和厚樸酚抑制結(jié)腸癌SW620細(xì)胞增殖與TGF-β1/p38 MAPK/Hippo信號(hào)傳導(dǎo)的關(guān)系

劉曉璐，馬 妍，劉榮興，李 沁，孫文娟，何百成

( 1. 重慶市生物化學(xué)與分子藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，2．重慶醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室，重慶 400016；3.武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，湖北 武漢 430072)

迄今為止，結(jié)腸癌仍是消化系統(tǒng)的主要惡性腫瘤之一。隨著技術(shù)和醫(yī)學(xué)的發(fā)展，在過(guò)去的幾十年中，結(jié)腸癌的早期篩查，診斷和治療得到了極大的發(fā)展。但是，預(yù)后仍遠(yuǎn)未達(dá)到預(yù)期。因此，仍然迫切需要開發(fā)用于結(jié)腸癌的毒性較小且有效的藥物。來(lái)自天然產(chǎn)物或其衍生物的具有抗癌活性的化合物已長(zhǎng)期用于結(jié)腸癌治療，例如長(zhǎng)春新堿，紫杉醇，喜樹堿等[1]。因此，天然產(chǎn)物可能是化學(xué)治療劑的非常重要的來(lái)源。和厚樸酚(honokiol，HNK)，一種雙酚天然產(chǎn)物，從木蘭屬植物的樹皮和葉片中分離出來(lái)。據(jù)報(bào)道，HNK對(duì)乳腺癌，肺癌，白血病和結(jié)腸癌等多種癌癥具有抗癌活性。我們以前的研究表明，HNK還可以在HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞中明顯抑制增殖并誘導(dǎo)凋亡[2]，這支持HNK可能是潛在的抗癌藥物。然而，尚不清楚HNK的這種生物學(xué)功能的分子機(jī)制。前期研究發(fā)現(xiàn)，HNK能夠抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡，這種作用可能與上調(diào)TGF-β1并通過(guò)p38 MAPK信號(hào)通路來(lái)促進(jìn)YAP磷酸化有關(guān)，但具體的分子機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞 人結(jié)腸癌SW620細(xì)胞和HEK-293細(xì)胞從American Type Culture Collection(ATCC)購(gòu)買。細(xì)胞在37 ℃，5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基。

1.1.2試劑 和厚樸酚購(gòu)自西安昊軒生物科技有限公司(純度為99.9%)。實(shí)驗(yàn)所用抗體TGF-β1(lot:00082431)、BAD(lot:00073982)、BCl-2(lot:00078323) 和 PCNA(lot:00076208)購(gòu)自 Santa Cruz Biotechnology公司;一抗YAP(lot:00091404)、p-YAP(lot:#46g0742)購(gòu)自Affinity公司，結(jié)晶紫購(gòu)自北京索萊寶有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分為實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度的HNK，對(duì)照組用相同體積的DMSO進(jìn)行處理。

1.3 結(jié)晶紫染色檢測(cè)細(xì)胞增殖將細(xì)胞鋪于24孔板中，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)用不同濃度的藥物(15、20、25、30、35 μmol·L-1)處理后，于24、48、72 h進(jìn)行染色處理。具體步驟如下：棄去廢液，用PBS潤(rùn)洗細(xì)胞兩次，然后將200 μL結(jié)晶紫染色液加入孔中，室溫下染色20 min，然后用清水洗盡染色液。將孔板晾干后進(jìn)行掃描，將圖像保存、分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 集落形成實(shí)驗(yàn)將細(xì)胞鋪于24孔板中，加入不同濃度的藥物(20、25、30 μmol·L-1)并作用48 h，將細(xì)胞消化后按500個(gè)/孔的細(xì)胞密度進(jìn)行稀釋，將細(xì)胞重鋪于12孔板中，于37 ℃孵化箱中培養(yǎng)兩周，之后用結(jié)晶紫染色液在室溫下染色20 min，掃描并保存圖像。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期與凋亡將細(xì)胞鋪于6孔板中，細(xì)胞密度為2×105個(gè)/孔，在用不同濃度的藥物(20、25、30 μmol·L-1)處理后，于24 h收集細(xì)胞，棄去培養(yǎng)基，用PBS潤(rùn)洗細(xì)胞兩次，用不含EDTA的胰蛋白酶消化細(xì)胞，再將細(xì)胞收集到1.5 mL EP管中，離心，條件為1 000 r·min-1，5 min，棄去廢液，再用PBS重懸細(xì)胞后離心，條件為1 000 r·min-1，5 min，重復(fù)2次。用1 mL 75%冰乙醇溶液固定細(xì)胞并重懸分散，立即送檢。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。當(dāng)檢測(cè)凋亡時(shí)，在最后一步，用PBS離心2次之后，用 1 mL PBS 重懸再送檢。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 Western blot 實(shí)驗(yàn)將細(xì)胞接種在6孔板中，并根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)用不同濃度的藥物(20、25、30 μmol·L-1)處理。于24 h和48 h將所有細(xì)胞均用PBS(4 ℃)沖洗兩次，然后裂解，收集并煮沸10 min使其變性。所有樣品均用SDS-PAGE凝膠電泳，然后轉(zhuǎn)到PVDF膜上。在用相應(yīng)的一抗和二抗處理后，采用ECL試劑盒顯影并保存圖像。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 重組腺病毒構(gòu)建TGF-β1重組腺病毒的構(gòu)建采用AdEasy系統(tǒng)構(gòu)建。從EST克隆中擴(kuò)增了人TGF-β1的編碼序列和綠色熒光蛋白(GFP)，然后，將TGF-β1的PCR片段克隆到穿梭載體中，并用骨架質(zhì)粒進(jìn)行重組。將重組載體線性化并轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞中，用于包裝重組腺病毒，命名為TGF-β1。用綠色熒光蛋白(GFP)或紅色熒光蛋白(RFP)標(biāo)記重組腺病毒以追蹤病毒，重組腺病毒僅表達(dá)GFP(AdGFP)作為載體對(duì)照。

