槲皮素對(duì)牙髓間充質(zhì)細(xì)胞成骨能力及兔顱骨缺損修復(fù)的影響

胡韶光，劉珂珂，汪芹芹，韓 旭，桂雙英，徐 燕

(1．安徽醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，安徽醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院，安徽省口腔疾病研究中心實(shí)驗(yàn)室， 安徽 合肥 230032；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院， 安徽 合肥 230012)

牙周病作為一種常見的口腔疾病，是導(dǎo)致牙齒脫落的主要原因，同時(shí)也會(huì)造成全身性影響[1]。牙周治療的主要目標(biāo)是阻止慢性炎癥過程，恢復(fù)牙周附著和喪失的牙槽骨以及防止牙周袋的形成，從而保護(hù)天然牙列[2]。牙周炎造成的骨缺損往往難以恢復(fù)，近年來通過組織工程的方法，利用種子細(xì)胞，細(xì)胞外基質(zhì)/支架材料，信號(hào)/生長因子可以促進(jìn)軟硬組織再生[3]。牙髓間充質(zhì)細(xì)胞(human dental pulp mesenchymal stromal cells，hDPSCs)具有較好的增殖潛力，又能多系分化，非常適合作為種子細(xì)胞[4]。槲皮素(quercetin)是一種常見的黃酮類化合物，可以從蜂膠中大量獲得，它具有多種生物學(xué)活性，包括抗炎、抗氧化和抗凋亡等[5]。此外槲皮素具有保護(hù)作用，能夠防止骨質(zhì)流失，同時(shí)促進(jìn)成骨細(xì)胞形成[6]。為了探索槲皮素是否能夠加強(qiáng)牙周組織工程的成骨效果，本文重點(diǎn)研究槲皮素對(duì)體外培養(yǎng)的hDPSCs成骨能力的影響，并致力探究將其用于組織工程，在體內(nèi)促進(jìn)成骨的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1主要試劑與儀器 槲皮素(MCE，美國，25265)；Bio-Oss?(Geistlich，瑞士，81900483)；胎牛血清(BI，以色列，2030101)；DMEM 培養(yǎng)基(HyClone，美國，AF29498406)； 0.25%胰蛋白酶(碧云天，中國，200601091)；青鏈霉素(碧云天，中國，190901084)；CCK-8試劑盒(Dojindo，日本，PG657)；地塞米松(索萊寶，中國，20190424)；維生素C(索萊寶，中國，20200615)；β-甘油磷酸鈉(Sigma，美國，MKDL3872)；茜素紅S(Sigma，美國，MKCF4917)；堿性磷酸酶檢測(cè)試劑盒(碧云天，中國，061820200929),BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒(碧云天，中國，031820200525)；人間充質(zhì)干細(xì)胞流式抗體(CD73、CD44、CD34、CD45)(BD，美國，8341000、9099646、9212666、8533548)；PrimeScriptTMRT Master Mix 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，TB Green?Premix Ex TaqTMqPCR試劑盒(TaKaRa，日本，AK51810A)；引物(β-actin，BMP2，Runx2，OPN，OCN)(上海生工，中國，1923361079-88)；戊巴比妥(Sigma，美國，MKAF3846)。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 ♂新西蘭兔10只，2.5-3.0 kg，購自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心并提供飼養(yǎng)。經(jīng)由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(LLSC20190122)。

1.2 方法

1.2.1hDPSCs分離培養(yǎng)與傳代 實(shí)驗(yàn)所需牙髓組織來源于安徽醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔頜面外科，年齡為18-30周歲患者的完整無齲正畸減數(shù)拔除的前磨牙，拔除后置于含5%雙抗的DMEM取材液中。在超凈工作臺(tái)中用含有2%雙抗的PBS反復(fù)沖洗牙齒表面。將牙髓組織取出后剪碎放入含有1 ∶1混合的I型膠原酶和中性蛋白酶的EP管中，37 ℃培養(yǎng)箱中消化15 min后加入等體積完全培養(yǎng)液終止消化。10 000 r·min-1離心5 min，棄上清。將消化好的組織塊移入6孔板中，上方覆蓋一枚蓋玻片，加入含1%雙抗20%胎牛血清(FBS)的完全培養(yǎng)液，放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待組織塊周圍有細(xì)胞爬出并達(dá)蓋玻片的80%左右時(shí)，使用含0.25% EDTA的胰蛋白酶消化細(xì)胞，并按1 ∶3比例傳代，10% FBS完全培養(yǎng)液培養(yǎng)。

