AF-MSCs的形態(tài)

倒置相差顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，AF-MSCs接種72 h后貼壁至孔板的80%～90%；初次傳代48 h后，AF-MSCs與多種類型細(xì)胞混合生長；繼續(xù)傳至3～4代，其他類型細(xì)胞從群體中分離并消失，AF-MSCs呈現(xiàn)出獨(dú)特的漩渦狀，不同代次細(xì)胞之間形態(tài)無明顯差異，連續(xù)傳代后細(xì)胞形態(tài)保持穩(wěn)定(圖1)。

A. 原代培養(yǎng)72 h；B. P1代AF-MSCs與多種類型細(xì)胞混合生長；C. P3代呈現(xiàn)獨(dú)特漩渦狀A(yù). Primary culture for 72 h; B. Passage 1, many type cells type were mixed with the AF-MSCs; C. Passage 3, which displayed a unique vortex shape圖1 牛AF-MSCs形態(tài)Fig.1 Morphology of bovine AF-MSCs

2.2 AF-MSCs鑒定

2.2.1 RT-PCR擴(kuò)增及免疫熒光 RT-PCR結(jié)果顯示，CD44、CD73、SSEA、OCT4呈陽性表達(dá)，CD34和CD45呈陰性表達(dá)(圖2)；在AF-MSCs細(xì)胞中檢測CD29、CD73、SSEA4、OCT4表面標(biāo)記物，在共聚焦顯微鏡下掃描，結(jié)果表明，上述抗體均呈陽性細(xì)胞質(zhì)表達(dá)(圖3)，說明分離培養(yǎng)細(xì)胞為羊水間充質(zhì)干細(xì)胞。

M. DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1. GAPDH；2. CD44；3. CD73；4. SSEA；5. OCT4；6. CD34；7. CD45M. DL 600 DNA Marker; 1. GAPDH; 2. CD44; 3. CD73; 4. SSEA; 5. OCT4; 6. CD34; 7. CD45圖2 AF-MSCs表面標(biāo)記物RT-PCR檢測Fig.2 RT-PCR identification of AF-MSCs surface markers

圖3 AF-MSCs表面標(biāo)記熒光表達(dá)Fig.3 Immunofluorescence expression of AF-MSCs surface markers

2.2.2 誘導(dǎo)分化 在完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)的陰性對(duì)照細(xì)胞，油紅O染色呈陰性；在誘導(dǎo)14 d后，細(xì)胞內(nèi)可見脂滴出現(xiàn)。隨著成脂培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)間的延長，液滴的數(shù)量增加，小液滴聚集形成更大的液滴。油紅O染色陽性證明AF-MSCs脂肪細(xì)胞分化；RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，AF-MSCs誘導(dǎo)前PPAR-γ和LPL呈陰性表達(dá)，誘導(dǎo)后PPAR-γ和LPL呈陽性表達(dá)(圖4)。

2.3 AF-MSCs和SC對(duì)ALD小鼠血清ALT、AST和TG活性的影響

由圖5可知，與BC組相比，MC組ALT、AST和TG活性極顯著升高(P<0.01)；與MC組相比，MC+AF-MSCs組和MC+SC組ALT、AST和TG極顯著降低(P<0.01)；與MC+SC組相比，MC+AF-MSCs組ALT極顯著的降低(P<0.01)，AST顯著降低(P<0.05)，而TG活性無顯著差異(P>0.05)。該結(jié)果說明牛AF-MSCs移植與常規(guī)用藥均能改善肝功能，但牛AF-MSCs降低ALT、AST活性較SC顯著。

A. 對(duì)照組油紅O呈陰性；B. 成脂培養(yǎng)基誘導(dǎo)14 d，成纖維樣細(xì)胞變扁平并形成大脂滴；C. 對(duì)照組PPAR-γ、LPL均為陰性；D. 誘導(dǎo)組PPAR-γ、LPL均為陽性，GADPH作為內(nèi)參。1. GAPDH；2. LPL；3. PPAR-γ；M. DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)A. Control group were negative for oil red O dye; B. After induction for 14 d, AF-MSCs became fibroblast-like to oblate and formed large lipid droplets; C. PPAR-γ and LPL were negative in the control group; D. PPAR-γ and LPL were positive in the inducted group, GAPDH served as the internal control. 1. GAPDH；2. LPL；3. PPAR-γ；M. DL600DNA marker圖4 AF-MSCs成脂誘導(dǎo)形態(tài)學(xué)及脂肪細(xì)胞特異性基因RT-PCR檢測Fig.4 Lipid induction of AF-MSCs and detection of adipocyte-specific genes by RT-PCR