2 結(jié)果

2.1 HNK對(duì)SW620細(xì)胞增殖的影響結(jié)晶紫染色法檢測(cè)結(jié)果顯示，HNK可以明顯抑制結(jié)腸癌SW620細(xì)胞的增殖，并且抑制作用強(qiáng)弱與作用時(shí)間和藥物濃度成正比(Fig 1A)。同時(shí)，Western blot結(jié)果表明，HNK能夠上調(diào)SW620細(xì)胞中增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)的表達(dá)水平(Fig 1C)。流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示，HNK可將細(xì)胞周期阻滯在G1期(Fig 1E)。集落形成實(shí)驗(yàn)也證明HNK可以明顯抑制集落的形成(Fig 1F)。以上結(jié)果提示，HNK能夠抑制結(jié)腸癌SW620細(xì)胞增殖。

Fig 1 Effects of HNK on proliferation in SW620 cells

2.2 HNK對(duì)SW620 細(xì)胞凋亡的影響通過(guò)Western blot結(jié)果分析顯示，HNK可以上調(diào)SW620細(xì)胞中Bad的蛋白水平，同時(shí)下調(diào)Bcl-2的蛋白水平(Fig 2A)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示，HNK誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其作用效果具有濃度和時(shí)間依賴性(Fig 2C)。結(jié)果提示，HNK能夠促進(jìn)SW620細(xì)胞凋亡。

Fig 2 Effects of HNK on apoptosis in SW620 cells

2.3 HNK對(duì)SW620細(xì)胞中TGF-β1表達(dá)水平的影響TGF-β1信號(hào)的異常與結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，因此我們接下來(lái)確定HNK是否可以調(diào)節(jié)結(jié)腸SW620細(xì)胞中TGF-β1的表達(dá)。Western blot實(shí)驗(yàn)表明，HNK可以明顯地增加SW620細(xì)胞中TGF-β1的蛋白表達(dá)水平，使其濃度呈劑量依賴性上升(Fig 3A)。

Fig 3 Effects of HNK on TGF-β1 in SW620 cells

2.4 HNK對(duì)SW620細(xì)胞中p38 MAPK的影響Western blot結(jié)果顯示，HNK對(duì)smad2/3總蛋白以及磷酸化smad2/3水平無(wú)明顯影響，但能明顯增加磷酸化p38 MAPK的蛋白水平(Fig 4A，B)。結(jié)果提示，HNK抑制 SW620 細(xì)胞增殖可能與促進(jìn) p38 MAPK磷酸化有關(guān)。

Fig 4 Effects of HNK on p38 MAPK in SW620 cells

2.5 TGF-β1介導(dǎo)HNK對(duì)SW620細(xì)胞中p38 MAPK磷酸化的影響為了探究TGF-β1在對(duì)p38 MAPK信號(hào)的調(diào)控過(guò)程中的作用，通過(guò)Western blot結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)TGF-β1腺病毒可以明顯增強(qiáng)HNK上調(diào)SW620細(xì)胞中磷酸化p38的作用，相反，TGF-β1抑制劑則減弱HNK促進(jìn)p38 MAPK磷酸化的作用(Fig 5A, B)。以上結(jié)果提示，TGF-β1對(duì)HNK的抗癌活性的作用至少可以通過(guò)p38 MAPK信號(hào)來(lái)傳導(dǎo)。

Fig 5 Effects of TGF-β1 mediated HNK on p38 MAPK phosphorylation in SW620 cells

2.6 HNK對(duì)SW620細(xì)胞中YAP的影響YAP是Hippo信號(hào)通路下游的轉(zhuǎn)錄共激活因子，通路中其他成員通過(guò)磷酸化負(fù)調(diào)控YAP，來(lái)實(shí)現(xiàn)該通路的生物學(xué)功能。Western blot結(jié)果表明，HNK促進(jìn)了SW620細(xì)胞中YAP的磷酸化(Fig 6A)。

Fig 6 Effects of HNK on YAP in SW620 cells

2.7 TGF-β1介導(dǎo)HNK對(duì)SW620細(xì)胞中YAP的影響Western blot分析結(jié)果顯示，TGF-β1的過(guò)表達(dá)可以增強(qiáng)HNK促進(jìn)YAP磷酸化的作用，而TGF-β1抑制劑則部分逆轉(zhuǎn)了這種作用(Fig 7A, B)。以上結(jié)果提示，TGF-β1可介導(dǎo)HNK促進(jìn)YAP磷酸化。