1.2.2流式細(xì)胞術(shù)鑒定hDPSCs表面標(biāo)志物 取生長狀況良好的第3代細(xì)胞(P3)用PBS清洗2遍，胰酶消化離心，PBS重懸，清洗過篩。使用CountStar細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，以1×106個(gè)細(xì)胞分裝至5個(gè)流式管后，分別加入表面抗體CD73、CD44、CD34、CD45和陰性對(duì)照，37 ℃避光孵育30 min，PBS清洗后上CytoFLEX分析流式細(xì)胞儀鑒定。

1.2.3細(xì)胞增殖檢測(cè) 將P3代細(xì)胞，加入胰酶消化，離心，用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。將各組細(xì)胞按密度5×103個(gè)/孔，接種到96孔板中。置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)基，用PBS清洗，分組加入培養(yǎng)液，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。其中對(duì)照組(Control組)：加入等量DMSO的完全培養(yǎng)基；實(shí)驗(yàn)組：含有不同濃度槲皮素的完全培養(yǎng)基。槲皮素濃度分別為0.01、0.1、1、10、100 μmol·L-1，連續(xù)培養(yǎng)3 d，分別在24、48、72 h時(shí)加入CCK-8孵育2 h后，酶標(biāo)儀測(cè)量450nm處吸光度值(A值)。

1.2.4堿性磷酸酶(ALP)定量檢測(cè) 將狀態(tài)良好的P3代細(xì)胞以1×104個(gè)/孔接種到96孔板中，待細(xì)胞融合至70%-80%時(shí)，加入含不同濃度槲皮素的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基(含50 μmol·L-1抗壞血酸，10 mmol·L-1β-甘油磷酸鈉，100 nmol·L-1地塞米松)，設(shè)常規(guī)完全培養(yǎng)基為陰性對(duì)照組(negative)，每隔2 d更換一次培養(yǎng)液。分別在d 7、10時(shí)棄去培養(yǎng)液，PBS清洗2遍，冰上加入Western/IP裂解液，槍頭吹打裂解細(xì)胞，加入配制好的顯示底物。同時(shí)根據(jù)試劑盒說明書配制標(biāo)準(zhǔn)品孔，標(biāo)準(zhǔn)品的用量分別為0、4、8、16、24、32和40 μL?；靹蚝?7 ℃搖床孵育30 min后加入反應(yīng)終止液，測(cè)量405 nm處吸光度值，使用610 nm為校正波長。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品孔繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，將OD值換算成DEA酶活力單位。

1.2.5堿性磷酸酶及茜素紅S染色 將狀態(tài)良好的P3代細(xì)胞以1×105個(gè)/孔接種到6孔板中，待細(xì)胞融合至70%-80%時(shí)，加入0和1 μmol·L-1槲皮素的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基2 mL，設(shè)常規(guī)培養(yǎng)基為對(duì)照組，每3 d更換一次培養(yǎng)液。在d 14時(shí)棄去培養(yǎng)液，PBS清洗2遍，加入4%多聚甲醛固定30 min。PBS清洗2遍后按照BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒配置顯色液，每孔加入500 μL，避光孵育2 h后用去離子水清洗2遍后觀察。配制茜素紅S染色液：在0.2%的茜素紅S溶液中加入1% Tris，調(diào)節(jié)pH值至8.3。在d 21時(shí)按上述方法固定細(xì)胞后，加入配制好的茜素紅S染色液后室溫下孵育30 min后觀察。

1.2.6實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR) 按照上述同樣的方法分組在6孔板內(nèi)接種細(xì)胞，在d 14的時(shí)候用TRIzol試劑提取細(xì)胞中的總RNA，使用PrimeScriptTMRT Master Mix逆轉(zhuǎn)錄試劑盒從400 ng總RNA中制備cDNA。然后用TB Green?試劑盒配制成20 μL PCR反應(yīng)體系上機(jī)檢測(cè)。相對(duì)mRNA水平通過2-ΔΔCt方法定量計(jì)算，β-actin作為標(biāo)準(zhǔn)化基因。引物序列見Tab 1。