2.4 AF-MSCs和SC干預(yù)后ALD小鼠肝組織HE和油紅O染色情況

BC組肝組織無明顯病理改變，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝索排列整齊，肝血竇正常(圖6A、E)。經(jīng)4周酒精灌胃，MC組肝細(xì)胞邊界模糊出現(xiàn)脂肪滴及肝血竇充血等病理改變(圖6B)，且油紅O染色證實(shí)，肝細(xì)胞存在大量脂質(zhì)沉積(脂質(zhì)呈紅色，圖6F)；SC治療后炎癥細(xì)胞浸潤，但脂肪性變稍有輕微(圖6C、H)；AF-MSCs干預(yù)后脂肪滴及脂質(zhì)沉積范圍較MC+SC組明顯縮小(圖6D、G)。

肩標(biāo)不同小字母表示差異顯著(P<0.05)；肩標(biāo)不同大字母表示差異極顯著(P<0.01)；肩標(biāo)相同字母或無字母標(biāo)注表示差異不顯著(P>0.05)。下同Values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05); With different capital letter superscripts mean extremely significant difference (P<0.01);While with the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below圖5 小鼠血清ALT、AST和TG活性檢測Fig.5 Detection of ALT, AST and TG activities in serum of mice

2.5 Dil細(xì)胞示蹤移植AF-MSCs

熒光顯微鏡下觀察肝組織冰凍切片發(fā)現(xiàn)，未進(jìn)行細(xì)胞移植的冰凍切片在549 nm波長下Dil呈陰性(圖7A～C)。而 Dil標(biāo)記AF-MSCs移植后48 h，可見AF-MSCs分布在小鼠肝組織中，產(chǎn)生歸巢效應(yīng)并定植在受損組織周圍(圖7D～F)。

2.6 AF-MSCs和SC對(duì)ALD小鼠 HIF-1α、TLR4、VEGF基因表達(dá)量的影響

各組小鼠肝組織HIF-1α、TLR4、VEGF相對(duì)表達(dá)量見圖8。可知與BC組相比，MC組HIF-1α、TLR4、VEGF表達(dá)量均極顯著高(P<0.01)；與MC組相比，MC+AF-MSCs組及SC組表達(dá)三種基因均極顯著降低(P<0.01)。與MC+SC組相比，MC+AF-MSCs組極顯著低下調(diào)上述基因，其中經(jīng)AF-MSCs干預(yù)后的HIF-1α表達(dá)量趨于BC組。

A、E. BC組；B、F. MC組；C、H. MC+SC組；D、G. MC+AF-MSCs組A, E. Group BC; B, F. Group MC; C, H. Group MC+SC; D, G. Group MC+AF-MSCs圖6 小鼠肝組織HE染色(上排)及油紅O染色(下排)Fig.6 The HE staining (upper row) and oil red O staining (lower row) of mouse liver

A、D. Dil標(biāo)記熒光；B、E. DAPI核染；C、F. 疊加A, D. Luorescence labelled by Dil; B, E. DAPI nuclear dyeing; C, F. Merged圖7 Dil細(xì)胞示蹤劑標(biāo)記移植AF-MSCs冰凍切片F(xiàn)ig.7 Tissue freezing section of AF-MSCs labelled by Dil

圖8 HIF-1α、TLR4、VEGF基因mRNA表達(dá)量比較分析Fig.8 Comparative analysis of mRNA expression levels of HIF-1α、TLR4、VEGF genes

3 討 論

3.1 羊水間充質(zhì)干細(xì)胞

羊水來源MSCs因其在體外群體易擴(kuò)大、免疫原性低且及不涉及倫理糾紛等優(yōu)勢，比其他來源干細(xì)胞更適合用于再生醫(yī)學(xué)及基礎(chǔ)獸醫(yī)領(lǐng)域的研究。有研究將來自不同種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的睪丸間充質(zhì)干細(xì)胞移植到免疫缺陷小鼠后，供體細(xì)胞可在受體組織基底形成克隆，但向目的細(xì)胞分化不完整[16-17]。油紅O染色及RT-PCR結(jié)果顯示，AF-MSCs中出現(xiàn)橘紅色脂肪滴、PPAR-γ和LPLmRNA呈陽性表達(dá)，說明AF-MSCs可誘導(dǎo)向脂肪細(xì)胞進(jìn)行分化。據(jù)報(bào)道，AF-MSCs分離初期，與其混合生長的上皮樣細(xì)胞和纖維樣細(xì)胞分別來源于胎兒皮膚、尿液和纖維結(jié)締組織、真皮成纖維細(xì)胞[18]，本研究研究分離的AF-MSCs傳至3、4代后，細(xì)胞得以純化，這與Prusa等[19]的研究結(jié)果相似。Dario[20]報(bào)道的人羊水來源的干細(xì)胞表達(dá)CD29、CD44、CD73和OCT4等特異性標(biāo)志，但不表達(dá)CD45和CD34，這與本研究結(jié)果相一致，說明AF-MSCs與胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)共表達(dá)OCT4，且有研究表明[21]，OCT4在牛卵母細(xì)胞和早期胚胎發(fā)育過程中均有表達(dá)，也說明AF-MSCs可能具有與ES細(xì)胞相似的特征。本試驗(yàn)結(jié)果標(biāo)明，試驗(yàn)成功分離到牛AF-MSCs并有誘導(dǎo)成脂分化的能力。