Fig 7 Effects of TGF-β1 mediated HNK on p-YAP in SW620 cells

2.8 p38 MAPK介導(dǎo)HNK對(duì)SW620細(xì)胞中YAP的影響Western blot結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比，p38 MAPK抑制劑能夠明顯抑制YAP磷酸化(Fig 8A)，結(jié)果提示，HNK可能通過(guò)激活p38 MAPK來(lái)促進(jìn)YAP磷酸化。

Fig 8 Effects of p38 MAPK inhibitor and HNK on p-YAP in SW620 cells

3 討論

結(jié)腸癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，目前是中國(guó)第五大高發(fā)癌癥，預(yù)后遠(yuǎn)不如目前預(yù)期[3]。因此，仍然非常需要為其開發(fā)有效的藥物。HNK是從木蘭皮中提取的活性化合物，擁有多種藥理活性，例如抗炎、抗癌等[4]。但是這些作用的分子機(jī)制尚不清楚。在這項(xiàng)研究中，我們驗(yàn)證了HNK在結(jié)腸癌細(xì)胞中的抗癌活性，并探討了這種生物學(xué)功能的潛在機(jī)制。我們發(fā)現(xiàn)，HNK可以抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)并促進(jìn)其凋亡。HNK在結(jié)腸癌中的抗癌活性可以通過(guò)上調(diào)TGF-β1來(lái)介導(dǎo)，以激活p38 MAPK信號(hào)通路并促進(jìn)YAP的磷酸化。

TGF-β是一個(gè)超家族，可調(diào)節(jié)胚胎的發(fā)育，細(xì)胞分化，凋亡和其他生物學(xué)過(guò)程。其中含量最高，表達(dá)最多的亞型是TGF-β1，而且TGF-β1是與腫瘤發(fā)生關(guān)系最密切的亞型[5]。我們之前的研究發(fā)現(xiàn)，漢防己甲素通過(guò)上調(diào)結(jié)腸癌中的TGF-β1表現(xiàn)出有效的抗癌活性[6]。因此，我們推測(cè)HNK在結(jié)腸癌中的抗癌活性也可能與TGF-β1有關(guān)。在這項(xiàng)研究中，我們發(fā)現(xiàn)HNK可以上調(diào)SW620細(xì)胞中TGF-β1的表達(dá)，這種作用與HNK的濃度成正比。

p38 MAPK通路是細(xì)胞增殖、應(yīng)激、炎癥、分化、轉(zhuǎn)化、凋亡等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的共同交匯通路之一，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起到關(guān)鍵性的作用[7]。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，在結(jié)腸癌細(xì)胞中活化p38 MAPK能抑制結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)[8]。結(jié)果顯示，HNK能夠上調(diào)p38 MAPK的磷酸化水平，提示HNK抑制SW620細(xì)胞增殖的作用很可能與激活p38 MAPK通路有關(guān)。進(jìn)一步的研究結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)TGF-β1腺病毒能夠增強(qiáng)HNK上調(diào)磷酸化p38 MAPK表達(dá)的作用，而TGF-β1抑制劑則作用相反，這提示我們HNK對(duì)p38 MAPK信號(hào)通路的調(diào)控作用可能是通過(guò)上調(diào)TGF-β1的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)。

Hippo信號(hào)通路是一條通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和凋亡而參與器官大小控制、組織再生、免疫應(yīng)答、干細(xì)胞功能和腫瘤抑制的途徑[9]。在許多癌癥類型中都觀察到高YAP和TAZ活性,因?yàn)槠湔{(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡的作用，一旦功能失調(diào)就會(huì)導(dǎo)致惡性腫瘤。經(jīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，HNK能夠上調(diào)磷酸化YAP蛋白的表達(dá)水平，減少YAP的入核轉(zhuǎn)錄，抑制SW620細(xì)胞的增殖，在過(guò)表達(dá)TGF-β1之后，磷酸化YAP水平明顯增強(qiáng)，而TGF-β1抑制劑則減弱了HNK上調(diào)磷酸化YAP的作用。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，YAP可能受p38 MAPK調(diào)控，在這兩條信號(hào)通路之間可能存在一定的串?dāng)_[10-11]，我們隨后檢測(cè)了p38 MAPK抑制劑對(duì)YAP水平的影響，發(fā)現(xiàn)p38 MAPK抑制劑減弱了HNK磷酸化YAP蛋白的作用，以上結(jié)果提示，HNK對(duì)SW620細(xì)胞的抑制增殖作用可能是通過(guò)激活p38 MAPK信號(hào)通路從而調(diào)控磷酸化YAP的表達(dá)水平實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，HNK可能通過(guò)上調(diào)TGF-β1的功能來(lái)使激活p38 MAPK信號(hào)通路并上調(diào)磷酸化YAP來(lái)介導(dǎo)HNK的抗腫瘤作用。