Tab 1 Primer sequence of qPCR

1.2.7hDPSCs在支架材料上的接種與檢測(cè) 將P3代細(xì)胞以1×106個(gè)接種到Bio-Oss?骨粉上，2 h后更換培養(yǎng)液，分別加入0和1 μmol·L-1槲皮素的培養(yǎng)液。培養(yǎng)3 d后，取少量支架復(fù)合物，用PBS清洗2次，4%多聚甲醛固定2 h，60%-100%乙醇梯度脫水，臨界點(diǎn)干燥，樣品表面噴金后掃描電鏡觀察。

1.2.8動(dòng)物模型制備與檢測(cè) 10只新西蘭兔術(shù)前30 min肌肉注射青霉素，術(shù)中使用3%戊巴比妥，以1 mL·kg-1耳緣靜脈全麻，備皮鋪巾消毒，沿顱骨中線切開，鈍性分離骨膜，暴露骨面。以矢狀縫、冠狀縫將顱骨分為4個(gè)區(qū)域，分別用8 mm環(huán)鉆制作圓形全層骨缺損，超聲骨刀修整邊緣。造模完成后將4個(gè)缺損分為4組：A組為含1 μmol·L-1槲皮素的支架復(fù)合物，B組為不含槲皮素的支架復(fù)合物，C組為普通完全培養(yǎng)液潤濕的Bio-Oss?骨粉，D組為空白組。將復(fù)合物隨機(jī)放入缺損中，術(shù)者對(duì)復(fù)合物內(nèi)容單盲，另一人記錄。分層縫合切口，局部涂抹紅霉素軟膏預(yù)防感染。術(shù)后3 d每天對(duì)創(chuàng)口碘伏消毒并肌注青霉素。術(shù)后4、8周處死，在顱骨缺損造模的位置外2 mm處截取，4%多聚甲醛固定，進(jìn)行Micro-CT檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 hDPSCs的流式鑒定通過流式細(xì)胞儀對(duì)hDPSCs進(jìn)行表面抗原的檢測(cè)，可見CD44(99.20%)、CD73(99.56%)陽性高表達(dá)，CD34(0.12%)、CD45(0.11%)陰性表達(dá)，符合人間充質(zhì)細(xì)胞特征，見Fig 1。

Fig 1 Cell surface markers of hDPSCs by flow cytometry

2.2 槲皮素對(duì)細(xì)胞增殖的影響在CCK-8檢測(cè)中，通過酶標(biāo)儀測(cè)得450 nm處的OD值。進(jìn)行換算后如Fig 2所示，與對(duì)照組相比1 μmol·L-1的槲皮素在d 3可引起hDPSCs明顯增殖，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。然而更高濃度100 μmol·L-1的槲皮素相比于對(duì)照組則出現(xiàn)了抑制作用(P<0.05)。

Fig 2 CCK-8 cell proliferation n=5)*P<0.05 vs control

2.3 成骨誘導(dǎo)后ALP定量檢測(cè)如Fig 3所示，通過在d 7和d 10時(shí)的ALP定量檢測(cè)可以發(fā)現(xiàn)，在這兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)加入成骨誘導(dǎo)液的各組較常規(guī)完全培養(yǎng)基(陰性對(duì)照組)有明顯升高(P<0.05)，說明成骨誘導(dǎo)是有效的。在d 10時(shí)，0.1和1 μmol·L-1槲皮素組與成骨誘導(dǎo)對(duì)照組和其他濃度組相比，堿性磷酸酶活性有了明顯提升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而這兩個(gè)濃度沒有差別(P>0.05)。

Fig 3 ALP quantitative analysis n=5) *P<0.05 vs control

2.4 堿性磷酸酶及茜素紅S染色經(jīng)過14 d成骨誘導(dǎo)， BCIP/NBT堿性磷酸酶試劑盒染色后，如Fig 4所示加和不加槲皮素成骨誘導(dǎo)組相比于普通培養(yǎng)液組顏色均有明顯加深，同時(shí)槲皮素組的顏色較成骨誘導(dǎo)組略深。在d 21的時(shí)候進(jìn)行了茜素紅染色。由Fig 5可見經(jīng)過成骨誘導(dǎo)之后，茜素紅染色呈現(xiàn)紅色，加入槲皮素組顏色較深。同時(shí)，通過顯微鏡可觀察到堿性磷酸酶水解BCIP形成的藍(lán)紫色的產(chǎn)物和鈣結(jié)節(jié)。見Fig 6。