3.2 AF-MSCs對(duì)ALD小鼠的影響

至今ALD的發(fā)病機(jī)制尚不明確，但研究表明，主要機(jī)制涉及氧化應(yīng)激、炎癥作用、腸道菌群易位、細(xì)胞死亡和再生障礙等[22-25]。長期飲酒會(huì)增加肝的耗氧量，導(dǎo)致肝中樞及周圍缺氧，HIF-1α作為在低氧狀態(tài)下發(fā)揮活性的轉(zhuǎn)錄因子，在常氧情況下α亞基在特定的脯氨酸殘基處被羥基化，從而使腫瘤抑制因子泛素化，泛素化將其靶向于蛋白酶體降解；在低氧情況下α亞基穩(wěn)定并易位至細(xì)胞核，在其中與HIF-1β二聚化并調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)。Nath等[26]報(bào)道，當(dāng)HIF-1α缺失時(shí)，小鼠肝脂肪性變減輕及血清TG活性降低。而本研究通過qRT-PCR檢測各組小鼠肝HIF-1α相對(duì)表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)長期飲酒會(huì)導(dǎo)致肝中HIF-1α水平升高和活化，在HIF-1α表達(dá)降低時(shí)，肝脂肪沉積及血清TG活性均顯著減輕，與其結(jié)果相一致。本研究細(xì)胞示蹤結(jié)果顯示，經(jīng)肝外移植的牛AF-MSCs成功定植并向受損肝組織部位歸巢，完成了干細(xì)胞有效治療的必要條件。且MSCs具有趨化性，在靜脈注射后，能響應(yīng)炎癥條件并附著于內(nèi)皮，并在內(nèi)皮細(xì)胞之間向受損組織遷移。本研究中qRT-PCR結(jié)果顯示，經(jīng)AF-MSCs干預(yù)的肝組織中VEGFmRNA水平降低，說明植入的細(xì)胞可抑制VEGF表達(dá)，使血管通透性恢復(fù)，進(jìn)而改善肝血竇充血，Zhang等[27]利用斑馬魚模型證明，急性酒精暴露經(jīng)治療后，通過對(duì)血管內(nèi)皮生長因子受體(VEGFR)活性的阻斷，不能與其配體結(jié)合發(fā)揮分子作用從而改善肝脂肪變性、血管生成來增強(qiáng)肝修復(fù)，與本試驗(yàn)結(jié)果相符。本研究中，牛AF-MSCs下調(diào)ALD小鼠肝組織中TLR4，其主要來源可能位于肝細(xì)胞而非髓系細(xì)胞，原因在于Jia等[28]曾報(bào)道，敲除小鼠肝細(xì)胞和髓系細(xì)胞中TLR4，在急性酗酒模型中肝細(xì)胞TLR4缺陷小鼠的血清ALT、TG含量降低。相反，髓系細(xì)胞中缺失TLR4則不影響酒精脂肪肝的發(fā)展。本試驗(yàn)對(duì)比了牛AF-MSCs與SC對(duì)酒精導(dǎo)致的小鼠肝損傷在血清學(xué)、病理學(xué)及基因表達(dá)的影響，研究初步結(jié)果顯示，牛AF-MSCs干預(yù)后小鼠存活率達(dá)到100%且治療的效果優(yōu)于SC。這對(duì)今后基礎(chǔ)獸醫(yī)研究異種干細(xì)胞移植治療慢性肝病及臨床治療ALD方面提供了有效參考，同時(shí)也可考慮將干細(xì)胞移植的來源目標(biāo)轉(zhuǎn)移至家養(yǎng)動(dòng)物身上，在再生醫(yī)學(xué)中生產(chǎn)并推廣應(yīng)用。

4 結(jié) 論

本研究成功分離、培養(yǎng)并鑒定了牛AF-MSCs，移植入ALD小鼠后，證實(shí)對(duì)降低血清ALT、AST及TG在體內(nèi)的活性以及減輕肝脂肪性變是有效的。牛AF-MSCs在一定程度上能抑制HIF-1α/VEGF信號(hào)通路，下調(diào)TLR4的表達(dá)，其綜合效果優(yōu)于SC。提示牛AF-MSCs對(duì)小鼠ALD病程中的肝功能具有改善作用。