Fig 4 ALP staining A：control; B:Ost; 4c:1 μmol·L-1 quercetin+Ost

Fig 5 Alizarin Red staining A:control; B:Ost; 5c:1 μmol·L-1 quercetin+Ost

Fig 6 Alkaline phosphatase staining and calcium nodulesA：ALP stain staining; B: Alizarin red staining

2.5 成骨基因的表達(dá)通過對(duì)14 d樣本的實(shí)時(shí)熒光定量PCR的檢測(cè)可以發(fā)現(xiàn)成骨誘導(dǎo)液組(Ost)組BMP2、Runx2、OPN和OCN等成骨相關(guān)基因的表達(dá)量高于對(duì)照組(P<0.05)，說明成骨誘導(dǎo)有效。加入1 μmol·L-1槲皮素后相較于Ost組，表達(dá)顯著提高 (P<0.05)。由此可以看出槲皮素在體外能夠有效的促進(jìn)成骨基因的表達(dá)，見Fig 7。

Fig 7 Relative expression of osteogenic related genes n=3)

2.6 支架材料復(fù)合物的檢測(cè)通過掃描電鏡，可以觀察到細(xì)胞在常規(guī)完全培養(yǎng)基(對(duì)照組)和含有槲皮素的培養(yǎng)基環(huán)境下，均能在骨粉上大量附著生長。見Fig 8。

Fig 8 The scaffold composites observed by SEM B：Bio-Oss?; C:cells

2.7 Micro-CT結(jié)果將得到的Micro-CT數(shù)據(jù)是由dataviewer校正方向后，用CTan打開圖像，選取圓形缺損區(qū)域?yàn)楦信d趣的區(qū)域(Region of interest, ROI)，計(jì)算區(qū)域的骨體積分?jǐn)?shù)(BV/TV)。通過圖像分析，可以看到4周時(shí)空白組(D組)如Fig 9A所示骨缺損區(qū)幾乎沒有明顯的新骨生成，F(xiàn)ig 9B顯示8周時(shí)在缺損的邊緣有少量新骨的形成；而加入了骨粉的A、B、C組如Fig 9C所示在4周時(shí)均可見新骨形成，8周時(shí)如Fig 9D所示可見大量的新生的骨組織。通過進(jìn)一步骨體積分?jǐn)?shù)的計(jì)算，可以發(fā)現(xiàn)本次實(shí)驗(yàn)中4周時(shí)含細(xì)胞的支架復(fù)合物組(AB組)相比純骨粉組(C組)BV/TV較高(P<0.05), 8周時(shí)BC兩組沒有明顯差別(P>0.05)。加入了1 μmol·L-1槲皮素培養(yǎng)的復(fù)合物組在4周和8周時(shí)對(duì)其他各組BV/TV均明顯升高(P<0.05)，表現(xiàn)出良好的促進(jìn)成骨的能力，見Tab 2。

Fig 9 Micro CT image reconstruction of rabbit calvarial defects

Tab 2 Bone volume fraction in calvarial defect area of rabbits n=5)

3 討論

在牙周治療的各種方法中，傳統(tǒng)的潔治、刮治及牙周手術(shù)等手段可以有效地消除病因，但如何重建已被破壞的牙周骨組織仍是難點(diǎn)[7]。Iwata等[8]學(xué)者指出目前治療手段牙周組織的再生量遠(yuǎn)不能滿足重度牙周炎患者牙周再生的需要。近年來再生醫(yī)學(xué)不斷發(fā)展，為牙周組織修復(fù)提供了一種創(chuàng)新的替代方法，通過組織工程與人類的自我修復(fù)能力相結(jié)合，修復(fù)組織缺損，并恢復(fù)其功能[9]。采用患者自身來源的干細(xì)胞作為種子細(xì)胞在體外進(jìn)行擴(kuò)增，然后與支架材料結(jié)合，同時(shí)加入一些生長因子或是信號(hào)分子，回植到患者缺損部位這一模式，成為解決牙周組織重建這一難題的一個(gè)發(fā)展方向[10]。牙髓間充質(zhì)細(xì)胞因其良好的增殖和分化的潛力，常常是口腔組織再生中首選的種子細(xì)胞。由于本研究牙髓來源為正畸拔牙，患者大多為年輕人，因此可以獲得大量年輕的hDPSCs，這樣可以克服由于細(xì)胞老化或系統(tǒng)性疾病引起的干細(xì)胞功能障礙[11]。槲皮素是一種常見的天然小分子活性物質(zhì)，主要來源于蜂膠中的黃酮類，具有多種生物學(xué)效應(yīng)，有較強(qiáng)的抗炎、抗氧化、清除氧自由基、抗菌、抗血栓、抗病毒、調(diào)節(jié)免疫的作用[12]。還有研究表明，槲皮素不僅能夠誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的凋亡、抑制破骨細(xì)胞對(duì)骨質(zhì)的吸收[13]，還能夠增強(qiáng)成骨細(xì)胞分化活性[14]。

本實(shí)驗(yàn)研究表明，較低濃度的槲皮素可以促進(jìn)牙髓間充質(zhì)細(xì)胞的增殖，較高濃度出現(xiàn)了抑制作用。綜合考慮槲皮素促進(jìn)hDPSCs增殖的最優(yōu)濃度1 μmol·L-1和堿性磷酸酶的活性定量檢測(cè)中的最優(yōu)濃度0.1和1 μmol·L-1，最終選擇加入1 μmol·L-1藥物再次進(jìn)行了體外培養(yǎng)。通過相關(guān)體外成骨檢測(cè)，包括堿性磷酸酶定性染色，茜素紅對(duì)鈣結(jié)節(jié)的染色，部分成骨相關(guān)的mRNA的表達(dá)(BMP2，Runx2，OPN，OCN)，發(fā)現(xiàn)槲皮素在體外成骨方面有著明顯的促進(jìn)作用。為了進(jìn)一步驗(yàn)證其在體內(nèi)的作用，將hDPSCs接種于Bio-Oss?骨粉支架上，通過掃描電鏡的觀察確認(rèn)支架材料上確實(shí)存在大量牙髓細(xì)胞，進(jìn)而使用該復(fù)合體修復(fù)兔顱骨臨界骨缺損。為了減少實(shí)驗(yàn)中因?yàn)殚纹に丶?xì)胞復(fù)合物放入量的差異而產(chǎn)生的誤差，本研究選擇了術(shù)者對(duì)復(fù)合物的成分單盲的方法，以期達(dá)到更加準(zhǔn)確的結(jié)果。根據(jù) Micro-CT結(jié)果表明，加入和不加槲皮素的兩組細(xì)胞復(fù)合物和單純骨粉組均有新骨形成，且加入槲皮素組形成的新骨更多；空白組新骨形成較少。因此可以認(rèn)為槲皮素也可以有效促進(jìn)牙髓間充質(zhì)細(xì)胞的體外成骨能力。有研究表明，雖然異種來源的細(xì)胞在移植后很可能會(huì)被宿主所排斥，但異種牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞在一定程度上能夠抑制受體宿主的免疫反應(yīng)[15]。本研究中人類來源的間充質(zhì)細(xì)胞作為異種細(xì)胞被用于移植到免疫功能正常的動(dòng)物身上，通過對(duì)比加入細(xì)胞的復(fù)合物組和單純骨粉組結(jié)果，顯示良好的成骨效果，沒有出現(xiàn)因明顯的免疫排斥反應(yīng)而導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)、組織壞死和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡等嚴(yán)重后果。這和本課題組前期研究的結(jié)果也是一致的[16]。

本研究旨在探討槲皮素對(duì)體外培養(yǎng)的人牙髓間充質(zhì)細(xì)胞的增殖和成骨分化的影響，及使用組織工程的方法，在動(dòng)物體內(nèi)將槲皮素作為藥物刺激種子細(xì)胞增殖與分化，研究促進(jìn)成骨的可能性。在此研究基礎(chǔ)上，后期還會(huì)進(jìn)一步研究，構(gòu)建槲皮素的原位液晶緩釋遞藥系統(tǒng)[17]，實(shí)現(xiàn)對(duì)牙周局部用藥，控制牙周炎癥與促進(jìn)牙槽骨的再生，為臨床牙周炎治療提供新思路。